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    • 生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建

      2001, 41(2).

      关键词:重组大肠杆菌 面包酵母 种间耦合ATP再生系统 谷胱甘肽 生物合成 构建
      摘要 (1254)HTML (0)PDF 0.00 Byte (1552)收藏

      摘要:利用重组大肠杆菌Ⅱ 1中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH J7中的ATP生物合成酶系 ,构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加 1mmol/LAMP和 0 0 5mmol/LNADH ,即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度 ,可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为 40 0mmol/L时 ,系统内GSH浓度达到 1 0 4mmol/L(3 2 g/L)。Mg2 +缺乏时 ,耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2 +与ATP形成螯合物 ,可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2 +,反应 6h时GSH浓度达到 1 4 3mmol/L(4 4g/L)。

    • 具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程

      2001, 41(1).

      关键词:谷胱甘肽, 重组大肠杆菌, 构建, 生物合成, 反应机理
      摘要 (1147)HTML (0)PDF 0.00 Byte (2351)收藏

      摘要:以野生型大肠杆菌E.coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coliⅡ|1。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E.coliⅡ|1细胞控制的GSH合成反应机理:由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSHⅡ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3 h后,GSH产量达到230mmol/L(约71g/L)。

    • 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用

      2000, 40(5).

      关键词:丙酮酸, 光滑球拟酵母, 硫胺素, 烟酸, 培养
      摘要 (1110)HTML (0)PDF 0.00 Byte (2836)收藏

      摘要:研究了烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对一株光滑球拟酵母(%Torulopsis glabrata%) WSH|IP303以葡萄糖为碳源、以氯化铵为唯一氮源生产丙酮酸的影响。利用正交试验方法,确证了硫胺素是影响WSH|IP303生产丙酮酸的最重要因素。在硫胺素浓度一定(0.01~0.015mg/L)的前提下,提高烟酸浓度有助于加快耗糖速度。当烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素的浓度分别为8、0.015、0.4、0.04和01mg/L时,摇瓶发酵48h,丙酮酸产量和产率可分别达到52.4g/L和0525g/g。采用优化的维生素组合方式,进行2.5L罐分批发酵,在初糖浓度120g/L的条件下发酵57.5h,丙酮酸产量和产率分别达到69.4g/L和0593g/g,分别比摇瓶培养的最好结果提高了32.%和13%。

    • 谷胱甘肽在乳酸乳球菌抵抗氧胁迫中的保护作用

      2006, 46(3).

      关键词:GSH;乳酸乳球菌;氧胁迫
      摘要 (967)HTML (0)PDF 0.00 Byte (1701)收藏

      摘要:为研究谷胱甘肽(GSH)在乳酸乳球菌NZ9000抗氧胁迫中的生理作用,以能够生物合成GSH的重组菌NZ9000(pNZ3203)为实验菌株进行了研究。结果表明,在较高H2O2胁迫剂量(150mmol/L H2O 2,15min)下,前培养3h、5h和7h(即乳酸链球菌素诱导1h、3h和5h)时的重组菌细胞的存活率分别是处于相应生长时期对照菌NZ9000 (pNZ8148)的1.8±0.1倍、2.6±0.1倍和2.9±0.3倍。表明GSH可以提高宿主菌NZ9000对H2O2所引发氧胁迫的抗性。GSH还可以提高宿主菌NZ9000对其它化学物质(如超氧阴离子自由基生成剂——甲萘醌)所引发氧胁迫的抗性。这表现在经20mmol/L甲萘醌处理60min后,前培养5h(即乳酸链球菌素诱导3h)时重组菌细胞的存活率是对照菌的6.2±0.1倍。由此表明,通过代谢工程手段在菌株NZ9000中引入GSH合成能力,可以提高宿主菌对氧胁迫的抗性。

    • 光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢

      2005, 45(4).

      关键词:光滑球拟酵母, 丙酮酸生产, 糖酵解, F1ATPase, 新霉素抗性
      摘要 (965)HTML (0)PDF 215.91 K (2160)收藏

      摘要:为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的生产强度,在能量代谢分析的基础上提出了降低ATP合成酶活性、但不影响NADH氧化的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得一株新霉素抗性突变株N07,该菌株F1ATPase活性降低65%、丙酮酸产量高于48g/L且单位细胞消耗葡萄糖能力提高38%。添加双环己基碳二亚胺(DCCD)、叠氮钠(NaN3)、新霉素显著降低出发株F1ATPase活性但不影响突变株F1ATPase活性。突变菌株胞内ATP含量下降237%导致生长速率和最终菌体浓度(为出发菌株的76%)均低于出发菌株,但葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高34%和42.9%,发酵周期缩短12h。进一步研究发现,突变株糖酵解途径中关键酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油醛激酶的活性提高了63.7%、28.8%和14.4%,电子传递链关键酶活性提高10%。结果表明降低真核微生物F1ATPase活性有效地提高了糖酵解关键酶活性而加速葡萄糖代谢。

    • 在乳酸乳球菌中表达外源谷氨酰胺转胺酶显著改善宿主菌好氧生长性能

      2005, 45(4).

      关键词:乳酸乳球菌,谷氨酰胺转胺酶,生长性能
      摘要 (950)HTML (0)PDF 263.81 K (1878)收藏

      摘要:为改善乳酸乳球菌的生长性能,以轮枝链霉菌染色体DNA为模板,扩增得到编码谷氨酰胺转胺酶成熟酶的基因mtg,将其克隆到质粒pNZ8148中,电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得乳酸乳球菌NZ9000 (pFL001)(重组菌)。在不控制pH条件下,重组菌的胞外pH显著高于对照菌NZ9000 (pNZ8148);前者的最高生物量可达4.13g/L,而后者只有0.34g/L。在控制pH为6.5±0.1的条件下,重组菌最高生物量为4.73g/L,对葡萄糖的菌体最高平均得率为711g/mol,而相同条件下对照菌最高生物量为2.6g/L,对葡萄糖的菌体最高平均得率为27.3g/mol。由此表明,重组菌与对照菌相比,好氧生长性能得到显著改善。可能的原因是mtg的活性表达升高了重组菌的胞内pH,原先用于泵出胞内H+所需的部分能量可能因此得到节省,这样相应增加了用于细胞生长的能量。

    • 一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略

      2005, 45(1).

      关键词:光滑球拟酵母,丙酮酸,丙酮酸脱羧酶,乙酰辅酶A合成酶,育种策略
      摘要 (1022)HTML (0)PDF 203.44 K (2434)收藏

      摘要:为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平,在途径分析的基础上提出了一种组成型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得1株乙酸需求型突变株CCTCC M202019,在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株21%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCC M202019中丙酮酸代谢相关酶的活性发现:(1)丙酮酸脱羧酶活性降低了40%;(2)外加乙酸与否的条件下,乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了103.5%和57.4%;(3)添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。在含有乙酸的培养基中突变株细胞干重比出发株高21.7%,可能是因为乙酰辅酶A合成酶活性的提高,补充了因丙酮酸脱羧酶活性降低而引起的胞质乙酰辅酶A短缺。在7L罐中含有6g/L乙酸钠的培养基中发酵62h,丙酮酸产量达到68.7g/L,对葡萄糖的产率为0.651g/g。

    • 降低光滑球拟酵母电子传递链活性加速丙酮酸合成

      2004, 44(6).

      关键词:光滑球拟酵母, 呼吸缺陷型, 电子传递链, 细胞色素, 线粒体复合体,丙酮酸
      摘要 (901)HTML (0)PDF 0.00 Byte (2171)收藏

      摘要:光滑球拟酵母CCTCC M202019经溴化乙锭诱变,挑选假阳性呼吸缺陷型菌株共40株。对其中7株丙酮酸产量提高的突变株进行发酵性底物(葡萄糖)和非发酵性底物(甘油、乙酸)的利用能力测试,鉴定得到3株呼吸缺陷型突变株RD16、RD17和RD18。相对于出发菌株,呼吸缺陷型突变株生长速率下降,最终菌体浓度降低21%~29%,胞内ATP含量下降15%~21%,但单位细胞耗葡萄糖能力和单位细胞产丙酮酸能力分别提高了20.7%~30.7%和30.7%~555%。进一步研究发现,呼吸缺陷型突变株线粒体复合体Ⅰ、Ⅰ+Ⅲ、Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ的活性分别下降了34%~41%、38.6%~52.6%、21%~25%、150%~630%,表明线粒体电子传递链氧化NADH的功能受到抑制。为使酵解产生的NADH正常氧化,在RD18菌株的对数生长期流加2.1mmol/L外源电子受体乙醛。发现细胞合成丙酮酸能力提高21.6%,且葡萄糖消耗速度明显加快,发酵周期缩短14h。结果表明适当削弱能量代谢能够提高真核微生物中心代谢途径的速度。

    • 影响青霉产聚乙烯醇降解酶营养因素的研究

      2004, 44(5).

      关键词:青霉, 聚乙烯醇, 降解酶, 酵母粉, 苏氨酸, 影响
      摘要 (1052)HTML (0)PDF 0.00 Byte (1674)收藏

      摘要:在培养基中没有聚乙烯醇(PVA)及有PVA存在的情况下,考察了酵母粉、20种氨基酸和部分维生素对一株青霉WSH02.21产PVA降解酶的影响。当培养基中无PVA时,以酵母粉为氮源时,该菌株可产生38.9 U/L的PVA降解酶;加入PVA后,酶活提高了3.3倍,表明该菌株所产的PVA降解酶是可诱导的。进一步研究发现,不管培养基中是否存在PVA,若没有苏氨酸存在,该菌株正常生长,但不能产生PVA降解酶,表明苏氨酸是该菌株产生PVA降解酶所必需的,而非生长所必需。在苏氨酸添加浓度为10mg/L到20mg/L的范围内,该菌株所产PVA降解酶的酶活随着培养基中苏氨酸浓度的增大而呈现上升趋势。

    • 重组大肠杆菌生产谷胱甘肽发酵条件的研究

      1999, 39(4).

      关键词:谷胱甘肽 重组大肠杆菌 发酵条件
      摘要 (1064)HTML (0)PDF 0.00 Byte (1262)收藏

      摘要:研究了重组E.Coli产GSH的发酵条件,重点考察了添加酵母膏、前体氨基酸和ATP的影响。结果发现,前体氨基酸和ATP均能促进胞内GSH的积累,若在发酵0h和12h分别加入20g/LATP和9mmol/L前体氨基酸,则细胞干重和胞内GSH含量可分别比对照提高24%和14倍。应用正交试验得出的针对细胞干重和GSH总量的最佳组合,最大细胞干重和GSH总量比原试验中的最好结果分别提高了10%和26%。在分析了该菌对葡萄糖利用情况的基础上,对该菌进行了指数流加培养,25h细胞干重与发酵液内GSH总量分别达到80g/L和880mg/L,比摇瓶最好结果分别提高了83和46倍。

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