细菌经常面临外界环境的变化，比如温度、pH的骤变、营养物质的匮乏等，这些压力环境会造成细菌体内错误折叠蛋白的积累，对于细菌是致命的。因此为了维持正常代谢和压力刺激下体内蛋白质的动态平衡，细菌拥有一套由蛋白酶及伴侣分子组成的蛋白质质量控制系统(protein quality control system,PQC)^[1]——清除体内错误折叠或不需要的蛋白质，释放出氨基酸和能量以合成新的有功能的蛋白质。

组成PQC系统的主要是一些AAA+(ATPases associated with diverse cellular activities)^[2]蛋白酶和与其功能相关的分子伴侣。由于蛋白质降解是一个消耗ATP且不可逆的过程，因此对底物的识别必须是高度特异的，以防止蛋白质降解过程不受控制，细菌还有一系列其他方式来调控在特定时间特殊蛋白质的降解。20世纪80年代首次发现在放线菌属中存在与真核生物类似的蛋白酶体，这一降解机制在结核分枝杆菌中发挥重要功能。此外，研究表明，蛋白质降解参与了对细菌的调控过程，通过对一些调控蛋白的激活或者抑制影响细菌的各项生命活动，包括细菌的生长、分化、孢子的形成等，还与细菌的应激反应以及毒力等相关^[3]。

细菌体内绝大部分蛋白质的降解由AAA+蛋白酶负责，在革兰阴性菌例如大肠杆菌中主要有5种AAA+蛋白酶：ClpAP、ClpXP、HslUV、Lon和FtsH；而在革兰阳性菌例如枯草芽孢杆菌中总计有7种不同的AAA+蛋白酶：ClpCP、ClpEP、ClpXP、HslUV、LonA、LonB和FtsH。

虽然不同的蛋白酶通过识别不同底物而发挥不同功能，它们却有着相似的结构，所有的AAA+蛋白酶都由两部分组成，一个肽酶(peptidase/protease)和一个解折叠酶(unfoldase/ATPase)，关于AAA+蛋白酶的详细结构，请参考综述^[1]，这里就不再赘述。

解折叠酶似六边形螺帽结构，其中一个六边形面与肽酶结合，两者的孔道对齐后为解折叠的蛋白质从ATP酶进入肽酶提供了一个通道^[4]。肽酶与一个或者两个ATP酶六聚体形成有活性的蛋白酶结构，它的功能在于进一步降解并清除已经被解折叠的底物^[1]。解折叠酶-肽酶复合物是动态变化的，例如ClpXP蛋白酶在ADP存在或者核苷酸缺失时，复合物发生解聚。

携带降解决定子是大多数蛋白酶底物的一个共同特点，通常位于底物的N端或C端，因此容易被蛋白酶或者连接蛋白识别并结合。大多数降解决定子存在于靶蛋白编码序列中，而少数降解决定子在翻译过程中或翻译后添加到靶蛋白上。

除了N端法则，一些蛋白酶也能识别底物C端的降解信号。比如Lon对SulA的降解，需要其C端组氨酸的存在。Hoskins等研究则发现，当固有识别信号存在于相反的末端或者中间部分时，底物也会被降解^[9]。

多聚磷酸盐能促进Lon、ClpAP对一些核糖体蛋白的降解，被认为是大肠杆菌中存在的另一种底物标记^[12]。多聚磷酸盐同时结合到蛋白酶和底物上，在体外和体内都能促进底物降解，但其激活降解的机制尚不清楚。

ClpXP与SsrA降解标签之间的互作在直接识别类型中研究的最为透彻。虽然SsrA标签含11个氨基酸，ClpXP只识别其末端的两个甘氨酸及C端的α羧基。ClpX轴向孔中分布的3套loops(RKH，pore1，pore 2 loops)负责对SsrA降解标签的识别。RKH loops围绕在ClpX孔道入口处，带正电，可以吸引带负电的序列。RKH loops的突变体中，改变了ClpX的特异性并且降低了ClpX对SsrA标记底物的特异性，这暗示了RKH loops作为底物进入ClpX孔道的选择器。一旦底物进入了ClpX的孔道,位于ClpX孔道深处的pore 2 loops会与SsrA标签C端两个丙氨酸相互作用^[13]。

连接蛋白是一类能够传递特异性底物的蛋白质。目前，大肠杆菌中鉴定出4种连接蛋白，SspB、UmuD、RssB给ClpXP传递底物，而ClpS传递底物至ClpAP；在枯草杆菌中也鉴定出4种连接蛋白，MecA、McsB、YpbH与蛋白酶ClpC相互作用，YjbH则与ClpX一起发挥作用。SspB首先在大肠杆菌中被鉴定出来，由两个功能区域组成，中间被一段非结构片段隔开。其N端形成二聚体，与结合SsrA标签相关，C端为ClpX结合区域，因此SspB可以将携带SsrA标签的底物传递至ClpX，有效提高了ClpX孔道附近的底物浓度，促进底物降解。解折叠酶ClpX识别SsrA标签C端的AA序列，SspB结合到SsrA标签N端序列(AAND—Y)；而ClpA对SsrA的识别序列与SspB有重叠，因此SspB抑制ClpA对SsrA标记蛋白的降解^[14]。

泛素-蛋白酶体通路是真核生物调控细胞内蛋白质水平、消除错误折叠蛋白的重要机制。Dahlmann等利用电镜技术在嗜酸性热原体中发现类似蛋白酶体核心颗粒的存在，首次证明原核生物体内存在蛋白酶体^[17]。2008年，Pearce等在结核分枝杆菌 (Mtb)中发现了与泛素功能相似的蛋白质，命名为原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)^[18]。Pup可以在辅助因子的作用下标记多种功能蛋白，即类泛素化修饰，并介导被标记的底物被蛋白酶体降解。Pup-蛋白酶体通路的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制。

真核细胞中最普遍的是26S蛋白酶体，包含一个20S核心颗粒(Core Particle,CP)负责对底物的降解，和两个19S调节颗粒(regulatory particle,RP)负责对底物的解折叠并转移底物至CP^[19]。Mtb蛋白酶体的CP在结构上与真核生物的蛋白酶体20S核心颗粒相似，都是由28个亚基(α7β7β7α7)构成高度约150 、直径约115的筒状结构，两个外部环状结构由7个α亚基构成，两个内部环状结构由7个β亚基构成^[20]。与真核生物不同的是，Mtb蛋白酶体核心颗粒中只含有一种α亚基和一种β亚基。原核蛋白酶体外部的两个环状结构分别由7个相同的α亚基构成，这两个外环具有“门”的作用，阻止底物随意进入蛋白酶体^[21]，研究发现α亚基N端2-9个氨基酸的缺失可以削弱“门”的阻碍作用，提高蛋白酶体降解底物的活性^[22]。原核蛋白酶体的活性位点位于β亚基中，β亚基的N端有胰凝乳蛋白酶活性，因此β亚基组成的两个内环具有蛋白质降解作用。真核蛋白酶体7个不同的β亚基决定对底物的偏好性，而Mtb蛋白酶体的底物结合口袋集合了真核蛋白酶体中各β亚基特点^[22]，决定了其对底物具有广泛地特异性。β亚基在蛋白酶体装配过程中隐藏苏氨酸活性位点，以防止其暴露后降解正常蛋白。

原核蛋白酶体也需要像真核蛋白酶体19S调节颗粒一样的分子伴侣，依赖ATP解折叠底物，并将底物传递至蛋白酶体催化活性中心。PAN (proteasome activating nucleotidase)是甲烷球菌蛋白酶体的ATP酶，能够促进核心颗粒对于底物的降解。Mpa (mycobacterial proteasome ATPase)是Mtb中与PAN同源的六聚体，但其ATP酶活性相对较低，主要功能为传递底物。与真核生物的19S调节颗粒相类比，Mpa与核心颗粒也应有相互作用，但由于两者在体外的相互作用较弱^[23]，它们之间如何互作还不清楚。细菌甚至哺乳动物的蛋白酶体ATP酶都含有一个HbYX (疏水氨基酸-络氨酸-任意氨基酸)的结构域，该结构域对于降解非常关键而与ATP酶活性无关。Mpa也含有类似HbYX的结构，缺少该结构域的Mpa与Mtb 20S核心颗粒在体外的相互作用减弱^[24]。

Rv2111c是Pearce等利用细菌双杂交系统筛选与Mpa相互作用的蛋白时，鉴定到的一个蛋白^[18]。该蛋白不但与Mpa有相互作用，与Mtb蛋白酶体的一个底物FabD也具有相互作用，质谱结果显示Rv2111c的C端残基与FabD 173位赖氨酸之间形成异肽键。将FabD的第173位赖氨酸突变成后，FabD不再被降解，证明了Rv2111c确实为蛋白降解的信号。一些已知的蛋白酶体底物如PanB等可以被Rv2111c在赖氨酸位点共价标记，因此Rv2111c被命名为原核类泛素蛋白(Pup)。Pup是一种具有螺旋倾向的无序蛋白，Pup标记蛋白质后其N端仍保持无序状态，C端形成螺旋结构，能与Mpa的N端螺旋结构域非共价作用，被Mpa传递入蛋白酶体进行降解^{[25, 26]}。Pup在放线菌中普遍存在，其C端为Gly-Gly-Gln序列，与泛素C端保守的Gly-Gly序列有所不同。抗类泛素化蛋白的多抗在Mtb中能够识别很多蛋白，表明类泛素化在Mtb中广泛存在，但未发现多聚类泛素化的现象。

在一系列辅助因子的协助下，Mtb中Pup-蛋白酶体对底物的降解过程可概括如下：Pup的C端Gln在去酰胺酶Dop催化下形成Glu；PafA连接酶通过水解ATP，使Pup C端Glu发生磷酸化，并催化其以共价键的形式与底物蛋白上的Lys相连；Pup标记的底物通过Pup C端与Mpa N端相互作用，Mpa水解ATP打开蛋白酶体核心区域的门(α亚基)，并传递底物蛋白到蛋白酶体的核心区域(β亚基)，同时Dop促使去类泛素化，使Pup可被循环使用；底物经由蛋白酶体被降解^[27]。

蛋白质降解是一个不可逆且消耗能量的过程，所以细菌严格监控蛋白质降解的发生与否，可能从以下几个方面对这一过程进行调控。

许多蛋白酶属于热激蛋白，蛋白在热激状态易错误折叠，蛋白酶数量的增多对于这些蛋白质的降解具有重要意义。枯草芽孢杆菌中，lonA在高温压力下表达，参与维持一些调控因子的低水平状态；而lonB依赖芽孢形成时的特殊σ因子才表达^[28]。除了蛋白酶数量的改变，与蛋白酶的竞争性结合在基因调控网络中也发挥着重要作用，λ噬菌体中cⅢ蛋白可与FtsH竞争性结合，保护cⅡ免受FtsH降解，从而调控噬菌体的溶源性转变。另一个比较激烈的调控蛋白质降解的方法是T4噬菌体利用蛋白酶抑制剂比如PinA来抑制蛋白质的降解。

底物能够通过影响蛋白酶Lon的构象而调控其降解速率。当底物不存在时，Lon主要以无活性的形式存在；当底物SulA与Lon结合，Lon形成高ATP酶活而无降解底物活性的构象；当底物β20与Lon结合，Lon变成低ATP酶活，高降解活性的状态^[29]。

最典型的就是大肠杆菌体内的重要σ因子RpoS，其降解依赖蛋白酶ClpXP及连接蛋白RssB。而只有磷酸化的RssB才能介导RpoS的降解，因此，大肠杆菌很可能通过调控RssB的磷酸化状态而控制体内RpoS的降解水平^[30]。除了RpoS，下文中提到的ComK的降解也受到其连接蛋白MecK的调控。

底物的降解首先需要被蛋白酶识别，而底物的结构或者伴侣分子的变化等均会影响到底物与蛋白酶的接触，从而改变底物对蛋白酶的敏感性。λ噬菌体O蛋白在体内体外均不能稳定存在，而一旦其与DNA复制复合物结合就变得稳定^[31]。ClpX对MuA的降解依赖底物的C端序列，而MuB也可以结合该C端序列，抑制降解。

值得一提的是，翻译后修饰特别是乙酰化，也可以影响到真核生物体内蛋白质的降解。比如在酵母体内发现，蛋白质N端的乙酰化可作为降解决定子，被泛素连接酶识别进而被降解^[32]；Gibellini等也发现线粒体中的Lon蛋白酶受到SIRT3的去乙酰化调控^[33]。我们课题组发现，细菌体内的蛋白酶比如Lon存在乙酰化修饰，并且乙酰化酶Pat在体外能够增强Lon的乙酰化水平。虽然原核生物体内关于乙酰化与蛋白质降解的关系还未见报道，但可以推测乙酰化在调控细菌体内的蛋白质降解过程也发挥作用，这一猜想需要我们进一步深入探索。

为了适应外界多变的环境，细菌进化出了多种机制调控基因的表达，而蛋白质降解在一些调控机制中扮演了重要的角色。蛋白质降解对细菌的调控是多功能的，涉及细菌的分裂、分化、生长、应激反应、致病性等过程。

在新月柄杆菌的细胞周期中，关键蛋白质的降解显得尤为重要。新月柄杆菌在细胞周期中必须经历从无柄游动细胞到有柄细胞的形态转变，有柄细胞才具有复制功能。TacA是有柄细胞合成的转录因子，同时也是蛋白酶ClpXP的底物，ClpXP可通过降解TacA的与否来调控细菌的形态，从而影响细菌的分裂过程^[34]。Jonas等发现，在压力状态下，蛋白酶Lon受到激活并降解复制起始蛋白DnaA，从而控制新月柄杆菌在不良条件下的复制起始^[35]。

Raju等利用蛋白质组学的方法鉴定出了Mtb蛋白酶ClpP的一个底物WhiB1，并且发现WhiB1的积累会导致Mtb的生长受到抑制^[36]。

生长进入稳定期的枯草芽孢杆菌为了适应外界环境变化可以分化成不同的细胞，比如孢子、能够摄取外源DNA的感受态细胞或者生物膜形成细胞等，这些生长分化过程都与蛋白质降解密切相关。感受态细胞的形成由转录激活因子ComK控制，在对数生长期，ComK被配体蛋白MecA识别后经ClpCP降解，因此对数生长期几乎不形成感受态细胞。进入稳定期后，随着细菌密度增加会激活抗配体蛋白ComS，与ComK竞争结合MecA，抑制ComK的降解，ComK含量升高到一定程度的细胞形成感受态细胞^[37]。枯草芽孢杆菌在恶略环境中会形成强耐受孢子，这一复杂的过程则需要蛋白酶FtsH、ClpP、ClpC和ClpX的参与。

细菌对压力环境的反应通常是由σ转录因子负责，在E.coli体内有7种不同的σ因子，每种σ因子在不同的压力环境中快速激活一系列特殊基因的表达。

σ^s是E.coli中应激反应的主要调控因子，在非压力状态下，σ^s合成之后很快被配体蛋白RssB识别，经ClpXP降解(图1)。而在饥饿、高渗透压、高温等压力条件下，σ^s能够稳定存在不被降解^[38]。这是由于压力环境激活抗连接蛋白IraP、IraM和IraD等表达，干扰RssB与σ^s的结合，同时σ^s合成增加。除了σ^s，与热击反应相关的σ³²对细菌的调控与蛋白酶FtsH相关。

图 1. 大肠杆菌体内受调控的σs的降解 Figure 1. Regulated degradation of σsin E. coli.

图选项

持留菌是指一类对抗生素敏感的细菌中出现的极少量能够抵御抗生素杀伤作用的细菌，在抗生素存在时处于静止状态不生长，一旦抗生素去除，又可恢复生长。Maisonneuve^[39]等研究发现，持留菌的形成与其体内抗毒素被Lon降解直接相关。

细菌病原体侵染宿主过程也依赖蛋白质的降解。一方面，清除病原菌进入宿主后累积的错误折叠蛋白，提高了细菌对不良环境的耐受；另一方面，及时降解一些毒力调节因子，增强细菌毒力。

敲除lon的鼠伤寒沙门菌虽然出现了诱导巨噬细胞大量凋亡、对上皮细胞的入侵增强以及SPI1(Salmonella pathogenicity island 1)基因表达上调的表型^[40]，但是其半数致死量却是野生型的10³-10⁶倍，且在小鼠巨噬细胞中无法存活^[41]，这表明敲除lon的沙门菌毒力下降。值得注意的是，lon敲除后SPI1基因表达上调，这是由于HilC、HilD均为Lon的底物，而HilC、HilD的积累导致HilA表达上调，进而SPI1基因表达上调^[42]。此外，Lon缺失的沙门菌对氧化压力、酸性压力敏感^[41]。综合上述，蛋白酶Lon在沙门菌侵染过程中的最大贡献在于抵抗氧化压力等对细菌的杀伤。

溶胞素(listeriolysin O，LLO)是病原体李斯特菌的重要毒力因子，入侵过程中病原菌借助分泌的LLO躲避宿主吞噬体。LLO活性依赖蛋白酶ClpP，ClpP突变的李斯特菌在宿主体内复制能力大大降低，很快被宿主清除^[43]。除了毒力因子LLO，ClpC还调控inlA、inlB、actA的表达^[44]，揭示了ClpP介导的蛋白质降解在调控李斯特菌毒力因子表达过程中具有一定的普遍性。

近年来，随着蛋白质降解参与对细菌调控的功能被普遍认可，对于蛋白酶参与的细菌调控网络研究很多，但仍然存在很多关键的问题有待解决，比如一些调控蛋白是怎样被识别的，其降解又是怎样被激活或抑制的。很多的结果都是以大肠杆菌为实验对象获得的，在其他细菌体内蛋白质降解是否有相同的功能还需进一步验证。另外，目前已经鉴定出来的蛋白酶底物很少，极大地妨碍了对于蛋白质降解功能的研究。我们期待基因组学、转录组学、蛋白质组学的快速发展能够协助更多底物被鉴定出来，从而帮助我们更好的理解蛋白酶的降解机制，更深入地探索蛋白质降解在细菌各种生理过程的作用。