金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患病原菌,可导致人类和动物的化脓性疾病,有数据表明近50%的奶牛乳腺炎是由该菌引起的^[1]。黏附素在金黄色葡萄球菌对寄主细胞的侵入、定植和扩散过程中扮演着重要的角色。研究表明，黏附素与哺乳动物细胞外基质(ECM)黏附能力的大小，可直接影响其致病力^[2]。纤连蛋白结合蛋白A(fibronection binding protein A，FnBPA)和聚集因子A(clumping factor A，ClfA)两种黏附素被认为是金黄色葡萄球菌的两种最重要的毒力因子^{[3, 4]}。FnBPA能够介导金黄色葡萄球菌与细胞的纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)及纤维连接素(fibronection，Fn)的结合^[5]。FnBPA含A、B、C和D区,其中A区具有Fg结合活性；D区具有Fn结合活性^[6]。ClfA在细菌生长的各个阶段都出现。ClfA可特异地与细胞外基质成分中的纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)结合^[7]。

以往的研究结果表明,FnBPS和ClfA的抗体均可一定程度阻断金黄色葡萄球菌对乳腺组织的黏附^{[8, 9]}。Eric等^[10]研制了针对金黄色葡萄球菌黏附素聚集因子(ClfA)的DNA疫苗，免疫小鼠产生了特异且效价很高的抗体，但腹腔攻毒时却不能提供保护。范鑫等将FnBPA-D与ClfA-A进行串联共表达，证明了该融合蛋白可在原核细胞中成功表达，且所表达的蛋白质具有免疫原性^[11]。将多种不同黏附因子的抗原表位融合或串联表达，虽然所表达蛋白也具有一定的免疫原性，但其也存在着抗原截短后导致的抗原有限表达，抗原结构可能改变等缺点。为使黏附因子通过原核表达时获得良好的折叠和空间构象以便于分析其抗原性和免疫保护作用，本研究分别表达了牛源金黄色葡萄球菌ClfA，FnBPA-A与FnBPA-BCD重组蛋白并单独或联合免疫实验动物，检测与比较免疫后的特异性抗体水平、抗体对菌的识别能力、抗细菌黏附能力以及攻毒保护力，期望探索基于金黄色葡萄球菌多种黏附素的免疫策略，阻断金黄色葡萄球菌对细胞的黏附过程，预防其感染的发生。

根据GenBank中已发布的基因序列，利用Primer 5.0软件设计ClfA、FnBPA-A、FnBPA-BCD基因PCR引物，并在上下游引物加上XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。提取金黄色葡萄球菌分离株基因组为模板，扩增ClfA、FnBPA-A与FnBPA-BCD基因。将测序正确的PCR产物酶切并与pET-28a载体连接，转化至大肠杆菌 DH5α。经PCR与酶切鉴定后的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序。

将测序正确的阳性重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，选取阳性克隆进行诱导表达。将阳性BL21(DE3)菌种按1%接种于5 mL含卡那霉素的液体LB培养基中，以pET-28a作阴性对照，37 ℃ 200 r/min振荡培养过夜。按1%接种于含卡那霉素的液体LB培养基中37 ℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8。加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃振荡培养5 h，分别取诱导表达菌液及对照菌液进行SDS-PAGE分析。

用HisTrap^TM试剂纯化重组蛋白。将鉴定为阳性的重组菌诱导并收集菌体，用PBS将沉淀悬起，超声波破碎10 min，破碎后的上清按说明书进行纯化。收集的目的蛋白洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

纯化后的重组蛋白，经15% SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜，以兔抗金黄色葡萄球菌全菌多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG进行Western-blot分析。

用5 μg/mL Fg及5 μg/mL Fn分别包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜；每孔加5%脱脂奶粉200 μL，37 ℃封闭2 h；加200 μL浓度为0.1 μg/mL纯化蛋白，4 ℃过夜；每孔加100 μL 兔抗金黄色葡萄球菌抗体，室温孵育1 h；加HRP标记的羊抗兔IgG，37 ℃ 1 h；加100 μL TMB，37 ℃显色10-20 min；用100 μL 1 mol/L H₂SO₄终止反应，测定OD₄₅₀值。

6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为5组，每组10只，分别为ClfA免疫组、FnBPA-A免疫组、FnBPA-BCD免疫组、ClfA+FnBPA-A+FnBPA-BCD联合免疫组，以及PBS对照组。分别将纯化后的重组蛋白50 μg与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后，对实验鼠皮下多点注射免疫；2周后，将等量重组蛋白与等体积弗式不完全佐剂充分乳化后进行第二次免疫，PBS对照组免疫方法同上。分别于一免第0、14、30天采血并分离血清，以纯化的ClfA、FnBPA-A、FnBPA-BCD蛋白为包被抗原，按间接ELISA检测血清抗体效价。

用5%戊二醛溶液处理酶标板，200 μL/孔，37 ℃作用2 h，去离子水洗涤4次；过夜培养的金黄色葡萄球菌，1%接种于新鲜LB中37 ℃培养8-12 h；4000 r/min离心15 min，沉淀重悬于稀释至1×10⁹ CFU/mL；将稀释后的菌悬液100 μL/孔包被于戊二醛处理过的酶标板中，37 ℃、18-24 h至干燥；5%脱脂乳37 ℃封闭2-3 h；加入待检免疫血清37 ℃孵育1 h，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行ELISA检测。

首免40 d后，使用本实验室分离鉴定的牛源金黄色葡萄球菌毒株，分别对ClfA免疫组、FnBPA-A免疫组、FnBPA-BCD免疫组、ClfA+FnBPA-A+FnBPA-BCD联合免疫组，以及PBS对照组攻毒，剂量为1 MLD(2×10⁹ CFU)，7 d观察并记录小鼠死亡情况。

以提取的金黄色葡萄菌基因组DNA为模板，对3种目的基因分别进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到 ClfA、FnBPA-A基因片段大小在1600 bp，FnBPA-BCD基因片段800 bp，均与预期大小相符。将测序正确的PCR产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切消化并纯化后与pET-28a载体连接，重组质粒酶切及测序均正确。

测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，SDS-PAGE显示重组蛋白ClfA、FnBPA-A、FnBPA-BCD，分别在94、80和60 kDa处出现条带，其大小与预期相符，而空载体对照诱导前后没有浓染条带出现。纯化的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定分别在94、80和60 kDa处有清晰的条带。

将纯化后的重组蛋白ClfA、FnBPA-BCD用兔抗金黄色葡萄球菌免疫血清为一抗进行Western-blot检测，分别在94、80和60 kDa处可见明显的条带，而空载体对照无条带(图1)，表明这3种重组蛋白具有良好反应原性。

图 1. 重组蛋白ClfA、FnBPA-A、FnBPA-BCD 的免疫印迹分析 Figure 1. Western-blot analysis of His-ClfA, His-FnBPA-A and His-FnBPA-BCD recombinant protein. M, protein marker; lane1, ClfA; lane 2-3,6, pET28a; lane 4, FnBPA-A; lane 5, FnBPA-BCD.

图选项

重组蛋白ClfA、FnBPA-A、FnBPA-BCD分别与Fg、Fn结合试验结果表明(图2)，3种重组蛋白对Fg、Fn均有一定的结合能力，与PBS对照组相比差异显著(P < 0.01)。重组蛋白ClfA对Fg的结合能力明显高于FnBPA-A与FnBPA-BCD(P < 0.01)，FnBPA-BCD与牛Fg结合能力最弱。重组蛋白与Fn的体外结合结果显示，FnBPA-A、FnBPA-BCD与Fn结合能力明显优于ClfA(P < 0.01)，而重组蛋白FnBPA-A、FnBPA-BCD与Fn结能力差异不显著(P>0.05)。

图 2. 表达蛋白对Fg(A)、Fn(B)结合能力的比较 Figure 2. Binding ability of recombinant proteins to Fg (A) and /or Fn (B).

图选项

对不同免疫组抗体的检测结果显示(图3)，3种蛋白联合免疫组抗体水平明显优于其余各免疫组(P < 0.01)，血清抗体效价可达1∶121500。其后依次为血清抗体效价为1∶40500的FnBPA-A组和ClfA组、FnBPA-BCD组血清抗体效价1∶4500。FnBPA-BCD组在整个免疫过程中抗体增加不明显，仅略高于PBS对照组。

图 3. 二免后小鼠血清特异性抗体效价检测 Figure 3. Antibody detection after immunized with recombinant proteins.

图选项

不同免疫组特异性抗血清对金黄色葡萄球菌识别能力的检测结果显示(图4)，与PBS对照组相比，各免疫组抗血清对金黄色葡萄球菌均有一定的识别能力；3种蛋白联合免疫组血清与金黄色葡萄球菌的识别能力明显优于其余各组(P < 0.01)，其次为ClfA免疫组、FnBPA-A免疫组、FnBPA-BCD免疫组。ClfA免疫组对菌体的识别能力优于FnBPA-A免疫组和FnBPA-BCD单独免疫组，FnBPA-BCD免疫组对金黄色葡萄球菌的识别能力最弱。

图 4. 小鼠免疫血清对金黄色葡萄球菌全菌识别能力检测 Figure 4. Detection of binding ability to Staphylococcus aureus of serum after immunized mice with recombinant proteins. t/d: Day post primary immunization.

图选项

首免后40d用牛源金黄色葡萄球菌菌株攻击，观察小鼠死亡情况。结果显示(图5)，ClfA免疫组与3种蛋白联合免疫组保护率可达到100%，FnBPA-A组与FnBPA-BCD组蛋白保护率分别为80%和50%，对照组全部死亡。表明ClfA免疫组和3种蛋白联合免疫组具有较佳的免疫保护作用。

图 5. 重组蛋白免疫保护力检测 Figure 5. Detection of immunoprotective rate after immunized with recombinant proteins.

图选项

ClfA与FnBPA同属于金黄色葡萄球菌MSCRAMMs，参与金黄色葡萄球菌与宿主的黏附以及生物膜结构的形成。ClfA可在金黄色葡萄球菌生长的各个阶段表达，其由933个氨基酸组成，含A区和R区。ClfA能够与纤维蛋白原(Fg)和纤维连接素(Fn)结合^[6]。

FnBPA由1018个氨基酸组成，含A、B、C和D区，免疫决定表位位于配基结合的D区^[12],FnBPA的A区是一个由非重复序列组成的独特伸展区，具有结合Fg的作用。本研究中选择表达的功能区为FnBPA的A区及BCD区。

对重组蛋白免疫小鼠后的血清抗体检测结果显示，ClfA重组蛋白第二次免疫后的血清效价优于FnBPA-BCD蛋白，表明ClfA蛋白的免疫效果可能优于FnBPA-BCD蛋白。ClfA在诱导抗体方面显示出其优势，分析原因可能是ClfA蛋白的A区所含的抗原表位多，分子量较大，这一结果与以往我们利用生物信息软件对ClfA抗原性的预测得出ClfA具有良好的抗原性^[13]的结果是一致的。

由于金黄色葡萄球菌的黏附作用是通过多种黏附素实现的，要实现对其黏附的有效抑制，有必要同时对不同黏附素抗体的抗黏附能力进行深入细致的比较与研究。以往试验证据也表明，在对实验动物进行金黄色葡萄球菌攻击时，单一抗原往往不能提供完全的保护^[10]。姜晓娟等对金黄色葡萄球菌ClfA的A区基因进行了克隆表达，并对表达产物进行了免疫特性的研究，证明了针对ClfA的抗体可一定程度阻断金黄色葡萄球菌的黏附作用^[8]。史冬艳等对FnBPB-D基因进行了表达并研究了其抗血清的活性，也证明了该黏附素分子的多克隆抗体可一定程度的阻断金黄色葡萄球菌的黏附作用^[9]。虽然Shkreta等设计了针对金黄色葡萄球菌ClfA(221-550 aa)和FnBP(D1 21-34；D3 20-33)的二价核酸疫苗，免疫怀孕7个月的奶牛，再用相应的重组蛋白加强免疫一次，证明其能引起奶牛明显的细胞免疫反应和体液免疫反应^[14]。但在这些试验中均未对免疫原的黏附抑制功能进行检测。

在本试验中我们分别表达ClfA、FnBPA-BCD及FnBPA-BCD重组蛋白并进行联合免疫，评估并比较了三者联合及单独免疫所诱导抗体的特点，及免疫后的抗体对金黄色葡萄球菌菌体的识别、抗黏附及免疫后的保护效果。免疫后的检测结果表明3种重组蛋白中ClfA，FnBPA-A的免疫原性较好，而联合免疫3种重组蛋白则能够产生高水平的特异性抗体。何焱^[15]用FnBPA-D蛋白免疫家兔，血清抗体效价可达1∶256000。赵艳^[16]以FnBPA的D区蛋白诱导表达免疫家兔，二免血清效价达1∶3200。本实验的研究结果表明FnBPA-BCD的免疫原性在3种重组蛋白中最弱，结合以往的研究，FnBP中Fn结合位点的蛋白结构往往处于一种高度的无序状态，而当其与Fn发生特异性结合后，才表现出特定的高级结构^{[17, 18]}。分析其产生的抗体水平及免疫保护力差异均与此有关，因此重组蛋白FnBPA-BCD可能存在免疫过程中构像改变而导致其抗体识别FnBPA-BCD困难。

ClfA蛋白免疫组与3种蛋白联合免疫组保护力都达到100%，但是联合免疫组无论从抗体效价还是菌体结合试验中均呈现明显高于3种蛋白单独免疫组。由此推断，金黄色葡萄球菌黏附素重组蛋白联合免疫可能具有更多的潜在优势。