革兰阳性细菌肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)，是一种人上呼吸道的共生菌。它常引起中耳炎、鼻窦炎、社区获得性肺炎等，严重者可引起菌血症、脑膜炎等，常伴有高发病率和死亡率^[1]。荚膜是肺炎链球菌重要的毒力因子，在肺炎链球菌的致病过程中发挥重要作用^[2]。从人体血液、脑脊液等样本中分离得到的肺炎链球菌都含有荚膜，通常流行血清型的菌株的荚膜相对较厚，而荚膜缺失菌株毒力基本丧失^[3]。

荚膜的合成是一个复杂的过程，目前的研究显示，肺炎链球菌荚膜合成主要受荚膜多糖合成(capsular polysaccharide biosynthesis，cps)操纵子调控。其中血清型3型和37型为合成酶依赖的荚膜多糖合成途径；其余91种血清型均为Wzy-依赖的荚膜多糖合成途径，相关基因位于dexB 和aliA 基因之间，构成一个完整转录单位，受上游启动子调控^[4]。该操纵子的启动子序列由87 bp寡核苷酸片段构成，包含经典的-35区和-10区。研究人员发现，采用不同效率的启动子序列替代该序列后，cps基因的表达水平可发生改变，并表现出相应的荚膜多糖含量的改变^[5]，提示，该启动子序列确实可影响细菌荚膜的合成，但目前尚未见该启动子本身序列的突变对肺炎链球菌荚膜合成影响的报道。

本课题组前期在构建肺炎链球菌D39(血清型2型)基因SPD_1672缺陷菌的实验过程中获得了一株荚膜缺失的突变株，命名为SPY1^[6]。研究发现基因SPD_1672可影响细菌磷壁酸的合成，但其基因缺陷并不能引起细菌荚膜的改变^[7]。为了探寻该菌株荚膜缺失的原因，我们对其进行了全基因组测序。测序结果提示SPY1的cps操纵子中cps基因与野生D39完全一致，只是其启动子序列中存在一个点突变313713 T→C (NC_008533.1)，位于-10区，那么这个点突变是否就是导致SPY1荚膜缺失的原因呢？为了验证这一猜想，我们设计了多个实验从基因表达水平和荚膜含量表型方面进行了详细分析，最终验证了该突变可导致荚膜合成基因表达显著下调从而引起细菌荚膜多糖合成量显著下降，本研究结果为肺炎链球菌荚膜合成的调控提供了新的实验证据。

肺炎链球菌标准菌株D39(NCTC 7466，血清型2型)购买于欧洲菌种保存中心；2型肺炎链球菌无荚膜突变株R6(ATCC BAA-255)购买于美国模式培养物保存中心；2型肺炎链球菌突变株SPY1 (D39 SPD_1672∷Erm，313713 T→C)由本实验室在D39传代过程中获得并保存,它的表型特征是：荚膜以及磷壁酸表达量较野生型明显降低；2型肺炎链球菌缺陷株D39ΔCPS-1672 (D39 cps2A-2H∷Tet，SPD_16725Erm)为本课题组前期构建，它的表型特征与SPY1基本一致。

大肠杆菌BL21由本实验室保存，质粒pEVP3(Cm^r,lacZ)由美国加州大学Morrison教授惠赠^[8]。质粒 pEVP3的多克隆位点位于报告基因lacZ(编码β-半乳糖苷酶)的上游，由于lacZ缺乏启动子，LacZ则随插入基因的表达而同时表达，或在插入启动子的调控下启动自身表达。因此通过检测β-半乳糖苷酶的活性，即可反映插入基因的表达水平或插入启动子序列的调控能力。

DNA纯化试剂盒购自美国罗氏公司；质粒抽提试剂盒购自美国Omega公司；PCR试剂、高保真DNA聚合酶、rTaq酶、T4连接酶、限制性内切酶购买于宝生物(大连)公司；配制Western blot所需试剂、脱氧胆酸盐购自上海生工生物有限公司；RNase A、蛋白酶K、溶菌酶、酵母提取物、胰蛋白胨购买于美国Sigma公司；抗2型肺炎链球菌荚膜抗体和omni荚膜抗体购买于丹麦血清研究所；β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；血平板购买于重庆庞通公司。

将肺炎链球菌D39、R6、SPY1和D39ΔCPS-1672接种于C+Y培养基中^[9]，置37℃，5% CO₂培养箱中培养至OD₆₂₀为0.4-0.5。

培养至OD₆₂₀为0.4-0.5的肺炎链球菌D39、R6、SPY1和D39ΔCPS-1672菌液各30 mL，离心集菌，裂解产物经8% SDS-PAGE分离后，转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%的BSA 37℃封闭2 h；加入兔抗2型肺炎链球菌荚膜多糖一抗(1∶2000稀释)，4℃孵育过夜；0.05% TBST洗膜4次，每次15 min；加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5000稀释)，37℃孵育45 min；0.05% TBST洗膜4次，每次15 min；利用EnlightTM Western特异发光检测试剂盒化学发光成像分析。

Trizol法分别提取肺炎链球菌D39和SPY1的细菌总RNA，以其为模板，Oligo dT为引物，逆转录制备D39和SPY1的cDNA。反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s。利用所制备的cDNA为模板，实时定量荧光PCR分别扩增16S rRNA、cps2A、cps2B、cps2C、cps2D，并以神经氨酸酶nanA、胆碱结合蛋白A cbpA和自溶酶A lytA作为对照参考基因。所使用引物序列见表1。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，共40个循环；72℃ 10 s。

采用酚氯仿法提取肺炎链球菌D39和SPY1细菌基因组DNA。以所提基因组DNA为模板，Pcps promoter F和Pcps promoter R为引物，PCR特异性扩增包含cps启动子序列的目的片段cps promoter(NC_008533.1 312985..313722，约750 bp)，引物序列见表1。反应条件：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 60 s，共30个循环，72℃ 10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

纯化回收的PCR产物和pEVP3空质粒分别用Sma I和Bgl II双酶切，纯化后回收目的基因片段和载体片段，T4连接酶16℃ 连接13 h。连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，筛选阳性克隆，提质粒进行双酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为： pEVP3-cps promoter^D39和pEVP3-cps promoter^SPY1。

参照试剂盒说明书进行。收集0.5 mL对数生长早期的D39-pEVP3-cps promoter^D39、D39-pEVP3-cps promoter^SPY1、SPY1-pEVP3-cps promoter^D39和SPY1-pEVP3-cps promoter^SPY1菌液，菌体沉淀用0.5 mL 含0.1% Triton的PBS溶液室温作用15 min裂解细菌；细菌裂解液加入96孔板，每孔50 μL，再加入50 μL β-半乳糖苷酶检测试剂，混匀，37℃避光反应30 min；加入150 μL β-半乳糖苷酶反应终止液终止反应，于420 nm测定吸光度。

D39、R6、SPY1和SPY1-pEVP3-cps promoter^D39菌株，分别接种于哥伦比亚血平板，37℃，5％ CO₂孵箱中培养12 h，收集细菌，4℃，9000×g离心10 min，弃上清后缓慢加入1.3 mL 4% 戊二醛固定液。送重庆医科大学电镜中心进行透射电镜检查。

D39、R6、SPY1、D39-pEVP3-cps promoter^D39和D39-pEVP3-cps promoter^SPY1菌株，分别接种于哥伦比亚血平板，37℃、5％ CO₂孵箱中培养18 h。载玻片上滴加3 μL生理盐水，无菌接种环分别挑取以上菌株样本3-5个菌落，均匀涂布。滴加3 μL抗91种血清型肺炎链球菌荚膜多糖的抗血清(omni serum)，与载玻片上的细菌悬液涂布均匀。反应5 min后，加盖盖玻片，油镜下观察各株细菌的荚膜肿胀情况。

D39、R6、SPY1、D39-pEVP3-cps promoter^D39和D39-pEVP3-cps promoter^SPY1菌株，分别接种于哥伦比亚血平板，37℃、5％ CO₂孵箱中培养18 h。挑取菌落进行菌液PCR。引物为Pcps promoter-cps2A F和Pcps promoter-cps2A R，特异性扩增各菌株基因组中cps promoter和cps2A的长片段(NC_008533.1 313494..315186，1693 bp)。条件如下：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min 30 s，共30个循环，72℃ 10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定正确后，送华大基因公司测序进一步鉴定。

数据统计分析和作图采用Graph Pad Prism 5. 01软件，数据采用非配对t检验统计分析。以P＜0.05为有统计学意义。

为验证我们前期研究所发现的SPY1的荚膜缺陷表型，我们利用Western blot分析了SPY1这一突变菌的荚膜多糖表达量。如图1所示，与野生型相比，SPY1 的荚膜多糖表达量显著下降，且以小分子组分为主；与无荚膜突变株R6相比，荚膜多糖的表达量无显著性差异。同时，SPY1的荚膜多糖表达量也与我们前期构建的荚膜缺陷株D39ΔCPS-1672无显著性差异。

图 1. 不同菌株荚膜多糖表达量的Western-blot检测 Figure 1. Detection of capsular polysaccharides in different strains by Western blotting. Lane 1: R6; lane 2: SPY1; lane 3: D39ΔCPS-1672; lane 4: D39.

图选项

我们通过测序得知，cps操纵子的启动子序列存在点突变313713 T→C，为分析该突变能否降低所在序列的调控能力，影响下游cps基因的表达，我们检测了SPY1的荚膜多糖合成基因cps2A、cps2B、cps2C以及cps2D 的mRNA水平。如图2所示，SPY1的cps2A、cps2B、cps2C以及cps2D的mRNA水平均显著降低，约为野生型水平的15%；而与荚膜合成无关的基因cbpA、lytA和nanA，其mRNA表达量与野生型无明显差异。这些结果提示，cps操纵子的启动子序列点突变313713 T→C可能引起了下游cps基因表达的下调。

图 2. SPY1与D39菌株的cps2A、cps2B、cps2C以及 cps2D差异表达的实时定量荧光PCR分析 Figure 2. Detection of differential expression of cps genes between wild strain D39 and mutant strain SPY1 by real-time quantitative PCR. A: Real - time quantitative PCR of cps2A, cps2B, cps2C and cps2D; B: Real-time quantitative PCR of cbpA, lytA and nanA.

图选项

为验证cps操纵子的启动子序列点突变313713 T→C可导致cps表达量下降，我们选用质粒pEVP3中的lacZ作为报告基因对SPY1的cps启动子的调控能力进行分析。

首先，PCR分别扩增D39和SPY1的cps启动子序列片段(图3-A)，双酶切后分别连接质粒pEVP3，并转化大肠杆菌BL21感受态。提取质粒经双酶切鉴定(图3-B)，证实目的片段已正确插入lacZ的上游，进一步测序证实成功构建重组质粒pEVP3-cps promoter^D39和pEVP3-cps promoter^SPY1 (NC_008533.1 313713 T→C)。将重组质粒分别转化SPY1和D39菌株，得到重组SPY1-pEVP3-cps promoter^D39、SPY1-pEVP3-cps promoter^SPY1和D39-pEVP3-cps promoter^D39、D39-pEVP3-cps promoter^SPY1菌株，并通过测序证实转入的启动子序列正确。

图 3. cps操纵子的启动子序列片段扩增和重组质粒双酶切鉴定 Figure 3. Amplication of fragment cps promoter (A) and double digestion of recombinant plasmid (B). A: Lane 1: cps promoterD39; Lane 2: cps promoterSPY1; M: DL2000 DNA Marker; B: Lane 1: pEVP3-cps promoterD39; lane 2: pEVP3-cps promoterD39 digested with Sma I and Bgl II; lane 3: pEVP3-cps promoterSPY1; lane 4: pEVP3-cps promoterSPY1 digested with Sma I and Bgl II; M: DL2000 DNA Marker.

图选项

如图4-A所示，与SPY1-pEVP3-cps promoter^D39相比，SPY1-pEVP3-cps promoter^SPY1的β-半乳糖苷酶活性显著下降约79%，且SPY1-pEVP3-cps promoter^D39的β-半乳糖苷酶活性与D39-pEVP3-cps promoter^D39基本一致。

图 4. 不同重组质粒转染菌株的β-半乳糖苷酶活性检测 Figure 4. Detection of β-galactosidase activities in recombinant vector-transformed strains. A: 1: D39-pEVP3-cps promoterD39; 2: SPY1-pEVP3-cps promoterD39; 3: SPY1-pEVP3-cps promoterSPY1; B: 1: D39-pEVP3-cps promoterD39; 2: D39-pEVP3-cps promoterSPY1.

图选项

我们同时比较了D39-pEVP3-cps promoter^SPY1和D39-pEVP3-cps promoter^D39菌株中β-半乳糖苷酶活性，由图4-B可知，前者的β-半乳糖苷酶活性较后者显著下降约76%。

这些结果再次表明，点突变313713 T→C会引起cps启动子序列调控能力下降。

cps操纵子的启动子序列点突变313713 T→C导致 cps表达量下降是否就是该菌株荚膜缺失的原因呢？我们首先通过透射电镜对SPY1及SPY1-pEVP3-cps promoter^D39的荚膜结构进行了观察。如图5所示，SPY1菌株荚膜缺失，与R6菌株类似；而SPY1-pEVP3-cps promoter^D39菌株荚膜得以恢复，与野生型D39菌株水平相当。由此可见，cps操纵子的启动子序列点突变313713 T→C会导致荚膜缺失。

图 5. SPY1及SPY1-pEVP3-cps promoterSPY1菌株的透射电镜图(12000×) Figure 5. Transmission electron micrographs of SPY1 and SPY1-pEVP3-cps promoterSPY1 strains (12000×). A: D39; B: R6; C: SPY1; D: SPY1-Pevp3-cps promoterD39.

图选项

为了进一步确证这一结果，我们采用抗荚膜多糖的抗体进行了荚膜肿胀实验。结果如图6所示，在油镜下观察，D39-pEVP3-cps promoter^SPY1菌株呈现两种不同的表型，一种菌体较小，多数单个或成对排列，较少呈长链状，菌体周围无透明荚膜肿胀层，荚膜肿胀实验阴性(图6-F)，与无荚膜菌株R6类似(图6-B)；而另一种菌体较大，多数呈长链状，菌体周围可见明显透明荚膜肿胀层，荚膜肿胀实验阳性(图6-E)，与野生型D39类似(图6-A)。我们利用特异性的引物扩增D39-pEVP3-cps promoter^SPY1菌株基因组中cps promoter和cps2A片段，测序证实荚膜肿胀实验呈阴性的菌株其cps2A上游启动子序列存在点突变313713 T→C，而荚膜肿胀实验呈阳性的菌株序列与野生型一致，没有发生突变。这些结果进一步证明了SPY1的荚膜显著减少甚至缺失的确是由cps操纵子的启动子序列点突变313713 T→C造成的。

图 6. 各株肺炎链球菌的荚膜肿胀结果(1000×) Figure 6. Neufeld test of different pneumococcal strains (1000×). A: D39; B: R6; C: SPY1; D: D39-pEVP3-cps promoterD39; E: D39-pEVP3-cps promoterSPY1 (NC_008533.1 313713 T→T); F: D39-pEVP3-cps promoterSPY1 (NC_008533.1 313713 T→C).

图选项

荚膜作为肺炎链球菌最主要的毒力因子，其主要成分是荚膜多糖，由荚膜多糖合成操纵子合成。荚膜多糖的合成调节是一个由调节蛋白相互作用的复杂过程，多发生在转录水平^[10]。早期研究发现，cps操纵子可能由cpsA上游的单个启动子转录形成，并且在91种采用Wzy-依赖途径合成荚膜多糖的血清型中，cps操纵子的前四个基因即cpsA-D具有高度保守性且可调控荚膜水平^{[11, 12]}。肺炎链球菌可能通过cpsA-D所编码的多蛋白磷酸化系统在翻译后水平调控荚膜的总量。有文献报道在肺炎链球菌R6、血清型33D、18C和6B中均发现cps操纵子上游调控序列中存在不同位点的点突变，并猜测这些点突变都可能降低cps调控序列的启动能力，影响CPS的表达合成量，但并无实验证据证实^{[13, 14]}。

我们在实验过程中意外地获得了一株荚膜缺失的菌株SPY1，该菌株来源于荚膜含量较高的D39菌株，且并未对其进行荚膜编码序列的改造，这引起了我们的极大关注，推测其荚膜的缺失可能存在新的机制。因此，我们将该菌株进行了全基因组测序，结果显示，其荚膜编码序列并无任何突变，但在cps启动子序列中存在点突变313713 T→C，这提示该突变很可能导致了细菌荚膜缺失的表型发生。我们首先通过实时定量荧光PCR检测SPY1菌株的荚膜合成相关基因cps2A-D的表达量，发现较野生型均显著降低；利用报告基因lacZ分析发现，该菌株cps启动子序列转录活性较野生型明显降低；进一步通过扫描电镜观察荚膜的结构和荚膜肿胀实验证实该点突变确实可导致细菌荚膜缺失。这些结果提示该点突变可引起荚膜合成基因的表达显著下调，从而导致细菌的荚膜缺失。-10区为RNA聚合酶的牢固结合位点，主要负责转录的精确起始，并且其碱基序列还可通过影响开放性启动子复合物的形成速度而控制转录的强度。本文研究的点突变位于-10区，很有可能影响了RNA聚合酶的结合，使得该启动子的下游基因转录活性下降，这有待进一步的实验证实。

cps操纵子究竟受到哪些调控子的调节？这些调控子以何种方式调节荚膜多糖的表达并影响毒力？目前并不清楚。生物信息学分析显示，cps启动子区存在与调控子ComX1、RegM、CopY、RitR结合位点相似的基序，但尚缺乏相关直接实验证据支持^[14]。另有学者发现转录因子GlnR的结合位点也与cps启动子序列有相似性，然而对比分析野生菌和其缺陷菌的cps转录水平，结果显示二者并无显著差异^[15]。我们通过实验证明cps启动子序列确实具有调控cps基因的作用，为后续通过该序列筛查其调控蛋白分子提供了坚实的基础。同时，肺炎链球菌荚膜多糖也是目前市售23价疫苗的主要成分，本研究的结果为提高荚膜生产量提供了一种新的思路，有潜在的实用价值。