环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是新发现的细菌广泛使用的第二信使，其由两分子ATP或ADP经环化酶(diadenylate cyclase,DAC)作用后形成的一种环状分子，并可被磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)分解为一个线性分子pApA或者两分子的AMP(图 1)。在枯草芽孢杆菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌以及猪链球菌的核酸提取物中均发现了c-di-AMP的存在^{[1, 2, 3, 4]}。近年来，c-di-AMP备受青睐，其生物学功能也日渐明朗。现已发现其与耻垢分枝杆菌的脂肪酸代谢^[5]、金黄色葡萄球菌对低磷酸盐环境的耐受^[6]、枯草芽孢杆菌DNA的完整性^[1]、多种细菌细胞壁的代谢平衡^{[3, 7, 8, 9, 10]}以及细菌的毒力^{[4, 11, 12, 13]}等密切相关，深入阐明其在细菌中的代谢途径、信号转导机制等将具有重要意义。

图 1. c-di-AMP的合成与分解 Figure 1. Synthesis and degradation of c-di-AMP.

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c-di-AMP最初是在研究海栖热袍菌DNA完整性监测蛋白(DNA integrity scanning protein A,DisA)的结构时发现的^[14]，随着研究的深入，发现c-di-AMP是由含DAC结构域的蛋白催化合成，并可被含有DHH或DHH/DHHA1结构域的磷酸二酯酶分解。

在解析海栖热袍菌的DisA蛋白晶体结构时发现，在DAC结构域中出现一个额外电子密度，经分析确认为c-di-AMP。进一步研究表明，在二价阳离子存在的情况下，两分子的ATP通过DisA催化生成一分子的c-di-AMP，ATP与c-di-AMP分布于DisA八聚体复合物的不同亚单位中^{[14, 15]}。配体-DisA复合物晶体结构解析显示，在DAC结构域中存在DGA和RHR两个特征结构，这两个特征结构在所有具有DAC结构域的蛋白中均为保守结构，并已有实验证实了它们在催化过程中发挥关键作用^{[14, 15]}。

通常认为c-di-AMP是由两分子的ATP经环化酶催化合成的，但Bai等^[15]研究发现，结核分枝杆菌的c-di-AMP合成酶Rv3586还可以利用ADP为底物生成c-di-AMP，Manikandan等^[16]进一步研究发现该合成酶是通过两步反应，即首先催化ATP和ADP生成对应的中间产物pppApA和ppApA，然后与中间产物继续作用最终转化为c-di-AMP的。除了DisA外，还有其它一些具有DAC结构域的蛋白，其中DacA蛋白是最为常见的一种，本实验室分析发现猪链球菌中的DAC结构域蛋白便属于这一类型，其DAC结构域位于羧基端，和一个三螺旋跨膜区相连，该跨膜结构位于氨基端，可能是一个感应区域，通过感知某些特定的细胞膜或细胞壁的变化来调节c-di-AMP的合成。我们通过体外活性试验已证明该蛋白具有c-di-AMP合成活性，但其具体的生物学功能还在进一步研究中。另外一些不同结构的含DAC结构域蛋白，它们与其它功能蛋白如糖代谢蛋白等相关联^[17]，其生物学功能也尚待进一步研究。

在发现c-di-AMP合成酶的同时，研究者发现了一个可以将c-di-AMP水解生成线性pApA分子，具有磷酸二酯酶活性的蛋白——YybT^[18]。该蛋白与其它菌属中的同源蛋白共同被命名为GdpP，即含有GGDEF结构域、具有磷酸二酯酶活性的蛋白(GGDEF domain protein containing PDE，GdpP)。GdpP蛋白包含两个跨膜螺旋结构、一个PAS(Per-ARNT-SIM)感受结构域、一个修饰后的GGDEF结构域、一个DHH结构域以及一个DHH伴随结构域DHHA1。磷酸二酯酶活性主要位于羧基端的DHH/DHHA1区域内，它可以将c-di-AMP水解，形成pApA^[18]。本实验室通过体外表达以及活性分析证实了猪链球菌中的GdpP蛋白具有体外分解c-di-AMP的活性，同时通过对该基因的缺失发现，缺失株 c-di-AMP的含量明显升高，表明GdpP在猪链球菌中发挥着调节c-di-AMP水平的作用^[4]。

另外，最新研究发现，其它一些具有DHH或DHH/DHHA1结构域的蛋白也可以水解c-di-AMP。肺炎链球菌中含DHH/DHHA1结构域的蛋白Pde2不仅可以水解c-di-AMP，还可水解其分解产物pApA，最终生成AMP^[19]；伯氏疏螺旋体中含DHH/DHHA1结构域的蛋白Dhhp，能够水解c-di-AMP生成pApA^[13]；结核分支杆菌中含DHH结构域的蛋白MtbPDE可以通过两个步骤最终将c-di-AMP水解成为5′-AMP^[16]。多种c-di-AMP分解蛋白的发现提示c-di-AMP在细菌细胞内可能有着不同的分布，而不同的代谢蛋白可能调节着不同区域内的c-di-AMP代谢平衡，继而完成其不同的生物学功能。

与其它信号分子一样，c-di-AMP参与的代谢通路也遵循着相似的规则。当菌体感知到环境的变化后，参与c-di-AMP合成或分解的酶的活性会发生变化，从而导致其在细胞内的浓度发生改变，通过与其受体的作用，调节下游效应分子的功能，进而发挥特定的生物学作用，现已发现如下几种c-di-AMP受体。

耻垢分枝杆菌Ms5346基因编码的四环素抗性(tetracycline resistance，TetR)家族调节因子是发现的第一个c-di-AMP受体蛋白，后被命名为c-di-AMP受体调节因子(c-di-AMP receptor regulator，DarR)^[5]，DarR是从耻垢分枝杆菌大约500个预测的转录因子中筛选获得的^[5]。在耻垢分枝杆菌中，DarR不但能够与其自身启动子结合并抑制其转录，它还可以与编码中链脂肪酰基辅酶A合成酶和主要易化家族转运蛋白的转录操纵子的启动子结合，抑制其转录。在耻垢分枝杆菌中，敲除darR会导致细胞体积膨大，相反，其过表达则对细菌具有毒性作用，并引起脂肪酸合成显著减少。表明改变细胞内的c-di-AMP浓度会影响耻垢分枝杆菌脂肪酸的代谢进而影响细菌的形态。

应用亲和阻滞分析发现，金黄色葡萄球菌Ktr型钾盐转运系统的KtrA蛋白，是又一个c-di-AMP受体蛋白^[6]。KtrA是钾盐转运调控因子家族中的一员，它由一个氨基端的RCK_N结构域和一个羧基端的RCK_C结构域组成，c-di-AMP则与RCK_C结构域特异性结合。研究发现，KtrA是金黄色葡萄球菌在低钾盐环境中生长必不可少的 ^[6]。组氨酸激酶 KdpD是另一个通过全基因组筛选得到的c-di-AMP受体，这一蛋白同样有可能参与钾离子的平衡代谢，另外它还在多种致病菌中参与细菌毒力和细菌在细胞内生存的调控^[20]。此外，阳离子反向转运体A(cation proton antiporter A，CpaA)也被鉴定为c-di-AMP的受体。鉴于CpaA同样是一个离子转运蛋白，提示其有可能参与细胞钾盐和钠盐的摄取^[6]。

最新研究发现，在肺炎链球菌中，一个Trk家族钾离子转运蛋白CabP(SPD_0077)可与另一个Trk家族钾离子转运蛋白SPD_0076结合，从而促进钾离子的摄取。而细胞中的c-di-AMP又可以与CabP发生结合，阻碍CabP与SPD_0077的结合，从而影响细菌对钾离子的摄取(图 2)。提示c-di-AMP可能在肺炎链球菌摄取钾离子的过程中存在一定的调节作用。

图 2. 肺炎链球菌c-di-AMP调控钾离子摄取示意图 Figure 2. Model of c-di-AMP controlled potassium uptake by S. pneumoniae.

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离子转运对细菌的生存极为重要，它可以帮助细菌适应环境中渗透性的变化，调控胞内酶的活性，调节胞内酸碱平衡以及保持一个适当的细胞膜位势。c-di-AMP信号通路与离子平衡之间的联系提示该分子对细菌生存至关重要。

金黄色葡萄球菌中又一个被确认的c-di-AMP受体是一P_Ⅱ样信号转导蛋白，被命名为PstA^[6]。PstA是一个胞内蛋白，包含一个未知功能的结构域DUF970。在含该结构域的蛋白中，P_Ⅱ样氮调节蛋白研究得最为清楚，它属于GlnB超家族。这些蛋白都是参与碳与氮代谢的重要因子，提示c-di-AMP可能参与氮代谢的调节。

核糖开关是一类能够应答配体浓度变化，从而调控基因表达的mRNA元件。ydaO核糖开关通常与细菌细胞壁代谢，适应渗透压的变化以及细菌芽胞的形成相关^{[21, 22]}，虽然研究发现枯草芽孢杆菌中的ydaO RNA能够感受ATP并产生一定的反应，但是进一步研究发现，ATP并不是ydaO RNA识别的首要受体^[23]。Nelson等证明了c-di-AMP可以和ydaO RNA紧密结合，ydaO RNA结构中M1、M2、M3、M4和M5位点(图 3)上的核苷酸是影响ydaO RNA与c-di-AMP结合的关键位点^[24]。此外，该课题组还通过体外以及体内试验证实了c-di-AMP与ydaO核糖开关的结合可以调控基因的表达，并且进一步研究还发现c-di-AMP控制的核糖开关参与调控细菌的多种生物活动，如放线细菌的细胞壁代谢，蓝藻细菌渗透保护剂的合成以及芽孢杆菌芽孢的形成等^[24]。c-di-AMP核糖开关受体的发现，进一步丰富了c-di-AMP调控细菌基因表达的机制。

图 3. 165 ydaO RNAs结构意图[24] Figure 3. Characteristics of 165 ydaO RNAs [24].

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对c-di-AMP的生物学功能的研究，最早是在枯草芽孢杆菌中进行的。枯草芽孢杆菌的c-di-AMP合成蛋白DisA是一个八聚体蛋白，通过羧基端的HhH结构域与DNA结合，在对基因组DNA进行扫描(scan)的同时，氨基端的DisA_N结构域部分合成c-di-AMP，并向前移动^{[14, 25]}。DisA的移动依赖于c-di-AMP的合成^{[1, 25]}。当检测到分支的DNA时，如Holliday连接体和复制叉，DisA的移动以及c-di-AMP的合成便停止^{[1, 14]}，随后，以c-di-AMP水平的下降作为信号使DNA停止复制直至其修复为止，如图 4所示。有报道指出DisA会在细菌的对数生长后期以及芽孢形成过程中表达量增加^[25]。因此，c-di-AMP作为DNA完整性的指示因子，可以确保枯草芽孢杆菌只将没有损伤的DNA包装于芽孢中^[1]。

图 4. c-di-AMP作为DNA损伤第二信使分子模型示意图[1] Figure 4. A schematic illustration of the activity of c-di-AMP as a secondary molecule signalling DNA damage [1].

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研究发现，通过常规生物学方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因会导致多种细菌无法生存^{[3, 26, 27]}，提示c-di-AMP是细菌生长所必须的信号分子。Mehne等研究证实c-di-AMP是枯草芽孢杆菌生长所必须的分子，但研究同时发现过高的c-di-AMP水平却对细菌生长有害^[28]。在对单增李斯特杆菌、肺炎链球菌以及耻垢分支杆菌等细菌进行研究时发现，这些细菌胞内c-di-AMP的改变能够明显影响细菌的生长^{[5, 8, 9, 10, 11, 12]}。同样，本实验室研究发现，猪链球菌c-di-AMP分解蛋白基因gdpP缺失后，随着胞内c-di-AMP含量的升高，其生长也受到明显的影响^[4]，上述结果均提示，细菌通常保持这一个适当的c-di-AMP含量存并处于一个平衡状态，当平衡被破坏，无论是c-di-AMP水平过低或者过高都会影响细菌正常的生长。

最近，众多研究表明，改变细胞内c-di-AMP的水平会导致细菌细胞壁的变化。例如，在葡萄球菌中，GdpP的失活可引起细胞内c-di-AMP升高近15倍，而这一过程可以恢复多聚脂磷壁酸(polymer lipoteichoic acid，LTA)缺失型菌株的生存能力^[3]。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在gdpP发生突变后均表现出对β-内酰胺类药物敏感性的降低，这更进一步说明c-di-AMP水平的变化影响了这两种细菌细胞壁的结构。而本实验室研究发现，虽然猪链球菌gdpP基因缺失后，c-di-AMP水平有所上升，但其β-内酰胺类药物的敏感性却没有显著变化，同样在伯氏疏螺旋体也发现这一现象^[13]，其原因可能为猪链球菌在gdpP基因缺失后c-di-AMP的上升没有达到金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的水平(约2倍)，或者c-di-AMP在不同细菌中发挥的作用不同，产生这一现象的原因尚待进一步研究。

Ⅰ型干扰素应答是机体激活的抵抗病毒感染的一类先天性免疫反应。报道显示，c-di-AMP是激活这一应答信号通路的信号分子之一。

单增李斯特杆菌是一种胞内寄生性致病菌，在其进入宿主细胞后，c-di-AMP通过多药外排泵(multidrug efflux pumps)MdrM和MdrT分泌到宿主的细胞溶质中^{[29, 30, 31]}，接着诱导机体Ⅰ型干扰素应答产生β-干扰素^{[26, 31]}。这一应答依赖于宿主细胞的解旋酶DDX41以及跨膜受体分子STING(STimulator of INterferon Genes)^{[32, 33]}。最近，研究发现c-di-AMP可以与DDX41结合，然后与STING形成一个复合体，DDX41可能作为一个共同受体而发挥作用^[34]。当STING被激活后便会促发一系列下游反应，激活Ⅰ型干扰素信号通路，产生β-干扰素。Yang等^[35] 构建了结核分枝杆菌c-di-AMP合成基因缺失株ΔdisA以及分解基因缺失株ΔcnpB，分析结果显示，ΔdisA胞内以及分泌到胞外的c-di-AMP的含量显著降低，而ΔcnpB相应的c-di-AMP含量则明显升高。用这两个菌株分别感染由C57BL/6 WT小鼠分离获得的骨髓源巨噬细胞，并检测β-干扰素的分泌情况，结果显示，与各菌株胞内以及分泌到胞外的c-di-AMP的含量变化相对应，ΔdisA感染组细胞的β-干扰素的分泌量较野生株低约4倍，而ΔcnpB感染组细胞的β-干扰素的分泌量则高出野生组10倍，提示结核分枝杆菌分泌的c-di-AMP能够刺激感染的宿主细胞分泌IFN-β。细菌诱导的这一反应是否对细菌的增殖有利还是只是细菌为了调节胞内c-di-AMP水平而产生的反应仍需进一步研究。

Kyu Hong Cho等^[11]研究发现，在化脓链球菌中，GdpP缺失会影响其重要的毒力蛋白——致热外毒素(secreted pyrogenic exotoxin B,SpeB)的活化过程，同时GdpP的缺失降低了该菌的毒力。在对肺炎链球菌c-di-AMP相关代谢蛋白的研究中发现，缺失c-di-AMP分解相关蛋白Pde1和Pde2会影响菌体内c-di-AMP的代谢平衡，影响细菌的生长，并且导致肺炎链球菌毒力的下降^[12]。结核分枝杆菌在c-di-AMP分解基因缺失后，伴随着细菌产生c-di-AMP水平的升高，其对实验小鼠的毒力明显下降^[35]。本实验室在对猪链球2型进行研究时发现，敲除c-di-AMP水解蛋白基因gdpP，在导致细胞内c-di-AMP水平升高的同时，也降低了细菌的溶血活性，以及对Hep-2细胞的黏附与侵入能力，同时动物实验结果显示，gdpP基因缺失株对实验动物的致病力也明显降低^[4]，由此可见，c-di-AMP在调节致病菌的毒力方面发挥着重要的作用。

自2008年发现c-di-AMP 以来，已在多种细菌中发现其存在，并引发越来越多的关注。其水平升降可导致一系列细菌表型发生改变，无疑表明该分子作为一类重要的第二信使，调控着一系列重要的细胞进程。但是c-di-AMP的研究仍处于起步阶段，仍有许多问题亟待回答：含DAC结构域蛋白的微生物中是否一定存在c-di-AMP信号通路？是否还存在其它的c-di-AMP的降解蛋白(在一些含DAC结构域蛋白的微生物中并未发现GdpP及其相似蛋白的存在)^[17]？是否存在其它直接调节c-di-AMP水平的信号分子？菌体内的受体分子及效应蛋白仍有待进一步发现。

虽然c-di-AMP在细菌细胞中发挥作用的机理仍待进一步阐明，但其在应用方面已显现出一定的潜力。由于其能激发机体先天性免疫应答，因此已有将其作为佐剂应用于粘膜以及全身免疫的报道^{[36, 37, 38]}。深入研究该分子与细胞壁的相互作用，有可能在细菌耐药性的问题上形成新的理论。另外，鉴于多种致病菌中c-di-AMP的发现及其对致病作用的影响，研究其在细胞中的信号转导通路就显得十分必要，可以为发展新的干预治疗方法提供新的理论和产品。