摘要:从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag+的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag+的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。

摘要:从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag+的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag+的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。

摘要:【目的】基于当前细胞表面展示体系存在的问题，旨在构建一个新型的普适性强、抗逆性好、高效稳定的酿酒酵母孢子表面展示系统。【方法】首先，根据酵母孢子固定化酶的特性，通过查阅文献寻找潜在的与孢子壁壳聚糖层高度亲和的壳聚糖结合模块；其次，利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)与结合模块融合表达，在体外和孢子内分别验证结合模块与孢子壁的亲和能力；之后，选择Saccharomyces cerevisiae AH109来源的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，MEL1)评估新型展示体系的效能。【结果】首先，选择Paenibacillussp. IK-5来源壳聚糖酶的碳水化合物结合模块32 (carbohydrate binding module 32，CBM32)作为壳聚糖结合模块。其次，将大肠杆菌表达纯化后的融合蛋白CBM32-GFP与dit1Δ孢子共孵育，通过GFP荧光定位以及荧光强度验证CBM32在体外与孢子壁具有较好的亲和能力；CBM32-GFP在dit1Δ孢子内的荧光定位与结合能力证明了其在孢子内能够与孢子壁紧密结合；最后，以MEL1替换GFP应用到新型展示体系中，与只表达MEL1的孢子相比，CBM32-MEL1孢子酶活不仅提高了68.65%，最高酶比活力达到460.59 U/g DCW (dry cell weight, 菌体干重)，重复使用能力也得到了显著提高；此外，该体系提高了MEL1的稳定性和可操作性。【结论】本研究首次提出利用结合模块来构建一个新型酿酒酵母孢子表面展示体系，为真核来源的多糖基化位点修饰以及多亚基结构蛋白提供了可靠的细胞表面展示平台，为实现工业化应用孢子固定化酶提供了理论依据。

摘要:摘要:【目的】克隆高原唯一珍惜鹤类———黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp. GN14 的α-半乳糖苷酶基因agaAGN14，并对该酶进行序列分析、系统发育分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】利用简并PCR 和GCTAIL-PCR 方法获得agaAGN14 全长，并对其氨基酸序列(AgaAGN14) 进行比对和neighbor-joining系统发育树的构建。将agaAGN14 重组到载体pET-28a(+)中并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达。利用组氨酸标签纯化重组α-半乳糖苷酶rAgaAGN14 并进行酶学性质分析。【结果】agaAGN14 全长2109 bp，GC 含量66.8%，编码702个氨基酸(77.5 kDa)。AgaAGN14 与数据库中序列的最高一致性为53.7%，与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶的一致性＜43%。系统发育分析将AgaAGN14 聚于具有催化域KWD和SDXXDXXXR 的α-半乳糖苷酶分支，与土壤微生物来源α-半乳糖苷酶距离相对较近，而与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶距离相对较远。rAgaAGN14 可水解pNPG、棉籽糖、密二糖、水苏糖、菜粕和棉籽粕，表观最适pH为6.5，在pH6.0－pH 9.0的范围内稳定并维持50%以上的酶活性。rAgaAGN14 的表观最适温度为45℃，在10℃、20℃ 和37℃内稳定并分别具有约28%、30%和80%的酶活。在45℃pH6.5条件下，rAgaAGN14 对pNPG的Km、Vmax和kcat分别为0.41mmol/L、18.28μmol/min/mg和25.36s－1。rAgaAGN14受Ag+、Hg2+及SDS抑制，受K+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Cu2+和β-mercaptoethanol部分抑制，受Co2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Na+和EDTA 的影响较小。【结论】首次报道从黑颈鹤粪便中分离到Arthrobacter 菌，并对该属细菌α-半乳糖苷酶进行序列分析、系统发育分析、异源表达和重组酶的酶学特性分析。rAgaAGN14 序列较新颖，其酶学特性可能是同时适应黑颈鹤肠道环境和高原淡水湿地环境的结果。