微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用(部分为异养或混养)的水生(或陆生、气生、共生)低等植物。微藻种类繁多，表现为系统发生的多样性、遗传和表型的多样性、生长方式的多样性、生态多样性、代谢多样性、化学多样性和生物功能多样性^[1]。随着生物质新能源和多样化新型生物基产品开发的迫切需求，微藻生物技术产业重新得到了世界各国政府和科研人员的普遍关注^[2]。鉴于其具有生物量大、光合效率高、生长周期短、油脂含量高、培养要求低和环境友好等突出优点^[3]，加之微藻细胞的培养可以实现污染水体的深度净化、高效生物固定CO₂与高价值生物质生产的多项耦合，这一生物有机体被认为是新产品开发和应用的新秀^{[4, 5]}。

微藻营养代谢方面的研究一直以来是该领域的重点和热点内容。微藻细胞具有营养方式的多样性，即能在以CO₂或碳酸盐为唯一碳源的条件下可进行自养生长的同时，部分微藻可进行混合营养(混养)或异养生长^[6]。在混养或异养培养条件下，蓝藻、绿藻和红藻等的生长速率明显提高，生物量也显著增加。由于混养或异养培养能促进许多微藻的生长及其细胞组分的合成，可缩短培养周期、实现细胞高密度培养，使其成为微藻培养的新技术，在工业生产上具有重要的应用潜力和价值^{[7, 8]}。

近年来，众多研究者针对微藻能源的开发需求，报道了大量有关采用不同营养方式和培养技术以提高藻细胞浓度和油脂含量的研究成果^{[9, 10, 11]}，但是系统深入研究真核微藻混养或异养生长代谢机理的文献相对较少^{[12, 13]}。本文以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为模式真核微藻，比较研究了其在自养、混养和异养培养条件下生长代谢特性以及细胞组分生物合成的差异，较全面地考察了不同营养方式对藻细胞生长动力学、光合色素含量、蛋白质及氨基酸组成、油脂及脂肪酸组成等的影响，并首次报道了不同营养方式下小球藻细胞吸收积累营养元素和碳代谢途径关键酶(胞外碳酸酐酶和核酮糖1,5-二磷酸羧化酶)活性变化的差异性，旨在进一步认识真核单细胞微藻的混养和异养生长特性及生理生化机理，为经济型微藻的高密度、规模化培养提供理论依据。

1.1.1 材料和试剂：实验用普通小球藻(C. vulgaris-31#)购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。藻种基础培养基为土壤浸出液培养基(SoilEM)。培养基营养盐、NaOH、HCl、H₂SO₄、蒽酮、考马斯亮蓝G-250、正己烷、甲醇等所用试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 仪器设备：TDL-5000B低温冷冻离心机(上海安亭)、LDZX-40BI型高压蒸汽灭菌器(上海申安)、分析天平(日本岛津)、DHZ-C型大容量恒温振荡器(江苏太仓)、超净工作台(江苏安泰)、Orion 686酸度计(美国奥利龙)；JPSJ-605溶氧仪(上海雷磁)、照度计(深圳华谊)、日立UV-1800可见紫外分光光度计、GY92-2D超声波细胞破碎仪(浙江宁波)、电热烘箱(上海一恒)、冷冻干燥机(湖南湘仪)、Agilent 2890A/5975C GC/MS、835-50型高速氨基酸分析仪(日本日立)、F-4600型荧光分光光度计(日本日立)、DCR-3D Nd: YAg激光诱导击穿光谱(Spectra-Physics)。

C. vulgaris-31#的种子平板分离培养基和液体培养液均采用SoilEM，其组成为(/L): 0.25 g NaNO₃，0.175 g KH₂PO₄，0.075 g K₂HPO₄，0.075 g MgSO₄·7H₂O，0.025 g NaCl，0.025 g CaCl₂·2H₂O，5 mg FeCl₃·6H₂O，A₅ 溶液1mL (0.287 mg ZnSO₄·7H₂O; 0.169 mg MnSO₄·H₂O; 0.061 mg H₃BO₃; 2.5 μg CuSO₄·5H₂O)和1.24 μg (Na)₆Mo₇O₂₄·7H₂O)，土壤浸出液40 mL。固体培养基中添加2%琼脂。各种培养基接种前在121℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

将购置的新藻种在SoilEM固体培养基上划线分离纯化培养，挑取生长良好的藻种，接种于SoilEM液体培养基中，将培养至对数生长期的C. vulgaris作为藻种使用，接种量为10% (V/V)。培养条件为25±1℃，2500 lux，光暗比为12 h L：12 h D，摇瓶转速为120 r/min。

以SoilEM培养基为基础培养基，设置3组实验：光合自养组将C. vulgaris直接培养在SoilEM中；混合营养和异养实验组以SoilEM为基础培养基，并添加10 g/L的葡萄糖作为有机碳源，自养和混合营养组进行光照培养(2500 lux)，异养组实验进行暗培养，其他培养条件同上，每隔24 h定时取样测定。3组实验进行3次重复培养，结果以平均值±标准偏差表示。

1.3.1 藻细胞浓度的测定：藻细胞生长曲线采用比浊法测定，测定波长为660 nm。藻细胞浓度采用称重法测定，具体测定方法为：取一定体积定时培养的藻液，以2500×g离心10 min，弃去上清液，所得藻泥用等体积去离子水重新洗涤、悬浮后再在相同条件下离心获得藻泥。用比浊法测定时将藻泥再次用等体积的去离子水悬浮，摇匀，用去离子水稀释适当倍数后在660 nm下测定吸光值(OD)。称重法测定藻细胞浓度时，将洗涤离心所得藻泥置于已干燥称重的离心管中，在70℃恒温烘箱中干燥至恒重，并称重计算藻细胞浓度(g/L)。通过测定对数生长期的藻细胞浓度(g/L)和培养时间，计算比生长速率(μ,day^-1)和产率(P,g/L/day)。μ=(lnX_t - lnX₀) / (t_x - t₀)，P=(X_t-X₀) / (t_x-t₀)，式中，X_t和X₀分别为培养t_x和t₀时的细胞干重浓度 (g/L)^[14]。

1.3.2 pH值和溶解氧(DO)的测定：培养基pH值和溶解氧含量分别采用酸度计和溶氧仪测定。

1.3.3 光合色素含量的测定：采用3波长比色法测定光合色素含量。取培养一定时间的藻液，以2500×g离心10 min，弃去上清液，藻泥再次用去离子水洗涤、离心后，在沉淀藻细胞中加入80%的乙醇，摇匀后置于4℃冰箱中避光反复提取色素两次，取上清液合并，适当稀释后测定，计算藻细胞中的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量。具体操作和计算方法参考文献^[15]。

1.3.4 粗脂肪含量的测定：粗脂肪含量测定采用正己烷提取—称重法。以2500×g离心10 min收集培养结束的藻液，去离子水洗涤2次，离心收集的藻泥经冷冻干燥后，将干藻粉用小型研磨器充分研磨至细粉，达到细胞破壁的目的，在室温下用正己烷反复抽提3次，每次振荡提取1 h，合并提取液，45℃旋转蒸发回收溶剂后在70℃烘干至恒重，称重计算粗脂肪含量。

1.3.5 GC-MS分析脂肪酸组成：采用BF₃-CH₃OH法对1.3.4所得脂肪样品进行甲酯化，具体方法参考文献^[16]，甲酯化样品采用GC-MS进行分析。色谱条件：色谱柱：HP-5 ms弹性石英毛细管柱；进样口温度290℃；程序升温：初始温度80℃，保持2 min，以6℃/min的升温速率升温至290℃，保持5 min；载气为高纯氦气，流速为1 mL/min，分流比50∶1。质谱条件：MSD离子源为EI源，离子源温度230℃，电子能量70 eV，m/z范围29-700 amu；利用美国NIST05谱库进行定性分析。

1.3.6 总蛋白质含量和氨基酸组成的测定：藻细胞总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，具体测定和计算方法参照文献^[15]。

1.3.7 可溶性蛋白质含量的测定：培养所得藻液以2500×g离心10 min，用去离子水洗涤藻泥2次，取藻泥用一定量的50 mmol/L pH 8.0 磷酸缓冲溶液稀释，并进行细胞破碎(400 W，20 min，超声5 s，间歇1 s)，细胞破碎液在50℃热水浴中提取2次，每次1 h，提取液以2500×g离心10 min，合并两次提取液，定容后取适量样品，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定^[15]。

1.3.8 可溶性糖含量的测定：取一定体积的培养藻液，2500×g离心10 min收集藻细胞，用去离子水洗涤藻细胞2次，取藻泥用50 mmol/L pH 8.0 磷酸缓冲溶液稀释，并进行细胞破碎(400 W，20 min，超声5 s，间歇1 s)，细胞破碎液在沸水浴中提取2次，每次1 h，提取液以2500×g离心10 min，合并两次提取液，定容后采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖含量^[15]。

1.3.9 藻细胞中主要元素的分析方法：培养液经离心收集藻细胞后用去离子水洗涤2次，再次离心后所得藻细胞冷冻干燥，干燥样品经压片后采用激光诱导击穿光谱技术测试元素组成。元素测试和分析工作由西北师范大学物理与电子工程学院原子分子物理研究所协助完成。

1.3.10 藻细胞中相关酶活性的测定：胞外碳酸酐酶：采用完整细胞pH漂移法测定藻细胞胞外碳酸酐酶活性^{[17, 18]}。收集的藻细胞经缓冲液(pH 8.3,20 mmol/L 巴比妥缓冲液)洗涤后，取适量测定胞外碳酸酐酶活性。取5 mL经洗涤定容的藻液，在4℃下迅速加入5 mL 0℃ CO₂饱和水，用pH计监测反应体系pH从8.3降至7.3所需的时间，记为T。按EU=10×(T₀/T-1)公式计算酶活性。酶活性单位为EU/μg 叶绿素a。T₀为反应体系中未加藻细胞时pH值下降所需的时间。叶绿素测定方法同1.3.3。

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶：取不同处理组的藻液经离心收集藻细胞，洗涤、再离心后取藻细胞，加入预冷(0-4℃)的酶抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，含2 mmol/L二硫代苏糖醇，5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L NaHCO₃，1 mmol/L EDTA和10 mmol/L-巯基乙醇)，4℃超声波破碎细胞30 min使其破壁，4℃离心后收集上清液即为粗酶提取液，测定可溶性蛋白质含量和酶活性。酶活性的测定方法参照文献^[19]，活性以μmol CO₂/ mg蛋白·min^-1表示。

采用自养、异养和混合营养3种方式对C. vulgaris进行培养，在相同条件下对其生长过程中的动态变化进行检测。结果显示(图1)，培养基中添加有机碳源可以使藻细胞生长提前进入对数生长期和稳定期。混合营养和异养培养的C. vulgaris在第3天进入稳定期，在培养的第1天和第2天藻细胞快速增殖，很快度过对数期进入稳定期；而自养培养的C. vulgaris在整个培养过程中缓慢增长。在3种营养方式中，异养和混合营养条件下C. vulgaris的生长速率明显优于光合自养。而在异养和混养组中，后者又表现出一定的优势，尤其是在生长的稳定期，异养方式因为能源物质消耗殆尽，进入衰退期，而混养却生长强劲，增长速度平稳。

图 1. 营养方式对C. vulgaris生长特性的影响 (n=3) Figure 1. Effects of trophic modes on the growth behavior of C. vulgaris (n=3).

图选项

由表1可以看出3种培养条件下，混合营养和异养培养的C. vulgaris生物量浓度分别是光合自养对照组的7.31倍和6.24倍，比生长速率分别是光合自养对照组的3.38倍和3.34倍，生物量产率分别是光合自养对照组的7倍和6倍。此外，混合营养结合光合自养和异养营养模式的特征，比单独进行自养或异养生长更具有优势。

pH值是影响藻类生长代谢的重要因子之一，培养基的pH值会影响光合作用中CO₂的可用性，在呼吸作用中会影响微藻对有机碳源的利用效率，同时由于pH值直接影响细胞膜的渗透性，会影响微藻细胞对培养液中离子的吸收和利用，以及代谢产物的再利用性和毒性。不同培养方式下培养基pH值的变化如图2-A所示。自养条件下培养液的pH值偏碱性而且不断增长，培养结束时pH值接近10。

不同营养方式下培养基中溶解氧含量的变化如图2-B所示。光合自养条件下培养基中的溶解氧含量较混养和异养要高，而且随着培养时间的延续，溶解氧含量有增高的趋势，这主要和藻细胞的自养光合放氧有关；异养培养条件下培养基中的溶解氧含量相对最低，在藻细胞生长进入稳定期(第4天)时氧含量最高；混合营养培养基中的溶解氧含量介于光合自养和异养培养基中的溶氧含量之间。值得注意的是在藻细胞生长进入第6天(稳定期后期)时，混合营养培养基中的溶氧含量呈现上升趋势，而异养的则呈下降趋势。这说明，在培养后期当培养基中的有机碳源消耗殆尽时，混合营养实验组中提供的光能可能促使藻细胞进行光合放氧，导致培养基中溶解氧含量的上升。

图 2. 营养方式对培养基pH值(A)和溶解氧(B)的影响 (n=3) Figure 2. Effects of trophic modes on the pH values (A) and DO (B) in culture medium (n=3).

图选项

2.3.1 光合色素含量：图3为不同营养方式对C. vulgaris叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量的影响。由图3可知，不同营养方式对单位质量藻细胞中光合色素合成量具有显著影响。自养方式下藻细胞积累的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量显著高于异养和混合营养方式；而异养和混合营养相比较，后者光合色素的含量较高。实验中还发现异养条件下的藻液呈淡黄绿色，这与C. vulgaris在异样转化过程中出现叶绿体逐渐消失、细胞呈黄化的现象有关^[20]。从光合色素含量的变化可以反映出营养方式直接影响藻细胞的光合作用，有机碳源(葡萄糖)的添加抑制了藻细胞的光合作用，导致光合色素含量的降低。分析总叶绿素的产率得出，混合营养条件下总叶绿素的产率为2.23 mg/L·day^-1，而自养和异养条件下的总叶绿素的产率分别为1.38 mg/L·day^-1和1.00 mg/L·day^-1。从上述分析认为，虽然混合营养培养方式下单位质量藻细胞的叶绿素含量较自养要低，但是由于混合营养的藻细胞浓度较高，所以其叶绿素产率相对较高。因此，从微藻生物合成叶绿素的角度考虑，混合营养培养模式具有藻细胞浓度高和叶绿素产率高的特点，比光合自养和异养模式更具优势。

图 3. 营养方式对C. vulgaris光合色素含量的影响 (n=3) Figure 3. Effects of trophic modes on the photosynthetic pigments contents of C. vulgaris (n=3).

图选项

2.3.2 油脂、蛋白质和可溶性糖含量：图4显示了不同营养方式对C. vulgaris蛋白质、油脂和可溶性糖含量的影响。由图4可知，光合自养条件下蛋白质含量比混养和异养条件下的要高，经过添加葡萄糖使藻细胞营养方式向混养和异养发生转化后，其油脂含量和可溶性糖含量显著提高。而混养和异养条件下，C. vulgaris的油脂、蛋白质和可溶性糖含量的差异不显著。这与已有的研究结果相符。Orús等的研究认为C. vulgaris从自养方式转变为混合营养时，藻细胞蛋白质含量的减少通过提高油脂和糖类含量来补偿^[21]。这一结果另外也能反映出营养方式的转变和有机碳源的供给直接影响到C. vulgaris的碳代谢和氮代谢途径。

图 4. 营养方式对C. vulgaris蛋白质、油脂和可溶性糖含量的影响 (n=3) Figure 4. Effects of trophic modes on the proteins, lipids and soluble sugars contents of C. vulgaris (n=3).

图选项

分析3种细胞生化组分的单位体积产率可知，自养、混养和异养培养条件下，油脂产率分别为3.00、73.13、65.00 mg/L·day^-1，蛋白质产率分别为13.88、51.89、47.17 mg/L·day^-1，可溶性糖产率分别为1.83、64.63、64.82 mg/L·day^-1。由此可见，混养和异养转化培养后，从产率考虑，藻细胞生物合成油脂、蛋白质和可溶性糖的能力明显高于光合自养对照组。

2.3.3 脂肪酸组成：藻细胞经从光合自养向混养和异养转化培养后不但油脂含量显著提高，而且直接影响C. vulgaris油脂的脂肪酸组成。分析表2可知，3种营养方式下微藻油脂的主要脂肪酸为油酸、棕榈酸和亚油酸。但是随着营养方式从自养到混养、再到异养的转变，三烯酸、二烯酸等不饱和脂肪酸含量有下降的趋势，而饱和脂肪酸含量趋于增高，这说明葡萄糖对藻细胞的脂肪酸合成途径也产生了影响。本文的研究结果与吴庆余教授的报道相似^[13]。

从生产生物能源的角度考虑，上述这些藻细胞在营养方式转变过程中细胞组成方面的变化，包括蛋白质含量的降低、油脂和可溶性糖含量的提高，以及饱和脂肪酸含量的增加都有利于微藻生物柴油和燃料乙醇的生产。

2.3.4 氨基酸组成：藻细胞营养方式的转变不仅影响蛋白质含量，而且直接影响C. vulgaris蛋白质中的氨基酸组成(如表3所示)。结合图4和表3中的数据变化可以看出，相同氮源水平下(0.25g/L NaNO₃)，自养培养所得藻细胞的蛋白质含量较高，其蛋白质中各种氨基酸的相对含量最高。而经过混养和异养转换培养后C. vulgaris的蛋白质含量显著降低，蛋白质中各种氨基酸的比例也相应地下降，各组氨基酸含量高低顺序依次为自养>混养>异养，自养、混养和异养组氨基酸总量分别为35.61%、21.03%和18.25%。蛋白质和氨基酸分析结果表明，C. vulgaris经过营养方式转变后藻细胞蛋白质的18种氨基酸的相对含量发生了明显变化，添加葡萄糖和光/暗培养处理直接影响到C. vulgaris的氮代谢途径，使氨基酸和蛋白质的合成代谢途径改变。

2.3.5 细胞元素组成：在上述研究的基础之上，采用激光诱导击穿光谱技术测定了C. vulgaris的元素组成，结果如表4所示。由数据可以反映，藻细胞在自养、混养和异养条件下对培养液中元素的转化吸收存在差异。在3组培养实验中，碳元素的相对含量在异养组中最高，为36.25%，混养次之为30.77%，自养的为23.59%。这一结果说明在培养基中添加有机碳源可促使微藻细胞转化合成较多的碳素，而且从添加有机碳源的混养和自养组实验结果显示，混合营养方式下光照对碳素的转化利用有抑制作用，无光照的异养培养可获得较高的碳素转化率。除碳元素之外，其它元素随着自养向混养、异养的转换而逐渐下降。自养与混养和异养方式下藻细胞元素的相对含量相比，差异性非常显著。而混养和异养间的元素差异相对较小。这说明有机碳源的供应，以及有机碳源供应前提下的光暗处理均会对藻细胞吸收转换培养液中的营养物和元素产生影响。

不同营养方式对C. vulgaris胞外碳酸酐酶(CA)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性的影响如图5所示。从CA和Rubisco活性的变化可知，营养方式的转变直接影响C. vulgaris的碳代谢。由图5-A可知，与光合自养对照组的CA活性持续缓慢上升的态势相比，混养和异养实验组在培养进入第1天时CA活性显著下降，培养第2天时混养组CA活性非常微弱，而异养组已检测不到活性。在之后的培养过程中以吸收空气中的CO₂为唯一碳源的光合自养组始终能检测到CA活性，而且随着藻细胞的生长CA活性有缓慢增加的趋势；而异养组的藻细胞中始终未检测到CA活性，混养组的在培养后期能检测到微弱的CA活性回升。

图 5. 营养方式对C. vulgaris胞外碳酸酐酶和Rubisco活性的影响 (n=3) Figure 5. Effects of trophic modes on carbonic anhydrase and Rubisco activities of C. vulgaris (n=3). A: Carbonic anhydrase; B: Rubisco.

图选项

由图5-B可知，营养方式及培养时间对C. vulgaris Rubisco的活性也同样有显著的影响。待接种的C. vulgaris藻细胞中Rubisco的活性较高，培养进入第1天时，光合自养组的Rubisco活性有所下降，这可能与藻细胞的营养与培养条件的适应过渡有关，而在培养进入第2天时Rubisco活性逐渐上升。而混养和异养组的Rubisco活性在培养的前2天内显著下降，结合藻细胞的生长曲线认为这种明显下降与其主要以异养生长有关，葡萄糖的添加显著抑制了C. vulgaris的光合作用。

从培养第2天开始，光合自养和混养组C. vulgaris细胞的Rubisco活性逐渐上升，自养组的Rubisco活性高于混养组，而在之后的培养过程中异养组的Rubisco活性逐渐消失。从光合自养和混养组Rubisco活性上升的变化反映出自养藻细胞的光合作用较强。而混养组在培养中后期Rubisco活性也出现逐渐回升的态势，这表明当培养基中的葡萄糖在逐渐被消耗利用后，在光照条件下藻细胞的光合作用逐渐加强，Rubisco不断合成。而异养组在培养中后期未检测到Rubisco活性，说明在葡萄糖和暗处理的双重作用下Rubisco的合成被抑制。

微藻营养方式的多样性对于生物学来说具有极其深远的意义。某些藻类为了适应恶劣的生活环境，如低光照、低营养条件，在长期的自然选择下形成了混养甚至异养的生存能力，这在后来的生物进化和遗传上起到了重要的作用^[22]。随着浮游生物生态学和赤潮研究工作的不断推进，对混养和异养型浮游生物(含微藻)与环境和营养因子的相互关系的研究也逐步深入，其中包括光照、营养物浓度、盐度和酸碱度对混养型浮游生物的摄食、光合作用、生长繁殖等的影响^{[23, 24, 25]}，以及混合营养型浮游生物对微食物网营养动力学产生的影响^[26]。

本文的研究结果显示，在添加有机碳源葡萄糖的条件下，混养和异养培养可显著促进藻细胞的生长，最终分别可获得7倍、6倍于自养的生物量产率，异养(1.81 g/L)和自养(0.29 g/L)方式下的藻细胞生物量之和接近于混养(2.12 g/L)的生物量，这一研究结果与庄惠如等^[27]的相近。碳源是影响C. vulgaris生长的一个重要因素。从藻细胞的生长态势分析，在供给有机碳源和光能的混养方式较自养和异养表示出较强的生长优势，特别是在培养至后期时，随着培养基中有机碳源的消耗殆尽和代谢产物的积累，自养组细胞生长量缓慢增高，暗培养下的异养组细胞生长量呈缓慢下降态势，而混养组在培养后期的生长态势趋同于自养组，这说明混养过程兼备自养和异养的特点，在有机碳源充足的条件下主营异养，在有机碳源匮乏的条件下转换为自养，使得藻细胞继续生长^[28]。这一现象也可从图5的不同营养方式对C. vulgaris细胞碳代谢途径关键酶——胞外碳酸酐酶和Rubisco活性的影响方面得到解释。葡萄糖的添加抑制了C. vulgaris的光合作用，使藻细胞主营异养生长，而且随着培养基质中有机碳源浓度的逐渐降低，在培养的不同阶段藻细胞可实现从异养、混养和自养之间的转换。从图1中可以看出，异养和混合营养在生长后期的差别也从另一个方面说明葡萄糖作为碳源对C. vulgaris生长有促进作用，葡萄糖的存在可能弥补了气体碳源CO₂供应的不充足，并可能使细胞在碳源利用中节省所消耗的ATP和NADPH^[29-30]。光照作为另一个影响C. vulgaris生长的因素，其重要性在本实验中也得到了证实。在一个光暗培养周期中，光照条件下的生长也略快于暗条件。这说明光能够促进碳源的代谢和能量的输送，利于混合营养的进行^[31]。

从图2中不同营养方式对培养基pH值(A)和溶解氧(B)的影响结果显示，培养液中pH值的变化是由于自养条件下C. vulgaris进行光合作用，随着其生长而不断消耗培养基中的CO₂所致，而且碱性环境更容易使气相中的CO₂溶解于培养液中供藻细胞进行光合作用。异养条件下pH值增长的趋势不明显且会有下降，是由于C. vulgaris进行异养繁殖积累CO₂的原因；而混养条件下pH值介于两者之间，这说明细胞的光合作用和呼吸代谢强度可能存在相互竞争和补助，呼吸作用产生的CO₂会被光合途径中的“CO₂泵”重新吸收利用，补偿到光合途径中。另外混合营养和异养培养过程中pH值的变化与葡萄糖代谢产生的有机酸有关^{[32, 33]}。

不同营养方式对C. vulgaris胞外碳酸酐酶(CA)活性的影响(图5-A)反映出，一方面由于有机碳源葡萄糖的添加显著抑制了光合作用，另一方面使C. vulgaris的有氧呼吸作用加强，细胞在进行异养生长过程中释放出的CO₂显著抑制了CA的活性。单细胞微藻有多种形式的CA，其表达受环境中CO₂水平的影响。小球藻(C. saccharophila)在低CO₂浓度条件下，CA受诱导，胞外活性明显升高，而在较高CO₂条件下活性受抑制^[34]。张大兵^[35]等的研究表明，自养C. protothecoides的Rubisco蛋白含量占细胞可溶性蛋白质的24%。而异养转变后的藻细胞内不含Rubisco。异养藻向自养生长转变过程中，20 h后细胞内叶绿素含量逐渐增加，24 h时细胞内出现Rubisco，并大量增加，至41 h时含量达最高峰，这表明藻细胞光合作用能力的恢复和加强。本研究显示，混养和异养同样抑制Rubisco活性，但是这种抑制随着光源供给和培养液中有机碳源浓度的变化而变化，进而造成在不同营养和环境条件下其营养方式的转换。

上述研究结果表明，C. vulgaris为了适应不同类型的环境和营养因子，特别是为了应对光照强度和水体中碳源种类及浓度，进化出了多功能的生理代谢途径和营养方式以达到生存和生长的目的，体现出其生长特性和营养方式的多功能及多途径。

微藻营养方式多样性的研究不仅在进化生物学和生态学领域具有重要的理论意义，而且在环境治理、高密度培养功能微藻生物合成活性物质和微藻能源领域具有重要的应用价值。Kim等的研究显示混养培养的小球藻(C. vulgaris)可有效除去废水中的总碳和高浓度的氮，而且随着污水中碳氮的不断去除，藻细胞的生长量不断增加，研究认为藻细胞可有效利用废水中的营养物质合成生物质，可达到废水处理和生物质合成的双重目的^[36]；异养小球藻(C. zofingiensis)能快速生长并能高效积累虾青素，具有大规模生产虾青素的潜力^[37]；异养小球藻(C. protothecoides)可快速生长而且能积累细胞干重55%的油脂，提取所得油脂经酸催化酯交换反应后可获得高品质的生物柴油^[38]。

Wang等^[39]报道了小球藻在自养、异养和混养条件下的生长状况及细胞生化成分的差异，有关异养和混养可显著提高藻细胞生物量和比生长速率的结果相近。但是该报道的研究显示异养可显著提高脂肪含量，而且有利于亚麻酸的积累。本研究显示，异养同样可提高藻细胞的脂肪含量，但是随着营养方式从自养至混养和异养转变的过程中，不饱和脂肪酸的比例逐渐下降。这一研究结果与文献有所不同。分析原因可能是由于藻种的差异和培养条件(主要是文献中的培养时间较长为9天，本实验为6天)的差异所致。因此，动态考察不同营养方式下藻细胞主要生化组分含量和比例的变化对进一步认识其生长和代谢机理具有重要意义。

本研究结果表明，混养和异养培养方式可显著提高C. vulgaris的生物量浓度、比生长速率和产率；C. vulgaris依次从自养、混养至异养的转换培养后，其蛋白质和光合色素含量显著下降，藻细胞蛋白质中18种氨基酸的相对含量逐渐降低，可溶性糖和油脂含量显著提高；微藻油脂的不饱和脂肪酸的比例下降，饱和脂肪酸的比例上升；异养和混养可促进C. vulgaris对碳元素的积累，而抑制对其他元素，如K、P、Ca、Mg、Fe等的吸收和积累。这些细胞生化组成方面的变化反映出，利用含碳有机废水进行混养和异养培养微藻合成的生物质都有利于微藻生物燃料的生产，主要优势在于其含有较高含量的糖类和油脂，而具有较低的蛋白质含量。因此，鉴于混合营养的藻种类型较多，并结合本文的研究结果认为，混合营养模式是高密度、高产率、短周期培养C. vulgaris等具有经济价值的微藻的较适宜的培养方式，可应用于重要微藻活性物质的生物合成。

综上所述，不同营养方式(自养、混养和异养)显著影响C. vulgaris的生长和代谢特征，葡萄糖的添加和光源的供给直接导致藻细胞生理代谢途径和细胞生化组成的改变，尤其对碳代谢途径、光合作用过程、油脂及脂肪酸组成、蛋白质及氨基酸组成和细胞元素积累影响显著。葡萄糖的添加明显促进C. vulgaris细胞的生长和生物量的积累，刺激碳素生化组分(如糖类、油脂)的合成，而抑制氮素生化组分(如蛋白质、光合色素)的生物合成。从CA和Rubisco的活性分析结果反映出，在光照条件下培养基质中葡萄糖的消耗水平直接决定C. vulgaris细胞主营自养或异养生长。光照条件下葡萄糖浓度对C. vulgaris细胞主营自养或异养生长方式的动态基因调控机制正在进一步研究中。