苔藓植物(Bryophyte)是一类结构简单，为叶状体或有假根和类似茎、叶分化的茎叶体，无真正的维管组织，由孢子进行繁殖，生殖离不开水的小型绿色植物，包括藓类(mosses)、苔类(liverworts)和角苔类(hornworts)三大类。在植物界的演化进程中，它代表着从水生逐渐过渡到陆生的类型。苔藓植物对环境有较强的适应能力，分布广泛，全球约23000余种，我国已发现约有2800余种^[1]。已有研究表明，苔藓植物中广泛定殖有植物内生菌，并且，有些内生菌还在苔藓植物的环境适应中发挥了重要作用^[2,3]。然而，到目前为止，有关苔藓植物内生菌的研究主要集中在沙漠和南极洲等极端环境^[3,4,5]，而对温带及热带雨林等其它非极端环境苔藓植物内生菌的研究报道却相对较少^[5,6,7]。

植物内生菌指那些在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的菌。它广泛存在于各种生境的各类植物中，能显著提高宿主植物对各种生物和非生物胁迫的抗性^[8,9]。作为植物适应陆生环境的一个重要过渡类型，内生菌可能在苔藓植物从水生向陆生过渡的过程中发挥了重要的作用。因此，全面了解各种环境苔藓植物内生菌的多样性组成及其功能，是揭示内生菌在植物进化过程中重要生态学功能的基础。

云南大围山国家级自然保护区位于云南省南部红河州的屏边县和河口县之间(103°39′—103°51′E，22°28′—22°45′N)，是以保护热带山地常绿阔叶林自然生态景观和丰富的珍稀濒危动植物为主要管理目标的热带森林生态类型的自然保护区。保护区属于亚热带海洋性气候类型，区内热量丰富，雨量充沛，形成多雨(雨季)和多雾或多“雾雨”(旱季)的温暖、高湿的气候特点。保护区内随海拔升高依次分布湿润雨林、山地雨林、湿润性季风常绿阔叶林、山地苔藓常绿阔叶林和山顶苔藓矮林等植被类型。其中苔藓植物种类繁多，生活型与群落类型丰富多样，是大围山自然保护区丰富的自然资源和生物多样性的特色之一^[10]。然而到目前为止，尚未见任何有关其内生菌的研究报道。

本研究对云南大围山保护区内四种常见苔藓植物的内生真菌多样性进行了调查，研究结果不仅可以丰富不同生境苔藓植物内生真菌的多样性，还可为内生菌在苔藓植物适应陆生环境中的可能生态学功能研究提供一些重要参考和菌种资源。

提灯藓(Mnium sp.)、地钱(Marchantia polymorpha)、金发藓(Polytrichum commune)和塔藓(Hylocomium splendens)4种苔藓植物于2012年11月采自大围山季风常绿阔叶林和山地苔藓常绿阔叶林区域。每种植物选择6-10个采样点，每个采样点连土采集植物样品约15 株。样品采集后立即放入塑料袋中，贴上标签带回实验室，4℃冰箱保藏并在2 d 内处理完毕。

从每种植物样品中随机挑出30株，在自来水下冲洗干净，按下列程序进行表面消毒：体积分数75%的乙醇漂洗3 min、无菌水冲洗3次；2%的NaClO溶液漂洗2 min、无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分。将表面消毒后的样品分为光合作用组织部分和假根部分，剪成约0.3 cm的片段，贴到PDA平板上(光合作用组织和假根部分各贴80个片段)，置于25℃恒温培养箱中黑暗培养3-30 d，隔天观察，发现组织块周围有菌落长出，则将其转接到斜面，经纯化后得到内生真菌菌株^{[3, 11]}。并通过漂洗液检验法和组织印迹法来检验表面消毒是否彻底。

内生真菌的鉴定采用形态学和分子生物学相结合的方法进行。

形态鉴定：依据菌落形态、产孢方式、孢子形态特征和产孢结构进行鉴定^[12,13]。不产孢的菌株则接种到促孢培养基上进行促孢培养，并定期检查其产孢情况，产孢后按上述方法进行鉴定。经促孢培养45 d后仍不产孢的菌株则根据菌落表面特征、菌丝颜色、菌丝生长速率等分为无孢类群的不同组。

分子鉴定：每个形态种选择2-5株菌株，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取总DNA，真菌通用引物ITS1和ITS4进行18S rDNA扩增，最后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测并纯化，送上海生工生物工程有限公司测序。所获序列与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的序列进行比对，根据相似度、覆盖率以及菌株的形态特征确定菌株的分类地位^[14]。

内生真菌的分离频率和定殖率可以衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和组织块受多重侵染的频率，而相对分离频率可以衡量植物组织中某种内生真菌的优势度，分别按以公式(1)、公式(2)和公式(3)计算^[15]。

多样性指数(H′)可以反映每种植物内生真菌的物种多样性程度，按Shannon-Weiner 指数公式(4)计算^[16]。

相似性系数(CS)可以比较两种植物之间内生真菌种类组成的相似程度，按Sorenson 系数公式(5)计算。

从提灯藓(Mnium sp.)、地钱(M. polymorpha)、金发藓(P. commune)、塔藓(H. splendens)4种苔藓植物的630个组织块中共分离得到内生真菌900株，分离频率在1.17-1.77之间，平均分离频率为1.41。其中地钱内生真菌的分离频率最高，为1.77，金发藓内生真菌的分离频率最低，为1.17。除了提灯藓光合作用组织部分的内生真菌分离频率低于假根部分外，其余三种植物均是光合作用组织内生真菌的分离频率高于假根部分的分离频率，但从组织水平来看，四种植物的光合作用组织内生真菌的分离频率和假根部分的分离频率并不存在显著差异(LSD分析，P >0.05，图1)。并且观察至第7天作为对照检验的平板上均无菌落出现，表明表面消毒彻底，所分离到的菌株全为植物内生真菌。

图 1. 四种大围山苔藓植物内生真菌的分离频率 Figure 1. Isolation rate of endophytic fungi from 4 bryophyte species in Dawei mountain.

图选项

四种苔藓植物中内生真菌的定殖率在96.88%-100%之间，不存在显著差异(P >0.05，图2)。

图 2. 四种大围山苔藓植物内生真菌的定殖率 Figure 2. Colonization rate of endophytic fungi from 4 bryophyte species in Dawei mountain.

图选项

结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，900株内生真菌分属于57个分类单元。其中，34个单元鉴定到种，16个单元鉴定到属，其余的7个不能确定其种属(不产孢，分子鉴定后仍不能确定种属)。各种苔藓植物中不仅内生真菌的种类不同，其优势内生真菌也各不相同(图3)。其中提灯藓的内生真菌种类最多，有44种，地钱和金发藓中各有28种，而塔藓中最少，仅有18种。炭角菌属(Xylaria)、炭疽菌属(Colletotrichum)、 木霉属(Trichoderma)和青霉属(Penicillium)是该地区苔藓植物内生真菌的优势属，相对分离频率分别为20.44%、17.89%、16.33%和12.89%(图4)。

图 3. 四种大围山苔藓植物内生真菌的相对分离频率 Figure 3. Relative frequency of endophytic fungi from 4 bryophyte species in Dawei mountain.

图选项

图 4. 四种大围山苔藓植物内生真菌组成情况 Figure 4. Composition of endophytic fungi from 4 bryophyte species in Dawei mountain.

图选项

从种的水平看，提灯藓、地钱、金发藓和塔藓四种苔藓植物的优势种及其相对分离频率也各不相同，分别为炭角菌属种3(Xylaria sp3.)(17.58%)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(38.52%)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)(19.25%)和炭角菌属种1(Xylaria sp1.)(41.83%)，而与其他三类苔藓有所不同的是塔藓，其内生真菌中的Penicillium biourgeianum 也较为优势，相对分离频率达到了25.48% (图3)。有些真菌在四种苔藓植物中广泛分布，如炭角菌属种1(Xylaria sp1.)、炭角菌属种3(Xylaria sp3.)、胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、棘孢木霉(T. asperellum)以及穗黑孢菌(Nigrospora oryzae)等，而有些真菌仅在某种苔藓植物或特定的组织中定殖，如草茎点霉(Phoma herbarum)和腐质霉(Humicola sp.)仅从地钱中分离得到，而芒果球座菌(Guignardia mangiferae)仅从光合作用组织中分离得到(图3)。

提灯藓、地钱、金发藓和塔藓四种植物内生真菌的多样性差异较大，多样性指数分别为3.22，2.41，2.70和1.80。

从表1可以看出，四种苔藓植物内生真菌的相似性系数在0.409-0.613之间，其中提灯藓与金发藓的相似性系数最高，为0.613，而地钱与塔藓的相似性系数最低，为0.409。总的看来，塔藓与其余三种的相似性都偏低，最高的仅为0.459(表1)。

四种苔藓植物内生真菌的分离频率在1.17-1.77之间，与Davis & Shaw ^[6]报道的热带和温带鞭苔(Bazzania trilobata)、芽孢护蒴苔(Calypogeia muelleriana)及林地合叶苔(Scapania nemorea)的内生真菌分离频率1.9-3.5相似，但却远高于极端环境苔藓植物内生真菌的分离频率，如U’ren等^[5]发现生长于极端干热环境的白发藓(Leucobryum sp.)和角齿藓(Ceratodon purpureus)，其内生真菌分离频率仅为0.15和0.21。这些研究结果表明，苔藓植物内生真菌的丰富程度不仅与宿主植物密切相关，生境也是造成其丰度差异的一个重要因素。同样，本研究中四种苔藓植物内生真菌的定殖率在96.88%-100%之间，也远高于Zhang等^[3]报道的生长于南极地区的苔藓植物内生真菌的定殖率(8.7%-12.3%)。

四种苔藓植物的内生真菌分属于57个分类单元，其中炭角菌属种1(Xylaria sp1)、炭角菌属种3(Xylaria sp3)、胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、棘孢木霉(T. asperellum)以及穗黑孢菌(Nigrospora oryzae)等在四种苔藓植物各部分组织中均广泛分布，没有显示宿主和组织专一性。而有些内生真菌却只存在于特定的苔藓植物或特定的组织中，如角毛壳菌(Chaetomium cupreum)仅存在于塔藓中，而草茎点霉(P. herbarum)和菱形贝尔孢菌(Beltrania rhombic)仅从地钱中分离得到，芒果球座菌(G. mangiferae)仅从苔藓植物的光合作用组织部分分离得到，显示了一定的组织或宿主专一性。同样，Davey等^[17]在研究曲尾藓(Dicranum scoparium)、塔藓(H. splendens)、赤茎藓(Pleurozium schreberi)和金发藓(P. commune)内生真菌时也发现，有些内生真菌具有一定的宿主专一性。有些学者认为这可能是由于内生真菌产酶不同所致，有些内生真菌能够产生溶解多种植物细胞壁的酶类，使其能够进入广泛的宿主中并定殖，而具有宿主专一性的内生真菌可能只产生某种特殊的酶类，使其仅能进入特定的宿主细胞并定殖于其中^[18,19,20]。

此外，在本研究中我们还发现，即使是同属不同种的内生真菌，也显示了一定的宿主偏好性。如炭角菌属中的种3(Xylaria sp3.)为提灯藓的优势内生真菌，其相对分离频率达到17.58%，而塔藓的优势内生真菌却是炭角菌属中的种1(Xylaria sp1.)，相对分离频率高达41.83%(图3)。同样，有些内生真菌也表现出特定的组织偏好性，它们仅在光合作用组织或是假根中存在，或是在某类组织中的相对分离频率明显高于其它组织。如芒果球座菌和博宁刺盘孢，仅从苔藓植物的光合作用组织中分离得到，而假根中则没有。其他一些学者也发现了类似的情况，如在曲尾藓(D. scoparium)、塔藓(H. splendens)、赤茎藓(P. schreberi)和金发藓(P. commune)四种苔藓植物中均存在盔孢伞属(Galerina)，但在金发藓中的数量和种类均明显低于其他3种，并且所发现的盔孢伞属中最为丰富的6种中有5种均倾向于在褐色组织中定殖，仅Galerina pumila的数量是绿色组织中多于褐色组织^[21]。这可能是由于不同宿主或组织所处环境的光照强度、湿度、温度等差异所致^[22]，也可能是因为不同的宿主或组织中防御真菌感染的化学物质活性差异所致^[21]。

炭角菌属(Xylaria)、炭疽菌属(Colletotrichum)、木霉属(Trichoderma)和青霉属(Penicillium)是大围山地区苔藓植物的优势内生真菌属。其中炭角菌属也曾被报道为南极、牙买加蓝岭等其他环境中苔藓植物的内生真菌^{[3, 23]}。此外，许多研究还表明炭角菌属在苔藓植物和被子植物中都广泛分布，且来自苔藓植物和被子植物的炭角菌之间是密切相关的^[23,24]。因此，炭角菌属内生真菌是否在植物进化过程中发挥了一定的作用，是我们下一步研究的课题之一。

四种苔藓植物内生真菌的多样性指数在 1.80-3.22之间，远高于已报道的南极地区苔藓植物的0.91-1.99和南极维管植物的1.44^{[3, 25]}，而与其它热带和亚热带地区维管植物的多样性指数接近，如澳大利亚热带雨林4种常见维管植物内生真菌的多样性指数在2.96-3.76之间^[26]，不同样地野生青檀内生真菌多样性指数在2.05-2.32之间^[27]。这说明大围山苔藓植物内生真菌多样性较为丰富，且相近生境中维管植物和非维管植物内生真菌的多样性较为接近，但非极端环境植物的内生真菌多样性常高于极端环境植物的内生真菌多样性。当然，由于本研究采用的是可培养方法，可能导致一些生长缓慢的真菌种类被忽略，也有一部分离体条件下不可培养的真菌被遗漏，从而导致内生真菌多样性比实际情况偏低。在以后的研究中，我们将同时采用培养和免培养的方法，以便对内生真菌的多样性做出较为全面的评估。

四种苔藓植物内生真菌的相似性系数在0.409-0.613之间，与3种南极地区苔藓植物内生真菌的相似性系数0.18-0.40相比^[3]，该地区苔藓植物内生真菌的相似性较高，而与一些非极端环境植物间内生真菌的相似性相近，如云南元江干热河谷五种植物内生真菌相似性系数0.483-0.757^[28]。这些结果表明，大围山地区苔藓植物内生真菌的宿主专一性低于极端环境植物内生真菌的宿主专一性。我们推测，环境条件可能也是影响内生真菌宿主专一性的一个重要因素。