猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原，能引起猪的脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎及肺炎，在人上主要引起脑膜炎和心内膜炎^{[1, 2]}，具有重要的公共卫生学意义。根据荚膜抗原的多样性，猪链球菌可分为33个血清型(1-31、33和1/2)^{[2, 3]}，其中2型在临床上分离最多、分布最广。噬菌体(Bacteriophage,phage)是感染细菌、支原体、螺旋体、放线菌及蓝细菌(蓝藻)的一类病毒，在自然界分布非常广，凡是有上述各类微生物的地方，都有相应种类的噬菌体存在^[4]。根据噬菌体的生活周期不同，可将噬菌体分为烈性噬菌体(又称毒性噬菌体)和温和噬菌体(又称溶原性噬菌体)两大类。温和噬菌体可将自身的基因组整合到宿主的基因组中，并随宿主的基因组复制传代。这种带有噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌。而整合在宿主中的噬菌体称为前噬菌体。前噬菌体在细菌基因组中广泛分布，就目前已完成基因组测序的细菌中，大约65%的细菌基因组中都整合有前噬菌体，有些细菌携带前噬菌体序列将近整个细菌基因组容量的20%^[5]。猪链球菌也携带有前噬菌体,但相关报道较少，全基因组测序的仅有1株烈性噬菌体和11株前噬菌体^[6]。由于猪链球菌的噬菌体分离非常困难，目前为止，国内外仅有一个研究小组报道了一株猪链球菌的烈性噬菌体，其裂解谱较窄，仅能裂解少量猪链球菌2型菌株^[7]。仅有5株猪链球菌的前噬菌体能从宿主菌中诱导出来，且均未发现它们对猪链球菌有裂解作用^[6]。

猪链球菌的烈性噬菌体分离率较低，据作者所知，国内外多家科研单位试图分离猪链球菌的烈性噬菌体，但均未果。迄今为止，仅有本课题组分离得一株猪链球菌的烈性噬菌体(命名为SMP)。

噬菌体SMP为本实验室马玉玲2005年在上海健康巴马香猪的鼻拭子分离所得^[7]。SMP为猪链球菌2型的烈性噬菌体，通过透射电镜观察，SMP头部呈正六边形，直径约50nm，尾部长约135nm，属于长尾噬菌体科(Siphoviridae family)(图1)。

图1. 猪链球菌噬菌体SMP透射电镜图(15000×) Figure 1. Transmission electron microscope photo of S. suis bacteriophage SMP (15000×).

图选项

SMP的噬菌谱较窄，53株不同血清型的猪链球菌中，仅10株能被SMP裂解^[8]。SMP已完成全基因组测序，其基因组为双股DNA，全长为36019bp，GC含量为41.6%，共编码48个基因^[8]。

噬菌体的裂解酶和穿孔素在其感染过程中具有重要作用，受感染的细菌细胞晚期合成穿孔素(holin)和裂解酶(lysin)。穿孔素到达细胞膜形成一种同源低聚物损害膜或在细胞膜上形成“洞穴”,改变宿主菌细胞膜通透性,使裂解酶易于通过而攻击肽聚糖,干扰肽聚糖的合成，破坏胞壁质,裂解宿主细胞,结束感染周期^[9]。

王琰等^[10]将SMP的裂解酶LySMP进行了克隆和表达，发现裂解酶的噬菌谱较完整的噬菌体更广，几乎可以裂解所有的猪链球菌(除2型外，对猪链球菌7型和9型也有裂解作用)。史一博等^[11]将SMP的穿孔素HolSMP在大肠杆菌内进行表达，发现它能提高细胞膜的渗透性，抑制细胞的生长速度，并且在裂解酶LySMP存在情况下具有显著的细胞裂解作用。他还将SMP的裂解酶LySMP和穿孔素HolSMP进行联合作用，发现两者联合作用后噬菌谱范围增加，不但可以裂解猪链球菌，还可裂解金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌^[12]。孟祥朋等^[13]发现大部分猪链球菌均具有不同程度形成生物被膜的能力，噬菌体SMP既不能有效杀灭被膜菌，也不能有效破坏生物被膜结构，但裂解酶LySMP可以在12h以内将SS2-4和SS2-H生物被膜菌几乎全部杀灭,并清除它们80%以上的生物被膜。由此看来，猪链球菌噬菌体的裂解酶较完整的噬菌体具有更好的抗菌效果，这可能与噬菌体的受体特异性相关，提示对噬菌体进行改造而提高其抗菌能力的可能。

末端酶(terminase)是dsDNA病毒包装过程中的必要功能蛋白,其大亚基单位在包装过程中往往行使全酶的作用,一般具有ATP酶活性和限制性内切酶活性^[14]。毛紫微^[15]等将猪链球菌SMP末端酶大亚基单位基因(TlsSMP)在大肠杆菌中进行了表达，并对TlsSMP融合蛋白进行活性检测，发现末端酶大亚基单位在大肠杆菌中呈可溶性表达,具有ATP酶活性,在pH7、23℃和Mg²⁺存在的条件下,其活性最强,其他金属离子如Ca²⁺、Mn²⁺和Co²⁺都对其有不同程度的抑制作用。

猪链球菌的前噬菌体有可诱导和不可诱导两种。

Harel等^[16]首次发现猪链球菌上存在前噬菌体，他们在猪链球菌2型菌株89-999上用丝裂霉素C诱导出前噬菌体，临床强毒株和弱毒株的差减杂交结果显示，许多强毒株特有的基因与前噬菌体的基因存在同源性，因此他们推测该前噬菌体与宿主细菌的毒力相关，但这株前噬菌体并没有进行全基因组测序。作者也试图在89-999上诱导该噬菌体，但没有成功，推测可能噬菌体的诱导受多种环境因素的影响，并非每次都能稳定的被诱导出来。

马玉玲^[17]在猪链球菌2型致病株HA9801和ZY05719 中分别诱导出前噬菌体,命名为SS2-HA(图2-A)和SS2-ZY(图2-B),电镜观察,二者头部均呈正六边形,无尾部,其核酸类型为dsDNA,鉴定为复层噬菌体科(Tectiviridae)成员。作者对此观察结果存在疑义，由于此样本中杂质较多，电镜照片比较模糊，可能这两个噬菌体有长尾或短尾而未被观察到；而噬菌体负染样本的制备工序繁多，也有可能在这期间噬菌体的尾部被破坏，因此这两个噬菌体的形态还需制备更清晰的电镜照片才能确定。

图2. 猪链球菌前噬菌体透射电镜图(15000×)[17] Figure 2. Transmission electron microscope photo of S. suis prophage (15000×)[17].

图选项

作者在丹麦的猪链球菌9型菌株5218和中国的9型菌株NJ2中均诱导出前噬菌体，分别命名为phi5218和phiNJ2^[18]。phiNJ2(图2-C)的透射电镜结果显示，其头部呈正六边形，有一个较长的尾部。经测量其头部的长度均为50nm，尾部长度约为180nm，此形态与烈性噬菌体SMP的形态相似。

Dan Claudio Palmieri^[19]等在猪链球菌SsUD株上发现了一个不可诱导的前噬菌体样元件phiSsUD.1，它携带有四环素耐药基因，从而导致宿主细菌的耐药性，并且发现该耐药基因簇与化脓链球菌噬菌体Φm46.1高度同源，由此推测，这两个不同种属的前噬菌体之间可能存在着基因水平转移。

作者对不同来源的1、2、7、9型的猪链球菌基因组进行了预测，共预测出8个完整的前噬菌体基因组，分别为phi7917、phi20c、phi30c、phi891591、phiS10、phiSS12、phiST1以及phiD12。并对报道的所有的猪链球菌的噬菌体包括phi5218、phiNJ2、phi7917、phi20c、phi30c、phi891591、phiS10、phiSS12、phiST1、phiSsUD.1、phiD12及烈性噬菌体SMP进行了比较基因组学分析,发现这些噬菌体的基因组均可分为5个模块：溶原模块、复制模块、包装模块、形态模块和裂解模块(图3)。

图3. 猪链球菌(前)噬菌体的基因组比较[6] Figure 3. Comparative genome alignments of the twelve S. suis (pro)phages[6]. Modular organization of twelve S. suis (pro)phage genomes(phiSS12,phi20c,phi5218,phi7917,phi891591,phiNJ2,phiST1,phi30c,phiS10,SMP,phiD12,and phiSsUD.1). Genes are grouped into five functional modules associated with the phage life cycle: lysogeny,replication,packaging,morphogenesis and lysis. The likely functions of the genes are indicated by colorcoding. The bottom line provides a base pair scale of the genomes.

图选项

许多病原菌的毒素由前噬菌体编码^[20]，如肉毒毒素、白喉毒素、霍乱毒素以及志贺毒素等^[21]。除猪链球菌外，其他种属的链球菌如肺炎链球菌^[22]、A 群链球菌^[23]、化脓链球菌^[24]和马链球菌^[25]基因组中也含有前噬菌体，并且许多都与细菌毒力相关。而猪链球菌前噬菌体与宿主的毒力之间的关系尚处于推测阶段，仅在其前噬菌体中发现一些疑似的毒力因子，未经试验证实。

Daniel B. Gilmer^[26]等将猪链球菌2型菌株89/1591基因组中的前噬菌体裂解酶基因PlySs2在大肠杆菌中克隆、表达并纯化，发现其具有很强的裂解能力，且噬菌谱非常广，不但能裂解猪链球菌，而且对耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素诱导的金黄色葡萄球菌(VISA)、拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、化脓链球菌(S. pyogenes)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、G群链球菌(group G streptococci；GGS)、E群链球菌(group E streptococci，GES)及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)都有裂解能力。PlySs2在50℃能保持稳定30min，37℃保持稳定超过24h，4℃保持稳定超过15d，-80℃保持稳定超过7个月，在反复冻融10次后活力仍未减弱。动物实验表明PlySs2对耐药性金黄色葡萄球菌和化脓链球菌混合感染的小鼠具有92%的保护作用。这是迄今为止发现的裂解能力最强、裂解谱最广的猪链球菌的裂解酶，对今后相关研究具有参考价值。这表明猪链球菌的噬菌体虽然较难分离，但尚有可能利用前噬菌体的裂解酶作为生物防控的有效手段。

噬菌体的两个生活周期可以相互转化。溶原型噬菌体在某些因素作用下，如丝裂霉素C 的诱导或紫外灯的照射下，可由溶原型生活周期向裂解型生活周期转变，此时噬菌体的基因组会从宿主染色体上掉下来，重新在宿主体内复制、装配出新的子代噬菌体并释放，同时宿主细菌也被裂解死亡。相反，烈性噬菌体在某些条件下，如不利的环境因素作用下，也可由裂解型生活周期向溶原型生活周期转化。噬菌体在感染宿主菌后，噬菌体的基因整合于宿主基因组中，形成溶原菌。作者将猪链球菌烈性噬菌体SMP的基因组整合到其宿主SS2-4的基因组上，构建了一株含有前噬菌体的溶原菌SS2-4(SMP)^[8]。比较野生菌SS2-4和溶原菌SS2-4(SMP)的生物学特性，发现相对于野生菌SS2-4，溶原菌SS2-4(SMP)对斑马鱼的毒力有明显增强，生长速度显著加快，革兰氏染色显示链显著变短，对溶菌酶的敏感性也显著升高。表明噬菌体SMP一定程度上能增强宿主猪链球菌SS2-4的毒力。

除上述全基因组测序的噬菌体外，还有一些噬菌体相关基因的报道。如猪链球菌14型菌株基因组中存在一个特异性的前噬菌体片段^[27]。3型猪链球菌ST3基因组中也发现了噬菌体相关基因^[28]。

由于猪链球菌烈性噬菌体的分离存在一定难度，目前全世界仅发现一株猪链球菌2型的噬菌体SMP，故许多研究都围绕该噬菌体进行，主要集中于它的裂解酶和穿孔素蛋白。共有11株猪链球菌前噬菌体的相关报道，其中89/1591噬菌体的裂解酶具有较强的裂解能力，且噬菌谱非常广，能裂解猪链球菌及其他多种细菌，且对小鼠具有很好的保护力。目前报道的噬菌体裂解酶中，在裂解谱的广度、稳定性、对多种病原菌的防控效率上，尚无出其右者^[26]，提示猪链球菌噬菌体及其裂解酶在生物防控方面的潜力。链球菌属的化脓链球菌^[29]、肺炎链球菌^[22]的前噬菌体都与宿主毒力相关，而猪链球菌烈性噬菌体SMP整合入宿主基因组后，溶原菌株对斑马鱼的致病力也有所增强，但其具体机制尚不清楚，有待进一步的探索。