摘要:摘要:【目的】八氢番茄红素脱氢酶PDS 为真核膜结合蛋白，我们通过更换不同的表达策略，探索在大肠杆菌中表达真核膜结合蛋白的方式。【方法】利用ＲACE的方法克隆盐藻PDS的全长cDNA序列。利用原核表达载体pET-28a构建pET-28a-PDS表达载体;使用PLtac启动子替换T7 启动子构建pET-PLtac-PDS表达载体;合成Mistic序列融合入pET-28a中构建了pET-Mistic-PDS融合表达载体。分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。【结果】获得了盐藻PDS基因的全长cDNA序列2237 bp，开放阅读框为1749 bp，共编码582 个氨基酸(NCBI登录号为GQ923693.1)。利用pET-28a-PDS和pET-PLtac-PDS表达的PDS蛋白表达量低，并以包涵体形式存在;利用pET-Mistic-PDS载体表达的PDS蛋白表达量明显提高，且大部分以可溶蛋白形式存在，具有脱氢酶活性。【结论】实验结果表明Mistic作为促溶标签能促进膜蛋白的正确折叠，提高蛋白的可溶性。蛋白酶活测定结果证明了Mistic的融合可以保持蛋白的天然活性。

摘要:摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株，寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株，经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后，利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基，编码382个氨基酸，氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽，77个氨基酸残基构成的前导肽，C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员，并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时，在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力，其反应最适条件为温度70℃，pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。

摘要:[目的]原核表达某些需辅因子的外源蛋白时往往酶活偏低，为提高酶活和减少外加辅因子的成本，我们尝试在大肠杆菌中表达外源过氧化氢-过氧化物酶的同时提高大肠杆菌中与该酶辅因子相关的合成代谢。[方法]本研究克隆了中度嗜盐菌Halomonas elongata DSM2581的过氧化氢-过氧化物酶CAT-POD（catalase-peroxidase）编码基因katG的ORF，构建原核表达载体pET28a-katG，实现了CAT-POD在大肠杆菌中的重组表达。由于CAT-POD活性依赖其活性中心血红素，而血卟啉是血红素的骨架，通过构建原核表达载体pUC19-tac-hemA，将编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的hemA基因在大肠杆菌中过量表达，提高卟啉的含量，从而提高重组蛋白CAT-POD的酶活。[结果]最终的CAT酶活达到了377 U/mL，为对照组的7.5倍。[结论]本研究为工业生产高活性CAT-POD提供了有效的方案，也为体外重组表达含辅因子的蛋白提供可借鉴的思路。