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    • 以聚羟基丁酸戊酸共聚酯为碳源去除循环水养殖系统的硝酸盐及生物膜中微生物群落动态

      2014, 54(9):1053-1062.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.09.010CSTR: 32112.14.j.AMS.2014.09.010

      关键词:关键词:循环水养殖系统,硝酸盐,PHBV,反硝化,PCR-DGGE,群落结构
      摘要 (1401)HTML (0)PDF 2.43 M (2043)收藏

      摘要:摘要:【目的】利用聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)作为固体碳源和生物膜载体,去除循环水养殖系统的硝酸盐,并研究固体碳源反硝化反应器不同运行阶段生物膜中微生物群落结构的动态变化。【方法】采用PCR-DGGE技术对反硝化反应器中微生物群落结构的动态变化进行了分析,采用传统纯培养方法分离反应器中降解PHBV的细菌。【结果】连接固相反硝化反应器能使循环水养殖系统中积累的硝酸盐显著降低,并维持在较低水平(小于10 mg/L),而常规循环水养殖系统中硝酸盐浓度持续增加。系统发育树聚类分析结果表明,反硝化反应器生物膜细菌归属于变形菌门(β-proteobacteria、γ-proteobacteria和δ-proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。反应器运行初期(40 d)的优势种群主要为Acidovorax和Bacillus;运行后期(150 d)的优势种群依次为Clostridium、Desulfitobacterium、Dechloromonas、Pseudoxanthomonas和Flavobacterium。从反应器中分离到的PHBV降解菌株分别归属于Acidovorax、Methylibium、Pseudoxanthomonas和Dechloromonas。【结论】利用PHBV为碳源能有效去除循环水养殖系统的硝酸盐。明确了反硝化反应器在运行过程中,碳源表面生物膜的优势菌群及其动态变化。

    • 来源于马赛菌(Massilia sp.) UMI-21的ACSMU和PhaCMU体外表达及功能研究

      2024, 64(4):1162-1174.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230639CSTR: 32112.14.j.AMS.20230639

      关键词:马赛菌UMI-21乙酰辅酶A合成酶(ACS)聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶聚3-羟基丁酸(PHB)合成途径
      摘要 (224)HTML (463)PDF 666.84 K (898)收藏

      摘要:【目的】构建马赛菌(Massilia sp.) UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACSMU和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA)合酶PhaCMU的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massilia sp. UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate, PHB)合成途径中的主要功能。【方法】利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp. UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acsMU和PHA合酶基因phaCMU扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACSMU和PhaCMU,并采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸) [5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system, OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACSMU和PhaCMU这2种酶在合成PHB途径中的功能。【结果】成功构建了ACSMU和PhaCMU蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acsMU和BL21-pQE-80L-phaCMU,提纯得到过表达蛋白ACSMU和PhaCMU产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACSMU酶比活力为(0.148±0.011) U/mg。PhaCMU酶对(R)-3HBCoA的比活力为(0.102±0.011) U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy, 1H-NMR)分析结果表明,使用ACSPt-PCTCP-PhaCRe、ACSMU-PCTCP-PhaCRe和ACSMU-PCTCP-PhaCMU这3条OPRS途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L。【结论】acsMU和phaCMU基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACSPt-PCTCP-PhaCRe合成体系,ACSMU替代ACSPt合成PHB产量增加22.58%,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase, ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性。使用PhaCMU代替PhaCRe,对比ACSMU-PCTCP-PhaCRe组合,合成PHB产量减少了15.79%。在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性。

    • 地中海富盐菌中phaB基因的鉴定及PHBV前体供应途径的分析

      2010, 50(10):1305-1312.

      关键词:关键词:地中海富盐菌;聚羟基脂肪酸酯;乙酰乙酰-CoA还原酶;前体供应途径
      摘要 (1284)HTML (0)PDF 1.03 M (1418)收藏

      摘要:摘要:【目的】进一步揭示地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)中聚羟基丁酸羟基戊酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate),PHBV]前体供应的途径并鉴定其中的关键基因。【方法】将细菌及其他古菌中已鉴定的与聚羟基脂肪酸酯前体(3-羟基脂酰-CoA)供应相关的酶与地中海富盐菌预测的全蛋白质组进行同源性比对,得到相似性比较高的5个基因,分别命名为:phaB1,phaB2,phaJ1,phaJ2和phaJ3。首先利用RT-PCR检测了5个基因在产PHBV的条件下的转录情况。然后利用同源重组双交换的方法,将5个基因分别或组合敲除,得到突变株:ΔphaB1,ΔphaB2,ΔphaJ1,ΔphaJ2,ΔphaJ3,ΔphaB1phaB2,ΔphaJ1phaJ2和ΔphaJ1phaJ2phaJ3。并在突变株ΔphaB1phaB2中分别互补phaB1和phaB2基因。【结果】无论是将3个phaJ基因单独敲除,还是组合敲除,对地中海富盐菌PHBV的积累都没有明显影响。单独敲除phaB1基因对PHBV的积累没有明显影响,单独敲除phaB2基因导致突变株PHBV产量明显下降,而且3-HV单体组分所占的摩尔比例也有所下降。 将phaB1和phaB2基因同时敲除后,得到的突变株不再产生PHBV。【结论】在地中海富盐菌中可能主要存在由乙酰-CoA和丙酰-CoA提供PHBV前体的途径,其中编码乙酰乙酰-CoA还原酶的两个基因即为phaB1和phaB2。

    • 罗氏真养菌W50的D-木糖代谢途径工程改造

      2014, 54(1):42-52.

      关键词:关键词:罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50,D-木糖代谢,聚-β-羟基丁酸酯(PHB),转运蛋白
      摘要 (1835)HTML (0)PDF 909.23 K (2643)收藏

      摘要:摘要:【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围,使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR 技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli) K-12 W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE,利用同源重组技术将xylE基因整合到R. eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR 技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R. eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段Ppha C1,同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R. eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明,xylA 和xylB基因在菌株R. eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明,W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h-1,在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB 在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长,在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为0.035 h-1。PHB含量分析结果表明,摇瓶发酵终点时,W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%,其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g-1和0.0838 g·g-1,低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB 转化率(>0.22 g·g-1)。另外,重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明,两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB 积累量。【结论】来源于E.coli K-12 W3110菌株的xylAB 基因的表达使R. eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力,通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力,同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。

    • 霍乱弧菌中调控aphB 的基因筛选及其功能

      2012, 52(2):256-261.

      关键词:关键词: 霍乱弧菌,aphB,基因调控
      摘要 (1382)HTML (0)PDF 255.91 K (2306)收藏

      摘要:摘要:【目的】筛选霍乱弧菌C6706-中调控LysR 家族蛋白AphB 表达的基因。【方法】将霍乱弧菌埃尔托型菌株C6706-aphB 启动子区克隆到2 个报告质粒pBBRLux 和pKP302 上,并将其导入霍乱弧菌C6706-中,以此作为出发菌株。利用出发菌株与转座子pSC123 接合构建LZV630-302 转座子随机突变文库,通过测定化学发光强度检测aphB 启动子的表达水平,筛选aphB 表达受影响的突变株。利用随机PCR 方法检测转座子插入位点,并测序比对分析基因。【结果】从7 个转座子库中(共约4 万个突变株) 得到能影响aphB 表达(均导致下降)的2 株突变株T1 和T2。测序比对发现T1 中转座子插入在vc1585 读码框内,T2 中转座子插入在距vc1602 基因末端7 bp处。【结论】获得aphB 表达改变的突变株,基因vc1585 和vc1602 可能直接或间接影响aphB 表达,为进一步研究aphB 表达调控影响因素奠定了基础。

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