摘要:

摘要:摘要：【目的】本文对苏云金芽胞杆菌科默尔亚种15A3菌株（Bacillus thuringensis subsp.colmeri 15A3，简称Bt 15A3）几丁质酶B（chitinase B，简称ChiB）的特性及其杀虫抑真菌作用作了初步研究。【方法】将大肠杆菌（Escherichia coli）中表达的Bt 15A3菌株的ChiB，经过硫酸铵沉淀、透析、Sephadex G-200凝胶层析，最终得到初步纯化的几丁质酶。利用酶谱方法确定分子量，并且对2种分子量的酶蛋白进行了质谱鉴定。对各种金属离子对ChiB酶活的影响、最适反应温度及pH、温度及pH稳定性等理化特性进行研究，并且测定了ChiB抑制真菌孢子萌发的活性和对甜菜夜蛾和棉铃虫的杀虫增效作用。【结果】ChiB分子量约为70 kDa。同时证明检测到的64 kDa蛋白为70 kDa蛋白C端的降解产物。ChiB最适作用温度为60 ℃，最适pH值为5，在温度20 ℃～60 ℃和pH 4-8的范围内均有良好的稳定性。供试金属离子中Fe3+对ChiB的酶活有促进作用，Zn2+，Ag+有抑制作用。ChiB可抑制产黄青霉等真菌孢子的萌发，半抑制浓度（median effective inhibitory concentration，IC50）约为4 μg/mL。该酶可以分别降低Bt晶体蛋白对甜菜夜蛾和棉铃虫的半致死浓度（median lethal concentration，LC50）26 %和30 %。【结论】Bt科默尔亚种的几丁质酶不但具有较稳定的理化性质，而且具有抑制真菌生长及明显的杀虫增效作用。

摘要:摘要：【目的】地衣芽孢杆菌MY75菌株的几丁质酶基因的异源表达并对表达蛋白的特性进行研究。【方法】制备MY75菌株培养上清粗蛋白，利用酶谱分析确定具有几丁质酶活的蛋白分子量。将该蛋白进行飞行时间质谱分析，确定其部分氨基酸序列，设计PCR引物对MY75菌株的几丁质酶基因进行克隆及异源表达。对表达蛋白的最适反应温度及pH，温度耐受性及金属离子对酶活力的影响等特性进行了研究，并测定了表达蛋白对真菌孢子萌发的抑制活性和对甜菜夜蛾幼虫的杀虫增效作用。【结果】酶谱分析证明MY75菌株培养上清液中仅含有一种55 kDa的几丁质酶。将该编码基因chiMY克隆及序列分析后发现，基因长度为1797 bp，编码599个氨基酸。在大肠杆菌中异源表达的几丁质酶ChiMY蛋白的分子量为67 kDa。质谱分析证明，55 kDa蛋白与67 kDa蛋白序列相同。ChiMY最适pH和最适温度分别为7.0和50 °C，为中性几丁质酶。Li+, Na+, 和Mg2+离子对表达蛋白的酶活力具有促进作用，Mn2+, Cr3+, Zn2+和Ag+离子则能显著抑制酶活力， Cu2+ 和Fe3+离子完全抑制酶活性。生物测定的结果显示，异源表达的MY75几丁质酶能够抑制小麦赤霉及黑曲霉的孢子萌发，并且对苏云金芽孢杆菌的杀虫活力具有增效作用。【结论】地衣芽孢杆菌MY75菌株中仅有一种55 kDa几丁质酶，其编码基因能够在大肠杆菌中大量表达，表达蛋白分子量与野生型蛋白之间有显著差异 ，由此证明MY75菌株中存在着几丁质酶的剪切加工过程。明确了地衣芽孢杆菌几丁质酶ChiMY具有抑制真菌活性及杀虫增效作用。上述全部研究结论在国内首次报道。

摘要:以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。

摘要:以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。