2015, Vol. 55中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 何腾霞, 徐义, 李振轮. 2015
- Tengxia He, Yi Xu, Zhenlun Li. 2015
- 耐冷亚硝酸盐型反硝化菌Pseudomonas tolaasii Y-11的鉴定及其脱氮特性
- Identification and characterization of a hypothermia nitrite bacterium Pseudomonas tolaasii Y-11
- 微生物学报, 201555(8): 991-1000
- Acta Microbiologica Sinica, 201555(8): 991-1000
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文章历史
- 收稿日期：2014-12-16
- 修回日期：2015-02-01
引用本文 |
亚硝酸盐氮不仅是水体富营养化因素之一，而且对水产动物养殖以及人类健康产生极大威胁，过量亚硝酸盐氮会引起机体窒息、致癌、致畸甚至致死[1, 2, 3, 4]。据报道亚硝酸盐氮已是国内水体最严重的氮污染物之一[5]，因此，采用有效方法去除水体中亚硝酸盐氮显得尤其重要。
好氧反硝化除氮因其成本低廉、无二次污染受到广大研究者青睐。目前国内外报道的好氧反硝化细菌主要为产碱杆菌属(Alcaligenes )、假单胞菌属(Pseudomonas )、芽孢杆菌属(Bacillus )[6]、不动杆菌属(Acinetobacter )[7]、和副球菌属(Paracoccus )[8]等，已报道的假单胞菌属中主要有施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri )[9, 10]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )[11]、海洋假单胞菌(Pseudomonas nautical )[12]和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida )[13, 14]等。这些反硝化细菌多以硝酸盐为电子受体在30 ℃左右的条件下进行反硝化作用，而对于亚硝酸盐氮作为唯一电子受体的反硝化细菌报道甚少，2011年Wan 等[15]首次报道Pseudomonas sp. yy7菌株能以亚硝酸盐氮为唯一氮源，在25 ℃条件下36 h内去除80%亚硝酸盐氮，但耐冷性亚硝酸盐型好氧反硝化细菌还未见报道。本实验室分离获得一株耐冷亚硝酸盐型反硝化细菌不仅能有效去除水体中亚硝酸盐氮，而且还能显著降低水体中的总氮含量，命名为Y-11，采用形态学观察、特异性磷脂脂肪酸检测和16S rRNA基因序列分析对该菌进行鉴定，同时考察了影响该菌去除亚硝酸盐氮和总氮的因素，实验结果表明，该菌株属于托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii )，能以亚硝酸盐氮作为电子受体在15 ℃条件下高效地进行反硝化作用，在国内外尚无该种菌株具有反硝化作用的报道，是对亚硝酸盐型反硝化细菌的进一步补充。
1 材料和方法 1.1 材料1.1.1 菌株来源：新分离菌株Y-11(本实验室分离筛选获得)
1.1.2 培养基：(1)BTB酸碱指示剂培养基(bromothymol blue，BTB)[16]：1 g/L NaNO2代替1 g/L KNO3，1.5% BTB代替1.0% BTB，调pH至7.2。(2)反硝化培养基[17]：4.72 g/L乙酸钠代替4.72 g/L丁二酸钠。(3)LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，调pH至7.2，固体培养基加2.0%的琼脂粉。以上所有培养基均在1.1×105 Pa下灭菌30 min，冷却后备用。
1.1.3 主要试剂和仪器：主要化学试剂购买于国药集团化学试剂有限公司；DNA提取试剂盒购买自Thermo Scientific公司；PCR试剂购买自重庆沐生生物科技有限公司；凝胶回收试剂盒购买自BioFlux公司；克隆试剂购买自宝生物(大连)有限公司；细菌通用引物由Invitrogen公司合成。Milli Q Plus超纯水系统(Millipore)；ZHWY-211B恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器有限公司)；EDC-810双槽PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)；DYY-6C水平电泳装置(北京市六一仪器厂)；Gel Doc XR凝胶成像系统(Bio-Rad)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；UV755B可见紫外分光光度计(上海分析仪器总厂)；DU800紫外/可见光分光光度计(BECKMAN COULTER)；扫描电子显微镜(HITACHI S-3000N)。
1.2 细菌的鉴定1.2.1 形态学观察：15 ℃条件下于BTB培养基上划线培养48 h后观察菌落形态，采用革兰氏染色和电镜扫描观察细菌的形态。 1.2.2 特异性磷脂脂肪酸鉴定：取约40 mg纯菌，进行皂化、甲基化、萃取以及碱洗涤后获得上机样品，用Agilent 6850气相色谱仪(FID检测器)分析特异性磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的成分。色谱条件为：(25.0 m×200 μm×0.33 μm)，进样量1 μL，分流比10∶1，载气(H2)，尾吹气高纯N2，助燃气空气，流速0.8 mL/min。二阶程序升高柱温：170 ℃起始，5 ℃/min升至260 ℃，而后40 ℃/min升温至310 ℃，维持1.5 min。各成分脂肪酸通过MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version 6.1，MIDI，Inc.，Newark，DE)进行检测，标准品购买于美国MIDI公司，PLFA用C19：0做内标换算PLFA的绝对含量。
1.2.3 菌株16S rRNA基因序列检测：以纯化细菌的基因组DNA为模板，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。扩增体系(50 μL)：模板2 μL，引物27F和1492R各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，无菌水19 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 10 min。扩增获得的目的条带经切胶回收克隆后，送Invitrogen公司测序，将测序获得的16S rRNA 基因序列提交到国际基因库GenBank获取基因登录号。
1.2.4 细菌的系统发育分析：测序结果在NCBI网站进行BLAST同源性分析，采用软件MEGA 6.0中Clustal X程序进行多重序列比对分析，通过Neighbor-Joining方法与1000次Bootstrap的统计检验进行系统树的构建，以确定新分离菌的系统发育地位。
1.3 各因素对亚硝酸氮和总氮去除效果的影响将含1.0×108 CFU的菌悬液分别接入装有100 mL反硝化培养基的250 mL锥形瓶中，研究Y-11菌株在不同初始温度(5、10、15、20、25、30、35和40 ℃)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)、转速(0、50、100、150和200 r/min)、碳源(柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠、蔗糖和葡萄糖)以及不同亚硝酸盐氮浓度(10、50、100、150和200 mg/L)条件下对亚硝酸盐氮和总氮的去除能力，同时考察了不同接种量(0.5×108、1.0×108、1.5×108、2.0×108和2.5×108 CFU)对亚硝酸盐氮和总氮去除率的影响，以上实验均在48 h后分别测定其亚硝酸盐氮浓度和总氮浓度，并计算亚硝酸盐氮和总氮的去除率，确定不同因素对该菌株脱氮的影响。
用以下公式计算亚硝酸盐氮和总氮的去除率:R v=(T 1-T 2)/T 1×100%；其中R v为亚硝酸盐氮或总氮的去除率，T 1为反硝化培养基中亚硝酸盐氮或总氮的初始浓度，T 2为培养48 h后亚硝酸盐氮或总氮的终浓度。
为明确细菌生长情况，保证脱氮试验在细菌处于对数期时进行，本研究采用灭菌的10 μL枪头从10 ℃培养的平板培养基上挑取一个单菌落于反硝化培养基中，于20 ℃、150 r/min条件下振荡培养，每12 h测定该细菌的OD 600值，绘制细菌的生长曲线。
1.3.1 检测方法：总氮浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定[18]；亚硝酸盐氮浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定[19]；菌体生长量采用OD 600光电比浊法。
1.3.2 数据处理与分析：每组实验设3组平行，采用Excel、SPSS Statistics 17.0和Origin 8.6软件对实验结果进行统计分析与作图。
2 结果 2.1 形态学特征将菌株Y-11划线于BTB培养基上，15 ℃培养48 h后，菌落呈淡绿色、表面光滑、边缘整齐、中央略隆起，革兰氏染色为阴性。经电镜扫描观察，如图1所示，菌株Y-11呈短杆状或连珠状，无鞭毛，无芽孢。
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| 图 1 电镜扫描下的Y-11菌株(20000×) Figure. 1 Y-11 strain under the scanning electron microscope (20000×). |
磷脂脂肪酸是生物体重要组成部分之一，在不同微生物类群中具有差异性，同种微生物类群中比较恒定，且具有微生物特异性和结构多样性，这是磷脂脂肪酸图谱分析方法的重要依据。气象色谱能够简单、快速、灵敏且精确地检测出细胞所含有的特异性磷脂脂肪酸[20-22]。本研究对Y-11的特异性磷脂脂肪酸鉴定结果如表1所示，该菌与Pseudomonas -fluorescens -biotype B的相似指数为0.523，为典型的荧光假单胞菌II类型，在传统分类学上Pseudomonas tolaasii 属于Pseudomonas-fluorescens -biotype II[23]，这与该菌的16S rRNA基因鉴定结果相符合。
| Library | Sim index | Entry name |
| RTSBA66.21 | 0.159 | Ewingella -americana |
| 0.144 | Pantoea -agglomerans -GC subgroup C (Enterobacter) | |
| RCLIN66.20 | 0.523 | Pseudomonas -fluorescens -biotype B |
| 0.410 | Pseudomonas -putida -biotype A | |
| MI7H103.80 | (No Match) |
结果表明该菌的16S rRNA基因全长为1440 bp，将其进行BLAST同源性分析，发现菌株Y-11与托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii )的相似性达98%，在NCBI中查找与Y-11同源性高的菌株序列，利用MEGA 6.0，以Neighbor-Joining方法绘制该菌的16S rRNA基因系统发育树。由图2可知，该菌与Pseudomonas tolaasii 的系统发生地位最近，结合菌株Y-11的形态学和特异性磷脂脂肪酸，可确定该菌为托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii )，在国际基因库中的Accession number 为KP410741，该种菌在低温高效脱氮方面还未见报道。
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| 图 2 菌株Y-11的系统发育进化树 Figure. 2 Phylogenetic tree of the Y-11 strain. Numbers in parentheses represent the sequences in GenBank. The number at each branch points is percentage supported by bootstrap (1000 re-samplings). Bar: 0.1% sequence divergence. |
根据Y-11菌株在反硝化培养基中的生长特点绘制生长曲线，如图3所示。该菌株在反硝化培养基中48 h内可达对数生长期，且平台期时间较长，180 h内未见其衰亡期。
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| 图 3 反硝化细菌Y-11菌株在反硝化培养基中的生长曲线 Figure. 3 The growth curve of Y-11 aerobic denitrifier in the denitrification medium. |
温度是影响微生物生长代谢的重要因素之一，也是影响生物脱氮的关键因素，据报道，温度比其它因素(pH、低溶解氧浓度、有毒化合物、高有机负荷等)对生物脱氮影响更显著，温度过高或过低均能导致亚硝酸盐氮还原失败[24-25]。本研究考察了Y-11菌株在不同温度条件下去除亚硝酸盐氮和总氮的能力，结果如图4所示，表明该菌在5-40 ℃条件下均能去除亚硝酸盐氮和总氮，在10-35 ℃范围内能高效地去除亚硝酸盐氮和总氮，但在15 ℃对亚硝酸盐氮和总氮去除率最大，分别为100%和60.33%。
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| 图 4 温度对菌株Y-11除氮的影响 Figure. 4 Effects of temperature on nitrogen removal of strain Y-11. |
好氧反硝化细菌能以硝酸盐氮、亚硝酸盐氮以及溶解氧作为电子受体进行反硝化作用，不同的氧浓度可能对反硝化作用产生不同影响，从图5可以看出该菌在不同溶解氧的条件下均能有效去除亚硝酸盐氮和总氮，随着转速的增加，该菌对亚硝酸盐氮和总氮的去除率增加，在50-200 r/min的溶解氧水平下，对亚硝酸盐氮的去除率均达100%，200 r/min的溶解氧水平下，对总氮的去除率最大，为66.53%，表明Y-11是一株嗜氧菌。
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| 图 5 转速对菌株Y-11去除亚硝酸盐氮的影响 Figure. 5 Effects of shaking speed on nitrite nitrogen removal of strain Y-11. |
环境中氢离子浓度超过微生物的适宜范围将会引起微生物的原生质膜电位变化，从而影响微生物生存和酶活性[26]，此外，反硝化作用是一个产碱过程[27]，促使环境中氢氧根离子增加，进而影响酶促反应，因此研究pH值对反硝化作用的影响十分重要。菌株Y-11在不同pH条件下除氮能力如图6所示，在pH为5.0和6.0时，对亚硝酸盐氮和总氮的去除量少，培养基中亚硝酸盐氮含量基本不变； pH值为7.0-9.0时，该菌能100%地去除亚硝酸盐氮，但pH为7.0时对总氮去除率最大，为62.13%，表明该菌对高pH具有一定的耐受性。
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| 图 6 pH对菌株Y-11除氮的影响 Figure. 6 Effects of pH on nitrogen removal of strain Y-11. |
菌株生物量的大小是影响生物除氮的重要因素，接种量不足达不到反硝化除氮的作用，接种量过多会引起生物竞争营养物而致使部分细菌死亡，导致环境总氮含量去除不明显，适量的接种对提高反硝化除氮的能力具有重要意义。由图7可看到，随着接种量的增大，该菌对亚硝酸盐氮和总氮的去除率升高，当接种量为1.0×108 CFU以上时，48 h内均能将亚硝酸盐氮100%去除，对总氮的去除率高达61.75%以上，其接种量为1.5×108 CFU时，对总氮去除率最大，为65.20%，再增大接种量，对总氮的去除率没有显著差异。
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| 图 7 接种量对菌株Y-11除氮的影响 Figure. 7 Effects of inoculated quantity on nitrogen removal of strain Y-11. |
碳源不仅是微生物除氮的能源，还作为脱氮过程中的电子供体，直接或间接地影响微生物的生长速度和脱氮效率。图8表明该菌能够利用的碳源种类较为广泛，除蔗糖外，该菌可利用余下四种碳源100%地去除亚硝酸盐氮，但对总氮的去除率不尽相同，以柠檬酸钠、丁二酸钠和乙酸钠为碳源时对总氮去除率较高，可达58.68%以上，其中以乙酸钠为碳源对总氮去除率最高，为61.28%；该菌虽然能以葡萄糖为碳源有效地去除亚硝酸盐氮，但对总氮的去除不显著。
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| 图 8 碳源对菌株Y-11除氮的影响 Figure. 8 Effects of carbon source on nitrogen removal of strain Y-11. |
不同种类的细菌对亚硝酸盐氮浓度耐受程度具有差异，亚硝酸盐氮浓度过低不能满足微生物生长代谢所需要的氮源，过高可能会导致生物毒害作用，二者对微生物生长代谢均会产生不利影响。初始亚硝酸盐氮浓度影响如图9所示，表明起始亚硝酸盐氮浓度为10 mg/L时，该菌对亚硝酸盐氮和总氮的去除率最高，分别为100%和63.10%，随着起始亚硝酸盐氮浓度增加，该菌对亚硝酸盐氮和总氮的去除率降低，但并未出现细菌大量死亡的现象，且对亚硝酸盐氮和总氮均具有一定的去除率，表明该菌对高浓度的亚硝酸盐氮具有一定的耐受性，如果延长时间，也许同样能够较好地表现出生物脱氮能力。
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| 图 9 亚硝酸盐氮对菌株Y-11除氮的影响 Figure. 9 Effects of nitrite contents on nitrogen removal of strain Y-11. |
环境条件不但会影响细菌的生长代谢，而且会影响脱氮效率，适宜的环境条件和营养物质是促进微生物生长代谢和提高生物脱氮的必要条件。通常认为温度、pH值、溶解氧、碳源等都会影响反硝化除氮速率，但对不同种类的细菌生长以及脱氮速率的影响程度不尽相同，本研究探讨了温度、溶解氧、pH值等六大因素对Y-11菌株去除亚硝酸盐氮的影响，能为该菌在实际应用中提供理论基础。
细菌在反硝化培养基中生长繁殖要经过四个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，当细菌处于对数期时其个体形态与生理特性都比较稳定，且对环境适应能力强，因此为了保证本实验均在细菌处于对数期进行，根据该菌在反硝化培养基中的生长情况绘制生长曲线对研究生物脱氮具有必要性。
随着对好氧反硝化细菌研究的不断深入，大量假单胞菌属中具有好氧反硝化作用的细菌及其脱氮效率相继报道，如Guo等[28]从富营养化的太湖中分离出的好氧反硝化细菌(Pseudomonas stutzeri strain T1)，在最优条件下，对太湖中铵态氮和硝酸盐氮的去除率分别为60%和75%；Wong等[29]从温泉中分离到一株好氧反硝化细菌(Pseudomonas yangmingensis sp. nov.)，但其好氧反硝化能力还未见报道；Guo等[30]分离得到了一株异养硝化好氧反硝化细菌，能同时去除多种无机氮，对硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和铵氮每小时去除速率分别为87.5、68.3和8.33 mg/L；Ji等[31]从活性污泥中分离出的一株好氧反硝化细菌(Pseudomonas stutzeri X31)，在24 h内对硝酸盐氮的去除率可达93.7%。假单胞菌属作为最常见的好氧反硝化细菌在不断被发现，本研究分离获得的好氧反硝化细菌Y-11，属于托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii )，迄今为止，还未见该种菌能进行好氧反硝化作用除氮的相关报道。
温度是影响硝化作用和反硝化作用的重要因素之一，Huang等[32]对所分离获得的一株耐冷菌(Acinetobacter sp.)Y16研究显示，该菌株在其最优温度(20 ℃)条件对铵氮的去除率为(61.40±1.01)%。Zheng等[33]对所分离的耐冷菌(Psychrobacter sp.)研究表明，该菌在其最适温度(20 ℃)条件下，对亚硝酸盐氮的去除率为63.50%，对总氮的去除率只有31.89%。本研究所分离的耐冷好氧反硝化细菌Y-11在15 ℃条件下能够以100%和60.33%的去除率高效地去除亚硝酸盐氮和总氮，表现出了较高的耐冷反硝化能力。但在野外应用方面还有待进一步研究。
溶解氧不仅作为反硝化过程的电子受体，还能抑制反硝化相关还原酶基因的活性[34]，不同种类的反硝化细菌对溶解氧的耐受程度具有差异，如于爱茸等[35]对反硝化细菌的耐氧特性研究表明，菌株W2和YJ06在溶解氧小于1 mg/L时表现出显著的反硝化能力，但当溶解氧大于2 mg/L时，YJ06基本丧失反硝化能力，而W2在溶解氧达到4.9 mg/L的条件下除氮率还可达92%。本实验研究的Y-11菌株在200 r/min转速对应的溶解氧水平下并未表现出受抑制作用，其原因有待进一步探索。
碳源主要为反硝化过程提供能源和电子，能直接或间接影响反硝化脱氮过程和脱氮产物，如傅利剑等[36]的研究结果表明，相对柠檬酸钠而言，甘油促进异养反硝化细菌HP1(Pseudomonas alcaligenes )产生N2O，N2O是一种导致臭氧层空洞的强烈温室气体，对环境温室效应潜势是CO2的300多倍[35-38]，本实验研究了多种碳源对菌株Y-11脱氮能力的影响，但未对其脱氮产物进行分析，为了在实际应用过程中减轻反硝化脱氮产物对环境带来危害，还应对是否会产生N2O做进一步探索。
4 结论通过形态学观察、特异性磷脂脂肪酸检测和16S rRNA基因测序分析，本实验室分离的反硝化菌株Y-11为托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii )。
菌株Y-11进行生物脱氮的最适温度为15 ℃，对亚硝酸盐氮和总氮的去除率分别为100%和60.33%，在5-40 ℃温度范围内均能进行反硝化作用，是一株耐冷亚硝酸盐型反硝化细菌；该菌对高溶解氧、高pH值和高亚硝酸盐氮浓度具有一定的耐受性，且具有丰富的碳源多样性，能利用柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠等进行高效的生物脱氮作用。
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