摘要:构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶，经卡那霉素抗性筛选，获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RTPCR检测目的基因的整合与转录，ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性，分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化，于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠，第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击，根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明，双元表达载体pBin438/VP1构建正确，PCR、RTPCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达，ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64，攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%，证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。

摘要:利用Bac_to_Bac Baculovirus Expression Systems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒（REV）囊膜糖蛋白基因（env）的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验（IFA）和免疫转印试验，均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REV env。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后，可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体，并可抵抗REV病毒感染。

摘要:克隆表达钩端螺旋体表层膜蛋白新基因Lslp并分析表达产物的免疫原性。根据前期研究得到的致病钩体新基因Lslp（GenBank AF325807）的序列设计引物，在6株致病钩体中扩增Lslp基因并测序。以BamHⅠ酶切Lslp和pGEX 1λT，构建重组质粒并用酶切和PCR鉴定，进一步在大肠杆菌中诱导表达，并进行免疫印迹分析；纯化表达产物免疫家兔，ELISA检测血清抗体滴度。结果显示Lslp在6株致病钩体中均能扩增出相应片段，且序列同源性达到996%；构建高效原核表达重组质粒pGSTLslP，经IPTG诱导在大肠杆菌中可表达出66kD GST融合蛋白，并能与全钩抗血清发生免疫印迹反应；将上述融合蛋白免疫新西兰大白兔产生1：5120 高滴度的IgG抗体。研究结果提示致病钩体膜蛋白新基因Lslp可在大肠杆菌进行高效表达，表达产物能被全钩抗血清识别，为研究钩体的致病机制和筛选保护性抗原提供了基础。

摘要:根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列，设计一对引物，通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因，测序确认后，将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞，经间接免疫荧光试验证实，HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA），以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答，而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击，说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒，并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。

摘要:根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）国外分离株的溶菌酶释放蛋白（Muramidasereleased protein, MRP）的基因序列，设计并合成一对引物，利用PCR技术扩增了江苏分离株的开放阅读框298～827bp间529bp的基因片段，并定向克隆至pET32a(+)表达载体中。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，可表达分子量约42kD的蛋白。经过镍亲和层析柱层析，获得纯化的重组蛋白。以重组蛋白免疫Balb/c小鼠，以5LD50猪链球菌强毒株攻击后小鼠的相对存活率达625%。证实所表达的MRP片段为重要的保护性抗原。

摘要:对杆状病毒BactoBac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造，即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽S转移酶（glutathioneStransferase, GST）基因，构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞，证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMTgp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株ORF5基因，并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中，使之与GST融合，构建的重组转座质粒pFGST53转染DH10Bac，提取大分子Bacmid DNA，转染Sf9细胞，获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53。rvGST53感染Sf9细胞，SDSPAGE和Western印迹分析表明：与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达，表达产物分子量为45kD，能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠，经间接免疫荧光检测，免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC145细胞呈较强的荧光着色，证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。

摘要:猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白――核衣壳蛋白（Cap），该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查，但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变。本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1 ORF2进行了原核表达，将分别纯化的融合蛋白Cap2s 和Cap1s免疫SPF兔后制备多抗，并进一步分析了纯化蛋白的免疫原性和多抗的特性。Western blot结果表明无论Cap2s 和Cap1s均能与两个多抗发生交叉反应，而PCV2或PCV1阳性猪血清只能分别特异性地识别Cap2s 和Cap1s。IFA结果则证明两个多抗对于天然Cap蛋白无交叉反应性。利用Cap2s作为包被抗原对13个猪场的259份血清样品的PCV2抗体进行ELISA检测，平均阳性率为80.69％（209/259），而各猪场的阳性率差异较大（48.28%-100%）。以上结果表明Cap2s可作为一个型特异性抗原用于浙江省本地猪场猪群血清中PCV2抗体的监控，而其多抗也可用于免疫组化对PCV2感染进行有效诊断。

摘要:用5株传染性法氏囊病病毒（IBDV）单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上，将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后，构建原核表达质粒pET-5epis，在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS，经SDS-PAGE分析，r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析，结果表明，r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔，400μg/只/次，免疫2次，间隔7d，用IBDV间接ELISA检测血清抗体，第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000，第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000，说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡，50μg/只/次，免疫2次后，血清抗体效价可达到1∶12800，用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡，r5EPIS免疫组全部存活，而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%（13/15），证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答，预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

摘要:用5株传染性法氏囊病病毒（IBDV）单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上，将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后，构建原核表达质粒pET-5epis，在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS，经SDS-PAGE分析，r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析，结果表明，r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔，400μg/只/次，免疫2次，间隔7d，用IBDV间接ELISA检测血清抗体，第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000，第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000，说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡，50μg/只/次，免疫2次后，血清抗体效价可达到1∶12800，用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡，r5EPIS免疫组全部存活，而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%（13/15），证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答，预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

摘要:摘要:【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白，通过小鼠模型评价其免疫原性，建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测，评价其应用潜能。【方法】构建pET30a(+) -mpt83重组质粒，转化BL21(DE3)诱导表达并纯化，经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性，建立间接ELISA方法，检测临床奶牛血样，评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达，Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达，上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达，ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数，表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法，检测临床奶牛血样200份，与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白，其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答，并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA 方法。