摘要:摘要：【目的】本文旨在探索SEF14菌毛特异性表达于D-群沙门氏菌，特别是肠炎沙门氏菌以及都伯林沙门氏菌的原因。【方法】应用PCR扩增以及序列测定检测了18株鸡白痢沙门氏菌，11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌标准株中sefA，sefD和sefR基因序列，并分析比对其序列变异。【结果】以11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌染色体DNA为模板能成功扩增sefA，sefD以及sefR基因；从18株鸡白痢沙门氏菌中均能成功扩增sefA基因，但只有分离于1980年之前的7株分离菌能成功扩增sefD和sefR基因，而另11株1980年后分离菌PCR扩增sefD和sefR基因却无任何产物。比对PCR扩增产物测序结果发现，11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中sefA，sefD以及sefR基因序列和已发表的序列(GenBank登录号为L11008, U07129 和AF233854) 100%同源；7株鸡白痢沙门氏菌sefD基因测序结果表明，在196位点处发生碱基缺失，造成移码突变，提前于氨基酸残基71位点处产生终止密码子。优化菌毛表达条件，体外抽提和纯化菌毛并进一步试验证明：肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌体外能很好表达SEF14菌毛，但鸡白痢沙门氏菌在相同培养条件下却无任何表达迹象。【结论】SEF14菌毛操纵子亚单位基因sefA，sefD以及调节基因sefR在不同沙门氏菌中的变异情况可能是SEF14菌毛局限性表达的原因之一。

摘要:由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个Xoo Tn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

摘要:由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个Xoo Tn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

摘要:摘要:【目的】异源表达尼可霉素生物合成基因簇，为尼可霉素核苷和肽基缩合机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素的组合生物合成奠定基础。【方法】以含有尼可霉素生物合成基因簇的pNIK 为出发质粒，通过PCR-targeting 的方法，将基因簇中sanG和sanF的启动子替换为组成型hrdB启动子，构建重组质粒pNIKm。通过接合转移的方法分别将pNIK和pNIKm导入天蓝色链霉菌M1146中，获得异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm，并通过RT-PCR检测基因簇的表达情况。最后通过抗菌活性实验和产物的分离鉴定，比较M1146-NIK和M1146-NIKm的抗菌活性和尼可霉素的产生情况。【结果】pNIK和pNIKm在异源宿主天蓝色链霉菌M1146成功表达; M1146-NIK和M1146-NIKm均有明显的抗菌活性; M1146-NIK和M1146-NIKm均能产生少量的尼可霉素X、Z和假尼可霉素Z;M1146-NIK大量积累尿苷，而M1146-NIKm大量积累尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型苏氨酸。【结论】尼可霉素生物合成基因簇成功异源表达，并分离鉴定了尼可霉素产物及其生物合成中间体。本研究将为尼可霉素核苷和肽基缩合的酶学机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素组合合成新型杂合抗生素提供理论依据和指导。

摘要:利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌F18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码F18ab和F18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b(+),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。然后将克隆的重组载体DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3),构建和筛选出分别含F18ab和F18ac完整fed基因的重组菌,经过IPTG诱导表达,在电镜下观察到上述两种重组菌能分别大量表达F18ab和F18ac菌毛。用热抽提法提纯其诱导表达的F18ab和F18ac菌毛,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色发现提纯后菌毛获单一分子量约为15kDa蛋白条带,免疫家兔后制备出高效价的兔抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外诱导表达的F18ab和F18ac菌毛具有和野生F18菌毛相同的抗原性。用表达F18ab和F18ac菌毛的上述2株重组菌分别进行小肠上皮细胞体外吸附试验和吸附抑制试验,结果表明:2株重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而用表达F18ab和F18ac重组菌提纯的菌毛制备出兔抗血清都能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对易感仔猪小肠上皮细脃的吸附结合。

摘要:利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌F18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码F18ab和F18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b(+),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。然后将克隆的重组载体DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3),构建和筛选出分别含F18ab和F18ac完整fed基因的重组菌,经过IPTG诱导表达,在电镜下观察到上述两种重组菌能分别大量表达F18ab和F18ac菌毛。用热抽提法提纯其诱导表达的F18ab和F18ac菌毛,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色发现提纯后菌毛获单一分子量约为15kDa蛋白条带,免疫家兔后制备出高效价的兔抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外诱导表达的F18ab和F18ac菌毛具有和野生F18菌毛相同的抗原性。用表达F18ab和F18ac菌毛的上述2株重组菌分别进行小肠上皮细胞体外吸附试验和吸附抑制试验,结果表明:2株重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而用表达F18ab和F18ac重组菌提纯的菌毛制备出兔抗血清都能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对易感仔猪小肠上皮细脃的吸附结合。

摘要:摘要:【目的】对一株深海热液环境来源的多环芳烃(PAHs) 降解菌进行系统发育分析并对其降解特性和降解机制进行研究。【方法】对16S rRNA 基因进行扩增和测序，进行基于16S rRNA 基因序列的系统发育分析;利用GC-MS 测定其对PAHs 的降解率;通过构建基因组Fosmid 文库，克隆PAHs 降解基因簇;并利用RTPCR和qPCR 研究关键降解酶基因在不同PAHs 诱导下的表达情况。【结果】从西南太平洋劳盆地热液沉积物中分离到一株PAHs 降解菌株TVG9-Ⅶ，系统发育分析结果表明，该菌株属于

摘要:摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽，为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统，在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后，体外酶切反应切除前导肽，利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况，并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124，其核心肽脱去了4分子水，并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。

摘要:目的 从泉州湾2种红树林的根际土壤中分离并鉴定放线菌，进行抗真菌活性初筛以获取目标菌株，并对链霉菌属(Streptomyces) W444的次级代谢产物进行分离与鉴定。方法 从泉州湾洛阳江采集2种不同红树林植物的根际土壤样品，采用稀释涂布法对土样中的放线菌进行分离，并构建16S rRNA基因系统发育树。采用琼脂打孔扩散法进行抗真菌活性筛选，对获取的目标菌株Streptomyces sp. W444进行放大规模发酵，并对其次级代谢产物进行了分离与鉴定。根据生物合成基因簇定位和分析，推导星孢菌素的生物合成途径。结果 从根际土样中分离得到56株放线菌，分布于6目6科8属，其中链霉菌属和小单孢菌属为优势菌，占比分别为41.0%和33.9%。通过抗真菌筛选获得抑菌活性较好的菌株Streptomyces sp. W444，并从中分离鉴定了3个吲哚类化合物：staurosporine、K252c和streptochlorin。此外，还从菌株Streptomyces sp. W444基因组中定位了星孢菌素生物合成基因簇，并对其生物合成途径进行了推导。结论 泉州湾红树林根际土壤中的放线菌具有多样性，并蕴含着丰富的潜在天然产物资源，从菌株Streptomyces sp. W444中分离鉴定了吲哚咔唑类生物碱staurosporine、K252c和streptochlorin，这为研究泉州湾红树林可培养放线菌的多样性和次级代谢产物研究提供了坚实的基础。

摘要:摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器，对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌，并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析，发展到通过基因组/元基因组技术，直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇，进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明，瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂，其中涉及到大量不同种类的微生物、酶及基因/基因簇，随着新分析技术的建立和完善，对这些微生物、酶和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述报道了近期有关该方向的研究进展。