水资源与人类的生存和发展密切相关。随着经济社会的发展，水资源短缺伴随着水体富营养问题不仅对生态环境造成了严重的破坏，也对人类健康及经济社会的可持续发展提出了新的挑战。水体富营养化治理的关键在于氮、磷的去除，成本低廉且无二次污染的微生物修复技术是解决水体富营养化的有效途径之一^[1]。传统的生物脱氮除磷过程中，反硝化细菌和聚磷菌之间往往因碳源竞争、泥龄适应不统一等问题导致氮、磷的去除效率不高。随着脱氮除磷技术的不断发展，人们筛选到能以O₂、NO₂^-或NO₃^-作为电子受体的反硝化聚磷菌(Denitrifying phosphorus accumulating organisms，DPAOs)。该菌不仅能通过代谢作用完成反硝化和有效聚磷的双重目的，与传统的反硝化细菌-聚磷菌联合脱氮除磷工艺相比，这类微生物还能节约50%的碳源、30%的曝气量并降低50%的污泥产量^[2]。将筛选到的DPAOs用于污水处理是一种高效、低能耗及可持续的稳定技术，对水体富营养化的治理具有巨大潜力及重要意义^[3]。本文就DPAOs的脱氮除磷机制及其在废水处理中的应用作一简要综述。

生物除磷系统中有3类聚磷菌：第1类是仅利用O₂作为电子受体的传统聚磷菌；第2类是既可利用O₂也可利用NO₂^-作为电子受体的短程DPAOs；第3类是既能以O₂作为电子受体，也能利用NO₃^-、NO₂^-作为电子受体的DPAOs。其中，第2类和第3类在吸磷的同时能进行反硝化作用^{[3, 4]}。Kuba等^[2]发现在厌氧-缺氧的序批式反应器中存在以NO₃^-作为电子受体的稳定聚磷微生物。有趣的是，Carvalho等^[5]研究发现聚磷假丝酵母菌(Candidatus Accumulibacter phosphatis，简称A. phosphatis)仅有亚硝酸还原酶基因，缺乏编码硝酸盐还原酶的基因，没有利用NO₃^-作为电子受体的能力，但可利用NO₂^-并将硝态氮还原成N₂。他们认为，这可能是通过强化生物除磷系统中其它微生物将NO₃^-还原成NO₂^-后，A. phosphatis利用NO₂^-作为电子受体进行反硝化聚磷作用的结果。这说明，微生物在发挥反硝化聚磷作用时，不仅存在单一的反硝化聚磷过程，还可能涉及到不同功能微生物之间的互作效应。

DPAOs广泛分布于红环菌科、芽孢杆菌科、莫拉菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、红杆菌科等，如表1所示，迄今为止国内外研究者已筛选分离出大量具有良好反硝化聚磷能力的菌株。研究者发现A. phosphatis是强化生物除磷系统中对反硝化磷去除起主要贡献的微生物，并且在活性污泥中大量存在^[5]。

反硝化作用是氮素生物地球化学循环的一部分。反硝化细菌在自然界中普遍存在，它能将水体中溶解性的氮包括NO₃^-、NO₂^-作为电子受体经一系列酶的催化作用还原为N₂ /N₂O返回到大气中^[16]。自然界中还存在某些能够在体内聚集高浓度胞内聚磷化合物的异养聚磷菌，它在厌氧状态下能够摄取环境中的挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids，VFA)并以聚羟基烷酸(Polyhydroxyalkanoates，PHA)的形式储存于细胞内，在好氧条件下又能利用分解储存物所产生的能量过量的吸收环境中的无机磷酸盐，并以多聚磷酸盐(Poly-P)的形式贮存在体内^[3]。相较于非聚磷菌细胞中占细胞干重3%生物质磷，聚磷菌细胞内的生物质磷含量可达12%^[17]。部分聚磷菌还能在缺氧的条件下利用NO₃^-或NO₂^-作为电子受体吸收环境中的无机磷酸盐合成Poly-P。

DPAOs能够在厌氧条件下利用质子驱动力通过主动运输的方式将乙酸等VFA运输入细胞，并在乙酰辅酶A合成酶的作用下活化生成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA，AcCoA)，随后AcCoA被转化并以PHA的形式储存^[18]。厌氧阶段乙酸和丙酸被转化后以4种PHAs的类型存在，主要以聚-β-羟基丁酸(PHB)和聚羟基戊酸(PHV)形式存在。其中，PHB仅由AcCoA形成，PHV及其同分异构体聚羟基-2-甲基丁酸(PH2MB)由AcCoA和丙酰辅酶A(Propionyl-CoA)形成，聚羟基-2-甲基戊酸(PH2MV)仅由Propionyl-CoA形成^[19]。在这个过程中DPAOs利用体内Poly-P的水解所形成的ATP为PHA 的合成提供能量，主要通过糖原的降解为PHA的合成提供还原力NADH₂。糖原降解的途径主要有糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖途径(Entner-Doudoroff，ED)，前者能够产生更多的ATP。但不同菌株存在代谢方式的差异，Martin等^[19]在A. phosphatis中发现EMP以及三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA)所需的全部基因，但是缺乏ED途径的基因。Hesselmann等^[20]通过对属于变形纲菌中的1种革兰氏阴性菌进行¹³C原子示踪标记以及酶催化的研究发现了ED途径的存在。DPAOs也能通过TCA为PHA的合成提供NADH₂。有报道显示，A. phosphatis基因组编码的1个新型的细胞色素允许厌氧条件下TCA的进行^[19]。此外，Pereria等^[21]通过同位素标记研究发现厌氧阶段PHV合成过程中30%的还原力由TCA循环提供。

在好氧条件下，DPAOs能以O₂作为电子受体分解菌体细胞内储存的PHA生成AcCoA或Propionyl-CoA进入TCA，产生的能量大部分为微生物的生长和糖原的合成提供能量。另一部分则用于过量摄取环境中的无机磷酸盐，并以Poly-P的形式贮存于菌体细胞内。PHA作为内源性的聚合物在反硝化和磷吸收的过程中起着非常重要的作用，它不仅能为磷吸收提供能量，同时也能作为反硝化过程的碳源^[19]，图1是反硝化聚磷的原理示意图。

图 1. 反硝化聚磷原理示意图[18, 19] Figure 1. The schematic diagram of the mechanisms in the denitrifying phosphorus accumulating process[18, 19]. A: Anaerobic phase; B: Aerobic phase/oxygen deficient phase (black dotted lines stand for either one of the two pathways). VFA,Volatile fatty acids; EMP,Embden-Meyerhof-Parnas pathway; ED,Entner-Doudoroff; NADH2,Nicotinamide adenine dinucleotide; FADH2,Flavin adenine dinucleotide; PHB,polyhydroxybutyrate; PHV,polyhydroxyvalerate; PH2MB,polyhydroxy-2-methylbutyrate; PH2MV,polyhydroxy-2-methylvalerate; ATP ,adenosine triphosphate; ADP,adenosine diphosphate; AMP,adenosine monophosphate; ATP-ase,ATP synthase; Poly-P,polyphosphates; Pi,orthophosphate; AcCoA,Acetyl-CoA; Propionyl-CoA,propionyl coenzyme A; PPX,exopolyphosphatase; PPK,polyphosphate kinase; pmf,proton motive force; E.T.C,electron transport chain; AP,transporters; Nar,Nitrate reductase; Nir,Nitrite reductase; Nor,Nitric oxide reductase; Nos,Nitrous oxide reductase.

图选项

DPAOs多为兼性厌氧菌，在缺氧条件下它可利用硝态氮或亚硝态氮作为电子受体，通过氧化PHA产生能量来维持生命活动，并过量摄取环境中的PO₄^3-以Poly-P的形式贮存于细胞内^[18]。同时，这类微生物能将NO₃^-或NO₂^-还原，使吸磷和反硝化过程得到了统一^[18]。此外，研究表明，好氧条件下的磷吸收比缺氧条件下快^[22]。缺氧条件下单位NADH₂产生的ATP也比好氧时少了40%且需要消耗更多的PHB，但污泥产量和耗氧量大大减少^[23]。在缺氧阶段末期，将经过缺氧磷吸收的含有DPAOs的活性污泥排放，可以达到同时脱氮除磷的目的。

2.3.1 反硝化作用酶系：缺氧条件下，PHA降解成AcCoA进入TCA后被代谢，生成NADH₂并将电子传递给O₂、NO₃^-或NO₂^-。NO₃^-还原为NO₂^-，NO₂^-再依次被还原成 NO、N₂O 和N₂^[16]。这个过程分别由硝酸还原酶(Nitrate reductase，Nar)、亚硝酸还原酶(Nitrite reductase，Nir)、一氧化氮还原酶(Nitric oxide reductase，Nor)和一氧化二氮还原酶(Nitrous oxide reductase，Nos)催化完成^[24]。其中分离自中华根瘤菌的铜型亚硝酸还原酶由nirK基因编码，在无氧条件下才能表达^[25]。膜结合硝酸还原酶和Nos对氧分子敏感，其余反硝化作用酶在有氧无氧条件下均能表达^{[24, 25, 26, 27]}。Han等^[16]也通过亚基基因的扩增证实了耐盐好氧反硝化施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri YHA-13)中周质硝酸还原酶基因的存在。

2.3.2 多聚磷酸盐激酶：在好氧或缺氧条件下微生物的聚磷过程是由多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinase，PPK)催化完成的^[28]。PPK能够催化ATP末端上的γ磷酸聚合到Poly-P上，PPK同样可催化该反应的逆反应，反应过程如下^[28]：

迄今为止研究者已从大肠杆菌中获得了纯的PPK及其编码基因，但将大肠杆菌直接用于水体治理可能会带来二次污染。Du等^[29]利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)作为宿主，将来源于铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的PPK基因插入广宿主载体pBBR1MCS-2多克隆位点区构建质粒后获得基因工程菌 Pseudomonas putida KTPPK。序批式生物膜反应器(SBBR)实验结果表明，投入了KTPPK的SBBR的磷去除率比对照组高10%-20%，氮的去除率也明显提升，且KTPPK在SBBR中能够稳定遗传。Jung等^[28]研究发现，在磷酸核糖酰胺转移酶purF突变体大肠杆菌细胞中PPK基因的表达大大增加，而嘌呤会限制由磷酸核糖酰胺转移酶purF突变而增加的PPK基因的转录，因此嘌呤缺陷可能是大肠杆菌PPK基因表达的良好诱导物。值得注意的是，PPK存在于生命体多个领域的细胞中，在细菌中PPK广泛分布，古生菌和真核生物中少见报道。

反硝化聚磷酶系的存在，使得DPAOs能通过不同酶系的协同作用在单一微生物中同步完成反硝化与聚磷过程、实现氮和磷的去除。氮的主要存在形式NO₃^-、NO₂^-不仅可作为同步脱氮聚磷过程的电子受体，也可能作为反硝化功能基因与PPK基因表达的刺激响应子，通过对基因表达的调控影响反硝化聚磷效果。Lv等^[30]通过高通量测序法测得以NO₃^-、NO₂^-,O₂作为电子受体的活性污泥磷去除率分别为84.8%、78.5%和87.4%；与NO₂^-相比，以NO₃^-作为电子受体的反硝化聚磷过程对电子的利用率更高。

亚硝态氮在好氧、缺氧、厌氧条件下均会影响反硝化聚磷过程。Saito等^[31]观察到好氧磷吸收对NO₂^-很敏感。NO₂^-浓度接近2 mg N/L时开始对好氧吸磷发生抑制作用，在6 mg N/L时则完全被抑制。另一项研究表明游离亚硝酸才是真正的抑制剂，在好氧条件下对聚磷菌的生长、磷吸收以及糖原的产生都会产生严重的抑制，并且对PHA的降解也产生一定的抑制作用^[32]。如图1-B的电子传递链所示，作者认为游离亚硝酸与N₂O还原酶含铜的活性位点结合引起N₂O还原的竞争性抑制。

早期Hu等^[4]对NO₃^-、NO₂^-、O₂这3种不同电子受体存在条件下的反硝化除磷情况进行了研究，结果表明当反应器中NO₂^-的浓度低于115 mg/L时，NO₂^-能替代O₂、NO₃^-作为电子受体，缺氧磷吸收并不会被抑制。随后有研究者发现游离亚硝酸浓度从0.002增加到0.02 mg/L，缺氧磷吸收速率下降，反硝化速率也降低了大约40%^[33]。当游离亚硝酸的浓度达到0.02 mg/L时，磷吸收则完全被抑制^[33]。游离亚硝酸对缺氧条件下反硝化作用的影响存在几种假说(如图1-B所示)：第1种认为游离亚硝酸是一种解偶联剂，能够通过细胞膜并提高质子透过膜的穿梭性能从而破坏质子的跨膜梯度，使得氧化与磷酸化解偶联，ATP的产生减少，为了维持质子驱动力，需要加快反硝化速率从而产生更多的质子。第2种认为游离亚硝酸抑制了磷吸收和微生物生长使得能量需求变低，需要通过质子驱动力合成ATP减少，随即反硝化速率变慢。第3种认为游离亚硝酸可能使Nir在mRNA的翻译水平发生移位或者错误的折叠，在高浓度游离亚硝酸存在的条件下已合成的Nir也可能因构象的改变而失活直接导致反硝化速率降低^[33]。游离亚硝酸还会破坏细胞膜并进入细胞，通过对PPK的破坏对Poly-P的合成产生抑制，影响吸磷过程。并且，随着反硝化作用被游离亚硝酸抑制，能量的产生减少，为了维持细胞内的能量平衡，Poly-P发生分解，磷吸收的能量受到限制最终也会导致吸磷的速率降低^[33]。

同样，在厌氧条件下游离亚硝酸也会作为解耦联剂破坏质子驱动力，使ATP的产生减少影响了VFA的主动运输与PHA的合成，DPAOs需要分解Poly-P释放更多的P为VFA的吸收提供能量(如图1-A)。

另外，也有研究者发现磷的化合物形式3，4-二甲基吡唑磷酸盐在同步硝化-反硝化脱氮与反硝化聚磷的活性污泥中会通过对氨氧化即硝化作用的直接抑制减少了NO₃^-、NO₂^-的产生，间接性的抑制了反硝化作用，进而对反硝化聚磷过程造成影响^[34]。最近的研究显示，ZnO、SiO₂等金属纳米粒子会通过对Nar、Nir、PPX、PPK抑制作用，影响了氮的去除和磷的释放与吸收^[35]。有趣是，Cu纳米粒子则会提高Nar、Nir的活性，使氮的去除率提高^[36]。因此，关于磷对氮以及金属纳米粒子等因素对反硝化聚磷过程的具体调控机制还处于探索阶段，需要我们进一步深入研究。

目前基于DPAOs开发的多种工艺主要用于城市生活污水、工业废水的处理以及湖泊湿地等富营养化水体的实验室内模拟研究。采用单污泥系统的MUCT分段进水脱氮除磷工艺处理低COD/N的污水其短程反硝化除磷率比以NO₃^-为电子受体的反硝化除磷率高30%^[37]。Zafiriadis等^[38]用双污泥系统的Dephanox工艺处理城市污水发现，该装置不仅影响PHA的含量，还能促进DPAOs的富集，相比之下双污泥系统运行更稳定，处理效果也更好。

采用聚乙烯醇和海藻酸钠等包埋固定经富集驯化的DPAOs或其活性污泥不仅可以维持菌体数量且便于菌体的再回收，此外，固定化条件能提高菌体抵御外界环境变化的能力^[1]。固定化小球内部还能形成缺氧状态，有利于反硝化聚磷作用的进行。研究者将分离鉴定的菌株用海藻酸钙固定后处理采自湿地的富营养化水样，对硝态氮和磷的去除率分别达98.48%和97.46%^[13]。本文作者所在课题组以聚乙烯醇和海藻酸盐制备的微生物固定化小球对含氮磷的人工废水显示出良好的净化效果，结果显示，脱氮除磷过程以微生物作用为主，且固定化材料本身对氮磷也具有一定的吸附作用^[39]。

富营养化水体治理的实验室模拟方面，研究人员已取得了一定的成绩，但直接将微生物投放于富营养化的江河湖泊进行原位修复有可能带来二次污染。因此将DPAOs用于富营养化水体的生物修复仍有待进一步研究。另一方面由于现有研究技术的局限性，关于反硝化功能基因、多聚磷酸盐激酶基因之间具体的联系及其表达调控的研究较少。

明确反硝化聚磷机理与反硝化聚磷酶系有助于从微生物代谢、电子传递链及基因编码等角度深入了解反硝化聚磷的各个过程及反硝化作用与聚磷作用的联系。鉴于已有的研究基础和目前尚未解决的问题，未来的研究可从以下几个方面展开：(1)发掘优良的种质资源，在江河湖泊等常见生境甚至是海洋低氧区、沉积物等环境中不断筛选和驯化出高效的DPAOs还可进行基因工程菌的构建与改造，并对其功能基因的遗传和表达调控进行深入研究；(2)深入了解DPAOs的生长特性及其对氮磷等环境因素的响应关系，探索反硝化聚磷过程中发挥作用的酶是如何偶联的；(3)考察DPAOs固定化处理在实际应用中的可行性，分析固定化基质对DPAOs的影响及其本身在脱氮聚磷过程中的作用；(4)将更多的FISH-MAR、PCR-T-RFLP等现代分子生物学技术运用到DPAOs的研究中；(5)采用植物-微生物等联合修复技术，提高DPAOs的脱氮除磷效率。

致谢： 感谢南京大学环境学院生物地球化学与环境修复实验室的韩永和博士，在文章框架设计、文稿撰写、修改及英文摘要润色等方面提供的帮助。