摘要:【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2, PCV-2)和3型(porcine circovirus 3, PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1, PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2, PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3, PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列，分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针，通过引物浓度和反应条件优化，方法特异性、敏感性和稳定性分析，以及临床样本和猪源产制品的检测验证，建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示，多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生，与其他病原体检测无交叉反应，表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示，体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%，批间均≥98.3%，表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65-26.27拷贝/μL之间，与荧光PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用，检出2种及以上混合感染样品39份，其中5份样本同步检出5种病原体阳性；对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证，均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证，2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%-100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断，以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。

摘要:【目的】 建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)多目标检测方法,同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。【方法】 本研究根据6种病原体基因的保守序列,设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件,以及方法特异性、重复性及灵敏度分析,使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测,并对结果进行对比验证。【结果】 质谱结果显示,6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰值,其他常见猪病病原在质谱图像中均未出现干扰,表明该体系的特异性良好。体系中每种病毒在高、中、低浓度时的批内阳性符合率均为100%,批间符合率均 ≥ 96.7%,表明该体系的重复性良好。灵敏度分析结果显示,体系中各病毒最低检测限在6.73–21.25拷贝/μL范围。应用MALDI-TOF MS多重检测方法对124份组织、饲料及猪肉样品进行检测,检出PRRSV阳性样本9份,SIV阳性样本3份(其中SIV-H1阳性样本2份,SIV-H3阳性样本1份)。将以上结果与荧光定量PCR方法分析结果进行对比验证,2种方法对各病原体检测结果的总符合率可达到99.2%–100%。【结论】 本研究建立的6种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测方法为相关疫病监测和快速鉴别,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。