摘要:【目的】本试验前期已经证实,用单链抗体(scFv)-绿脓杆菌跨膜区(ETA)-酵母DNA结合结构域(GAL4)表达的蛋白(简写为SEG蛋白), SEG能与含shRNA(short hairpin RNA)的质粒(pRNATU6.3-shRNA)结合形成复合物SEG-shRNA,并靶向运送该质粒进入感染狂犬病毒(Rabies virus, RV)的细胞,抑制RV复制。本研究用感染狂犬病病毒的小鼠模型,进行SEG-shRNA复合物小鼠体内靶向性运送siRNA(short interfering RNA)和抑制RV复制的研究。【方法】用已建立RV CVS-24株小鼠肌肉注射模型进行试验。取50 LD50 CVS-24攻毒,在攻毒后12 h尾静脉注射SEG-shRNA,流式细胞仪检测SEG-shRNA的体内靶向性;同样方法攻毒后,尾静脉注射SEG-shRNA,连续4 d,攻毒后第5天小鼠脑组织用qRT-PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测其中RV的含量;统计小鼠存活率;并检测小鼠体内IFN-α含量,从而分析SEG-shRNA在体内的抗病毒作用。【结果】结果表明仅在RV攻毒小鼠的注射部位检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达,未注射RV的腿部及脑、肝、脾、肾均无GFP表达,说明SEG-shRNA可靶向RV感染细胞运送shRNA。攻毒后第5天脑组织qRT-PCR结果表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍(3.9/0.8); RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色试验结果表明使用SEG-shRNA组病毒量明显少于病毒对照组;且攻毒后13 d,动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-α未见升高。【结论】以上试验表明SEG蛋白在小鼠体内靶向运送含shRNA的质粒到感染组织细胞;对小鼠体内RV有明显抑制作用,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。

摘要:[目的]鉴定及克隆新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）中Pol Ⅲ型的U6启动子（CnU6启动子），并验证CnU6启动子能否有效转录shRNA及CRISPR/Cas9系统中gRNA。[方法]结合GenBank数据库已公布的新型隐球酵母基因组信息和本实验室RNA-seq文库数据，利用生物信息学技术分析得到新型隐球酵母中具有高转录水平的U6 RNA序列。使用重叠PCR和EasyGeno方法将预测的CnU6启动子分别克隆到shRNA及gRNA的上游区域，通过观察shRNA对靶基因的RNAi效果及gRNA引导Cas9核酸酶对靶位点的切割结果，确定CnU6启动子能否转录短RNA。[结果]CnU6启动子能够转录形成shRNA对靶基因进行沉默，并且能转录形成gRNA引导Cas9核酸酶对靶点进行切割。[结论]新型隐球酵母的CnU6启动子被成功鉴定及克隆，它能有效驱动shRNA和gRNA的转录。

摘要:摘要：【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂，靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因，通过搭桥PCR法获得scFv(G)-ETA-GAL4（SEG）嵌合基因；克隆至原核表达载体pET28a(+)，构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4（pET28a-SEG）；在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达，利用镍柱亲和层析法纯化包涵体，经复性、鉴定制得SEG蛋白；ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性；将SEG蛋白与含shRNA的质粒（pRNATU6.3-shRNA）连接制成靶向shRNA，接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞，35 h观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达情况；48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果。【结果】克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因，大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白，能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应，SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL。ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关。细胞试验表明GFP在细胞内得到表达；直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制。【结论】SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合，可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中，抑制狂犬病毒的复制。