摘要:原核生物细胞能量和物质代谢的途径是一个很复杂的网络, 改变代谢途径中的基因会对能量和物质流产生怎样的影响, 仍然不是很清楚。以往的文献和研究已经将大肠杆菌的腺嘌呤核苷酸补救合成途径研究的很透彻。使用HPLC对删除了add基因的大肠杆菌细胞内腺苷类核苷酸分析表明, 在腺嘌呤核苷酸补救途径中单一基因的途径操作不能有效改变腺嘌呤类核苷酸的代谢流向。实验中通过删除大肠杆菌JM83株中的add基因(编码腺苷脱氨酶[EC:3.5.4.4][1, 2]), deoD基因(编码嘌呤核苷磷酸酶[EC:2.4.2.1][3, 4]), amn基因(编码AMP核苷酶 [EC:3.2.2.4][5])并引入外源ado1基因(来自酵母编码腺苷激酶[EC:2.7.1.20][6,7,8]), 构建了菌株J991+ (add-, deoD-, amn-, ado1+, JM83), 将其在含腺苷的LB培养基培养, 使用HPLC分析其胞内腺苷类能量物质发现, ATP, ADP, AMP胞内含量都有所增加, 分别都比对照JM83菌株提高一倍左右, 大大加强了腺苷转化AMP的代谢流量, 实现了改变物质代谢流向并使ATP积累的目的。该菌种实现了高产ATP代谢通路的构建, 为下游生物工程发酵提供了较野生菌更高效的菌种, 有望通过发酵工程优化培养, 大幅提高ATP产量。同时, “尝试改变AMP的浓度而非直接针对ATP调节代谢途径, 达到ATP积累的目”这一思路为同类研究提供参考。最后也表明在腺嘌呤核苷酸补救代谢途径中, 为达到物质代谢流改变的目的, 多基因联合操作较之单基因敲除更为有效。

摘要:摘要：【目的】旨在揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo) 环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）信号蛋白VieAxoo的生物学功能。【方法】本研究通过标记置换法对vieAxoo基因(PXO_04753)进行了缺失突变研究，采用表性测定进行了部分功能鉴定。【结果】从野生型菌株PXO99A中克隆的vieAxoo基因序列与其它病原黄单胞菌的同源序列高度保守。VieAxoo具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶（PDE）EAL结构域和磷酸信号识别受体REC结构域

摘要:[目的]在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。[方法]通过Exo Ⅲ介导的不依赖于连接酶的克隆策略，在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点，成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件，并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域，形成筛选标记基因再循环载体。[结果]构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体，以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。[结论]成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。

摘要:[目的] 分析MpigE的缺失在转录水平对红曲色素产生的影响。[方法] 对实验室保存的野生型紫色红曲霉（Monascus purpureus） Mp-21和△MpigE菌株进行高通量转录组测序、注释、表达差异基因功能富集分析和基因通路富集分析，在转录水平揭示MpigE缺失后红曲霉色素产量变化的原因。[结果] 通过RNA-Seq测序，每个样品获得7.5-8.5 Gb的原始数据，经过拼接后得到7219个转录本（Unigenes），其中成功注释的为5692个。差异基因表达富集分析发现基因缺失菌株△MpigE相较于野生型菌株Mp-21上调差异基因达到199个，下调差异基因为293个。[结论] MpigE的缺失能够促进红曲霉中中央碳代谢和乙酰辅酶A代谢相关基因的表达以此影响色素生物合成。

摘要:[目的]构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点，同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。[方法]利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的loxP位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块；通过重组连接各片段，构建pCLHN-TRP和pCLHN-URA质粒。在此基础上利用同尾酶实现多种蛋白表位标签的单个或串联重复插入，获得一系列蛋白表位标记质粒。最后，以ATG1、COX4和NHX1为例验证本质粒系列的性能。[结果]在本项工作中，我们共构建2种基因敲除用质粒和17种表位标记用质粒（涵盖1-8 FLAG、1-12 V5、3-9 HA、2-8 MYC、GFP和mCherry）。在几个靶基因上的应用证实了本套质粒的实用性。尤其值得指出的是，通过组合采用不同重复度的串联表位标签，在同一张膜上同时检测表达差异极大的不同蛋白而不使高表达蛋白信号饱和成为可能。[结论]本文所构建的pCLHN质粒系列是对现有酵母质粒工具的有益补充。

摘要:作为生物体必需的营养元素之一，磷在物质代谢、信号传导和能量储存中起着关键作用。【目的】研究丝状真菌Podospora anserina中调控磷酸盐代谢相关转录因子的作用，可进一步阐明真核微生物中磷元素吸收的调控机制。【方法】利用同源重组的方法定点敲除P. anserina中2个磷代谢相关转录因子PaPho1和PaPho2，遗传杂交构建双重突变体ΔPaPho1ΔPaPho2；通过表型分析、无机磷含量测定和酸性磷酸酶活性测定分析各突变菌株的变化；利用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析磷代谢相关基因的表达情况。【结果】在无机磷作为唯一磷来源的培养基上，ΔPaPho1ΔPaPho2无法生长；在添加有机磷的培养基中，ΔPaPho1ΔPaPho2和野生型菌株生长无显著性差异。在同时添加有机磷和无机磷的培养基中，ΔPaPho1ΔPaPho2的无机磷含量和酸性磷酸酶活性比野生型菌株的分别下降了25.0%和61.9%，ΔPaPho1ΔPaPho2中无机磷酸盐转运蛋白基因的表达水平显著降低。【结论】在P. anserina中，PaPho1和PaPho2作为调控磷酸盐代谢信号通路转录因子，对无机磷的吸收起到关键作用，但并不参与有机磷的代谢调控。该研究可为阐释丝状真菌P. anserina对无机磷吸收的调控机制提供参考。

摘要:[目的]构建蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）ccpA缺失菌株，并初步探索ccpA基因对其碳代谢及氨肽酶生产的影响。[方法]利用温敏型质粒pKSV7构建蜡样芽胞杆菌CZ ccpA基因缺失突变株CZΔccpA，通过回补菌株对敲除株表型进行验证；不同碳源发酵对比菌株碳代谢的变化，进行氨肽酶发酵优化。[结果]成功构建ccpA缺失菌株CZΔccpA与回补菌株CZ1，三株菌在LB培养基中生长无差异；在柠檬酸钠以及甘露低聚糖为碳源时，菌株的代谢产生明显变化；以D-木糖为单一碳源时，氨肽酶的产量提高48.25%。[结论]CZccpA基因对柠檬酸钠、甘露低聚糖、D-木糖为单一碳源时的代谢可能具有调控作用，ccpA基因缺失可以提高蜡样芽胞杆菌CZ的氨肽酶产量。

摘要:入侵相关基因（invasion-associated locus B，ialB）的同源基因在布鲁氏菌所属的根瘤菌目中是广泛保守的，但其在布鲁氏菌中的功能研究几乎为空白。根据有限的报道资料，猜测ialB的功能可能与布鲁氏菌入侵细胞以及适应胞内环境胁迫有关。【目的】探究ialB在布鲁氏菌中的生物学功能，揭示其在布鲁氏菌黏附和入侵细胞以及胞内存活中的作用。【方法】以猪种布鲁氏菌S2株为亲本，运用同源重组的方法构建布鲁氏菌ialB缺失株ΔialB，并通过表达质粒转化的方法构建其回补株CΔialB，比较3种菌株的生长特性、对体外应激的敏感性；通过扫描电镜观察ialB缺失对布鲁氏菌形态的影响，通过实时荧光定量PCR检测3种菌株极性延长相关基因的表达；通过免疫荧光和平板计数的方法分析ialB缺失对布鲁氏菌黏附、入侵RAW264.7细胞以及胞内存活的影响。【结果】成功构建了菌株ΔialB和CΔialB；ΔialB与布鲁氏菌S2株相比，生长受限，活力降低，在酸应激、高渗应激、低渗应激、多黏菌素B应激条件下存活率降低，在氧化应激条件下存活率上升；而且，ΔialB的菌体形态发生改变，菌体变短，直径增加，极性延长相关基因mRNA水平的表达下调；此外，ialB缺失不影响布鲁氏菌黏附、入侵RAW264.7细胞的能力，但显著降低了布鲁氏菌胞内存活能力。【结论】入侵相关基因ialB在布鲁氏菌中具有调节细胞活性和菌体正常生长的功能，对布鲁氏菌抵抗外界环境刺激和在宿主细胞内的增殖具有重要作用。

摘要:[目的]调查肌醇、唾液酸以及岩藻糖代谢途径在嗜水气单胞菌感染宿主过程中对细菌致病性的影响。[方法]采用同源重组技术分别缺失嗜水气单胞菌NJ-35株的肌醇代谢相关基因iolC、唾液酸代谢相关基因nanA和岩藻糖代谢相关基因fucK，测定各缺失株对斑马鱼的半数致死量（LD50）；将野生株与缺失株共感染鲫鱼，统计野生株和缺失株在不同组织中的细菌载量。[结果]各代谢相关基因的缺失均成功阻断了菌株对相应底物的降解能力。iolC的缺失导致菌株对斑马鱼的LD50升高近12倍，而nanA和fucK的缺失对LD50没有明显影响。野生株与iolC缺失株共感染鲫鱼，肝脏、脾脏和肾脏中野生株的载量显著高于缺失株，表现出明显的生长优势；nanA和fucK缺失株与野生株共感染鲫鱼，野生株和缺失株载量在各组织中均无明显差异。[结论]肌醇代谢途径在嗜水气单胞菌感染致病过程中发挥重要作用，而唾液酸和岩藻糖代谢途径对细菌无明显影响。

摘要:红曲色素（MPs）是红曲霉次生代谢过程中产生的具有多种生物活性的天然色素，广泛应用于食品、化妆品和保健品行业。[目的]本研究从紫色红曲霉Mp-21中克隆了一个红曲色素产生相关PigE基因，并对其功能进行了鉴定。[方法]利用同源重组原理对PigE基因进行敲除，从表型、显微结构、生长速率、红曲色素、桔霉素等方面分析基因缺失前后的生物学特征变化。[结果]PigE基因的缺失主要导致黄色素产量的提高和种类的增多。与野生型Mp-21菌株以产生红色素为主的色素混合物相比，△PigE丧失了产生红色素的能力，并且新产生了至少5种新的黄色素。△PigE液体发酵13 d后，红曲色素的总色价达到了3548.2 U/g，约为野生型Mp-21菌株的4.82倍；而△PigE桔霉素的产量没有显著变化，但产生的时间延迟。[结论]PigE基因的缺失可能阻断了黄色素向橙色素的转化途径，使△PigE更趋向于黄色素的形成。由于红色素的形成需要较复杂的条件，如培养基中的氨基酸和适宜的pH值等，△PigE更倾向于先合成黄色素，丧失了产生红色素的能力。本研究为高产黄色素基因工程红曲霉菌株的构建提供了一种可能的途径。