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    • (R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位

      2011, 51(6):789-795.

      关键词:关键词:羰基还原酶;酿酒酵母;荧光蛋白表达谱;亚细胞定位;苯基乙二醇
      摘要 (1533)HTML (0)PDF 1.42 M (1483)收藏

      摘要:摘要:【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。

    • 荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

      2016, 56(7):1194-1201.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20150487CSTR: 32112.14.j.AMS.20150487

      关键词:EHV-1gD囊膜蛋白亚细胞定位荧光蛋白标签
      摘要 (836)HTML (761)PDF 3.94 M (1829)收藏

      摘要:[目的] 探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1, EHV-1) gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。[方法] 以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1质粒,构建pAc-GFP-gD (GFP-gD)和pDs-gD-Red (gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD (S-GFP-gD)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至pVAX-1表达载体,构建pVAX-Flag-gD (Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。[结果] 成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。[结论] 不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。

    • 十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

      2020, 60(11):2572-2581.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200074CSTR: 32112.14.j.AMS.20200074

      关键词:十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1亚细胞定位
      摘要 (373)HTML (2048)PDF 3.10 M (1323)收藏

      摘要:[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将III型效应物(type III secreted effectors,T3SEs)分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端(1–1220 aa)和C端(1221–2030 aa)分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S::EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。

    • 鸡Toll样受体21单克隆抗体的研制及其初步应用

      2022, 62(7):2824-2834.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210736CSTR: 32112.14.j.AMS.20210736

      关键词:chTLR21单克隆抗体细胞定位免疫印迹免疫组化
      摘要 (251)HTML (737)PDF 821.40 K (917)收藏

      摘要:【目的】研制鸡Toll样受体21(chTLR21)单克隆抗体,考察禽致病性大肠杆菌(APEC)及高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染鸡组织中的chTLR21蛋白的表达情况。【方法】以人工合成的多肽免疫原chTLR21(203–225 aa)与KLH偶联蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,以多肽免疫原chTLR21(203–225 aa)与BSA偶联蛋白作为检测抗原,通过间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞株,同时,采用间接免疫荧光技术(IFA)检测单克隆抗体的荧光反应性;上述单克隆抗体用于chTLR21在鸡巨噬细胞(HD11)中的定位;在APEC O1血清型E516菌株、HPAIV H5N6亚型毒株感染35日龄SPF鸡模型中,应用获得的单克隆抗体以免疫印迹(Western blotting)和免疫组化(IHC)方法检测感染鸡组织中chTLR21的表达情况。【结果】建立了间接ELISA检测方法,确定最适抗原包被浓度为2.5 μg/mL,最适血清稀释度为1:6 400。经ELISA、IFA筛选,获得4株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、2C10、3B6和4F11。上述单克隆抗体亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG2a型,其中3B6具有较强的荧光反应性;制备单克隆抗体3B6腹水,其ELISA效价为1:102 400;IFA结果表明,chTLR21存在于HD11细胞质内;APEC感染鸡组织中chTLR21 Western blotting和IHC检测结果表明,感染鸡肝、脾、肺、肾、法氏囊中chTLR21表达量显著上升,而胰腺中表达量显著下降;HPAIV H5N6感染鸡上述组织中chTLR21的表达量均未见明显变化。【结论】本研究成功研制出针对鸡chTLR21受体的单克隆抗体,单克隆抗体3B6可用于检测鸡体内chTLR21表达情况,为chTLR21在病原体感染及天然免疫应答中的机制、功能研究提供了重要生物材料。

    • 酿酒酵母荧光定位报告菌株的开发

      2020, 60(4):667-678.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190277CSTR: 32112.14.j.AMS.20190277

      关键词:蛋白定位RedStar酵母报告菌株共定位
      摘要 (977)HTML (3774)PDF 1.29 M (1371)收藏

      摘要:[目的] 为了给外源蛋白在酿酒酵母细胞中的定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。[方法] 运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化的红色荧光蛋白RedStar分别整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行PCR扩增和测序验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测,对线粒体和细胞核进行特异性染料染色,用EGFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。[结果] 构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的肌动蛋白、晚期胞内体、细胞核、核周质、纺锤体、线粒体、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、高尔基体顺面及高尔基体反面。PCR扩增及测序验证、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。[结论] 这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。

    • 优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达与应用

      2017, 57(9):1362-1372.DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20170230CSTR: 32112.14.j.AMS.20170230

      关键词:绿色荧光蛋白eCGP123密码子优化冰岛硫化叶菌亚细胞定位
      摘要 (1030)HTML (729)PDF 2.61 M (1762)收藏

      摘要:[目的] 开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中进行高效表达的eCGP123(enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白,并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。[方法] 绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并研究其蛋白性质;通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括E.coli来源的FtsZ和S.islandicus来源的UpsE、PCNA1和SiRe_1200等),构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株,用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。[结果] 我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的eCGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和SiRe_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间;鞭毛组分蛋白UpsE呈点状均匀分布,可能定位于细胞膜上;DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布,暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。[结论] 绿色荧光蛋白eCGP123可以作为报告蛋白,应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中,可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具,但需要进一步优化条件。

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