胡杨(Populus euphratica) 是我国西北干旱半干旱地区内陆河流域唯一能够独自成林的乔木树种。对于干旱荒漠的极端气候生境具有高度适应能力^{[1, 2]}。由于具有较强的耐干旱和盐碱能力,承担着维护荒漠区生态平衡的重要作用。深入进行胡杨内生菌的研究在维护胡杨林生态安全性和林地物种多样性等方面具有重要意义^[3]。Ugen河位于天山南麓，塔里木盆地中北部，是由于塔里木河改道而干枯120多年的古河道^{[3, 4]}。河流面积3408 km²,全年平均温度10.7 ℃,年降水量51.6 mm,年平均蒸发量9921.1-2863.4 mm，海拔高度为1007-1100 m^[4]。Ugen河的胡杨林在该河道沿岸分布保存较完整，受人类活动影响较少，Ugen河与当今塔里木河距离较远，与其它古河道之间有很大的沙丘荒漠，完全脱离了塔里木河水系，具有与周边地区呈现地理隔离的特点。河岸胡杨林早已丧失通过洪水散播种子来维持基因流畅及传播内生细菌的机制，形成在时间和空间上相对封闭的生态体系^[5]。植物内生菌是一种新的微生物资源，具有潜在的应用价值。人们发现植物体内存在大量有益的内生细菌和内生真菌，内生菌对植物病害的生物防治作用及开发应用引起了科学家的广泛关注和重视^[6]。植物内生菌代谢产物种类繁多，结构多样并具有各种生物学活性，主要有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等^[7]。这些代谢产物不仅能促进植物生长、固氮、抗疾病、抗害虫和提高宿主植物抗逆境能力，而且还有些物质有着抗肿瘤、抗病毒和抗菌作用^{[7, 8]}。

Lysinibacillus 属目前包括16个被描述的种：L.bronitoleram，L.sphaericus,L.fusiformis^[9]，L.parviboronicapiens^[10]，L.xylanilyticus^[11],L.massiliensis，L.odysse,L.sinduriensis^[12],L.macroides^[13],L.mangiferihumi^[14],L.meyeri^[15]，L.contaminans^[16]，L.chungkukjangi^[17]，L.manganicus^[18],L.pakistanensis^[19],L. tabacifolii (Duan et al. 2014)^[20]。Lysinibacillus属的物种分离自土壤，人类脑脊髓液，宇宙飞船表面，潮滩沉积物等各种环境^[17]。该属的所有菌种共同特点为能够产生孢子，运动杆状，细胞壁肽聚糖类型为A4α-type(Lys-Asp)，主要脂肪酸类型为iso-C_15：0或者anteiso-C_15：0。呼吸醌类型为MK-7。Lysinibacillus属的菌株的极性脂组分有双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酸类脂(PL)^[17]。国内前人报道过有关Lysinibacillus属一些菌株的生物降解作用的研究，此类研究显示这些菌株具有一定的降解甲酚、硫化钠等污染物的作用^{[21, 22]}。本研究是首次对从胡杨茎秆液中分离得到的Lysinibacillus属菌株进行鉴定。

菌株ML-64是从Ugan河废弃古河道胡杨林胡杨茎秆液中分离筛选得到的。模式菌株L. xylanilyticus XDB9^T (=KCTC13423 ^T)，L.massiliensisCIP 108446^T(=KCTC13178^T)，L.dyssey NBRC 100172^T(=KCTC 3961^T)，L.chungkukjangi(=KCTC 2RL3-2^T)购自韩国典型培养物保藏中心。

(1) TSB培养基(g/L)：酪蛋白胨 17，磷酸二氢钾 2.5，大豆蛋白胨3，氯化钠5，葡萄糖2.5，琼脂粉 20，蒸馏水1 L。除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值至7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使高压灭菌后为7.3±0.2。

(2) R2A培养基：R2A培养基购自Difco 公司。

菌落形态和细胞形态：将菌株在LB培养基上37 ℃下培养2 d后观察菌落大小、形状、颜色和表面特征。并通过染色用光学显微镜和扫描电镜观察菌株的细胞形态。

运动性观察： 将菌株在半固体培养基上直针穿刺接种，37 ℃培养24 h后观察生长状况。若细菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，表示实验菌无运动性，而生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，表示菌株具有运动特性。

盐度试验：将0.5%的细菌培养物接种在含1%、2%、3%、4%、5%、6%和7% NaCl(W/V)的LB液体培养基中，每一浓度的液体培养基做3个平行样，37 ℃培养24 h 后在600 nm下测定OD值。

温度试验：将0.5%的细菌培养物接种在LB液体培养基上，分别在5、10、20、25、28、30、35、37、40、45、50和55 ℃下培养，每个温度梯度下做3个平行样，观察其生长状况并在600 nm下测定OD值。

耐旱性实验：用PEG6000(聚乙二醇)形成模拟干旱环境，将0.5%的细菌培养物接种到PEG6000质量浓度为5、10、15、20、25、30、35 g/100 mL的LB液体培养基中，每一浓度的液体培养基做3个平行样，37 ℃培养48 h 后在600 nm下测定OD值。

pH试验：将0.5%的细菌培养物接种到pH值分别调至5、6、7、8、9、10、11的LB液体培养基中，每个梯度都做空白对照和3个平行样，37 ℃培养48 h后560 nm下测定OD值。

硼耐受性检测实验：将LB液体培养基上生长1 d的培养物涂布在分别含有0、25、50、75、100、150 mol/L硼酸的LB固体培养基上37 ℃培养2-3 d，观察并记录生长状况。

API 50CH、API 20E和API ZYM根据API试剂条的说明指导书进行实验，测定菌株的各项生理生化指标。

氧化酶活性检测：用四甲基对苯二胺1%水溶液浸湿滤纸片后，取新鲜活化的细菌培养物涂布在浸湿的滤纸上，在10 s内出现紫罗兰色或紫色者为阳性；10-60 s内出现紫罗兰色或紫色者为延迟反应；60 s以上出现反应或不反应者为阴性。

过氧化氢酶活性检测：将菌株接种到LB平板或斜面，37 ℃培养24 h后取一环菌涂布于载玻片上，滴一滴30%的过氧化氢。立即出现气泡者为阳性，30 s后不产生气泡者为阴性。

淀粉酶活性检测：普通LB培养基中加入0.2%的可溶性淀粉，121 ℃蒸汽灭菌20 min倒平板备用。取新鲜菌种点种于平板上，30 ℃培养2-5 d，形成明显菌落后，在菌落周围滴加新鲜的碘液，观察菌落周围是否出现无色透明圆圈。

Biolog生理生化特征检测： 在平板上按照常规方法划线菌株ML-64，37 ℃培养2 d，用棉签挑到接种液(IF)³中，配成指定细胞浓度的菌悬液。将菌悬液按每孔100 μL的量加到Gen III板后孵育，以便微生物代谢后产生表型指纹图谱。所有的孔在刚开始的时候都是无色的。当孵育一段时间之后，那些能被细胞利用碳源的孔中的呼吸作用增强了。增强的呼吸作用导致四唑氧化还原染料被还原，变成紫色。而阴性孔则保持无色。孵育后，通过显紫色孔所产生的表型指纹同Biolog数据库中的数据进行比较。

抗生素敏感性检测：将LB液体培养基上生长1 d的培养物涂布在培养基平板上，再用无菌镊子在平板上放入8 mm直径的圆盘药敏纸片。37 ℃培养2-3 d，观察并记录药敏纸片周围的抑菌圈大小。测定的抗生素类型有：强力霉素(30 μg)、洁霉素(2 μg)、氨苄青霉素(10 μg)、氯霉素(30 μg)、萘啶酸(30 μg)、利福平(5 μg)、新霉素(30 μg)、链霉素(10 μg)、四环素(30 μg)、多粘菌素B(300 IU)、万古霉素(30 μg)、红霉素(15 μg)、羧苄青霉素(100 μg)、庆大霉素(10 μg)、卡那霉素(30 μg)和青霉素G(10 IU)。

微生物鉴定的遗传特征分析包括16S rRNA基因系统发育分析，(G+C)mol%含量的测定和DNA-DNA杂交分析。

DNA提取参照刘刚^[31]等的方法进行。16S rRNA基因扩增采用细菌通用引物^[32]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板约0.8 μL，10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol/L的P1和P2各0.8 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/laL)0.6 μL，加灭菌双蒸水至50.0 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，取2-3 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR产物送到上海生物工程有限公司进行16S rDNA完整长度测序。

测序结果Ezbiocloud(EzTaxon-e server)和BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/blast. cgi ) 上进行分析。用Clustal X进行多序列比对^[33]，系统进化矩阵根据Kimura模型^[34]估算，用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件采用邻接法^[35] (Neighbor-Joining)聚类分析，并构建出系统进化树。

DNA-DNA 杂交率检测和G+C mol%含量的测定委托中国工业微生物保藏中心CICC分别根据DeLey的复性速率法^[36]和Mannur的热变性法^[37]来完成。

菌株ML-64在TSA固体培养基上，37 ℃下培养48 h后，形成直径为2.0-4.0 mm圆形，表面光滑的淡黄色菌落。在显微镜下观察菌株细胞形态为杆状，产生芽孢，革兰氏阳性，穿刺实验显示穿刺线边缘清晰证明该菌不具有运动性(图1)。

图 1. 菌落和细胞形态 Figure 1. Chara cteristics of strain.A: strain ML-64 on TSA medium; B: microscopical characteristics of strain ML-64(B, bar 10μm); C: cell morphology of ML-64 under the scanning electron microscope(C, bar 1 μm).

图选项

菌株ML-64在含有0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%的NaCl的培养基上能生长，最适盐浓度为0-2.0%(图2-A)。在LB液体培养基10、20、25、28、30、37、40、42、45和50 ℃下能够生长，最适生长温度为37 ℃(图2-B)。在PEG6000质量浓度为5、10、15、20和25 g/100 mL 的LB液体培养基中能生长(图2-C)，表明该菌株有一定的耐干旱能力。菌株ML-64在pH分别为7、8、9的培养基上能生长，最适生长pH为7。硼耐受性检测结果表明，菌株ML-64能在分别含有0、25、50 mol/L硼酸的LB固体培养基上生长。而硼酸浓度为75 mol/L时菌株不能生长。

图 2. 菌株ML-64菌株在条件下的生长情况 Figure 2. Effect of temperatures (A), PEG6000 (B) and sodium concentration(C) on the growth of strain ML-64.

图选项

菌株ML-64 API ZYM、API 20E和其它酶学活性测定结果显示：菌株ML-64具有碱性磷酸酶,类脂酯酶,酸性磷酸酶，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶,α-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，精氨酸双水解酶，脲酶，色氨酸脱氨酶，氧化酶,过氧化氢酶活性。能水解明胶，VP-实验为阳性。菌株ML-64和相关模式菌株的酶活性详细结果见表1。在API 50CH实验中菌株ML-64和模式菌株不能发酵任何一种糖类。此结果与前人所研究的Lysinibacillus属的其它菌种的API 50CH实验结果一致。菌株ML-64经用Biolog 鉴定系统生理生化测定，结果表明菌株可利用的碳源有：L-丝氨酸、丙酮酸甲酯、α-酮-丁酸和乙酰乙酸。

抗生素敏感性检测结果表明，菌株ML-64对多粘菌素B(30 μg)、新生霉素(30 μg)、青霉素G(10 U)不敏感；而对羧苄青霉素(100 μg)、氨苄青霉素(10 μg)、万古霉素(30 μg)、四环素(30 μg)、链霉素(10 μg)、氯霉素(30 μg)、庆大霉素(10 μg)、卡那霉素(30 μg)和林可霉素(2 μg)敏感。

图 3. 菌株ML-54的脂肪酸类型图 Figure 3. Polar lipid profiles after separation by two-dimensional TLC. DPG, diphosphatidylglycerol; PG, phosphatidylglycerol; PE,phosphatidyl-ethanolamine; PL1-5, unidentified phospholipids; L1-4, unidentified lipid.

图选项

对菌株ML-64的16S rRNA基因PCR扩增产物进行测序，获得了1517 bp的全序列。将序列提交到GenBank数据库注册，获得序列注册号为KC609752。与GenBank 数据库序列进行BLAST比对，菌株ML-64与L.chungkukjangi、L.sinduriensis、L. massiliensis和L.odysseyi的16S rRNA基因序列相似性分别为100%、99.1%、97.14%、97.11%。并调聚与该菌株同源性的典型菌株序列，采用邻近法构建16S rRNA基因序列的系统进化树(图4)。菌株ML-64与L.chungkukjangi、 L.sinduriensis、L. massiliensis和L.odysseyi系统发育关系密切，尤其是菌株ML-64与L.chungkukjangi遗传距离最小，以99%的自展支持率聚类于同一个亚分支上。这结果表明菌株ML-64与L.chungkukjangi的16S rRNA基因序列高度保守，未发生异化。

图 4 用邻近相连法构建的系统进化树 Figure 4. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method. The GenBank accession numbers are given in parentheses; Numbers at branching points are bootstrap values; Bar, 0.005 substitutions per nucleotide position;Evolutionary analyses were conducted in MEGA 4.0.

图选项

菌株ML-64 DNA的解链温度为69.1 ℃，按公式计算出菌株ML-64的G+C mol%含量为36.8%。DNA-DNA分子杂交实验结果表明，菌株ML-64与L.chungkukjangi 2RL3-2^T和L.massiliensisCIP108446^T之间的杂交率为82.0%和50.9%，而与L.xylanilyticus XDB9^T 之间的杂交率为22.2%。该杂交数据表明，菌株ML-64与L.chungkukjangi 2RL3-2^T属于同一个物种，但基因组结构上已产生较大的分化。

Lysinibacillus属的各种分离自多种环境。菌株ML-64是从Ugan河废弃古河道胡杨林胡杨茎秆液中分离筛选得到的胡杨内生菌。Ugan废弃古河道(断流废弃126年)沿岸胡杨分布密度较高，断流年代比较久远，形成了在时间和空间上相对隔离封闭的生态体系统^[38]。鉴定结果表明，菌株ML-64有着与Lysinibacillus 属成员一致的表性特征，例如：菌落圆形，表面光滑整齐，细胞形态为短杆状，能产生芽孢，革兰氏阳性；呼吸醌，极性脂与优势脂肪酸组分均与Lysinibacillus 属的其他菌种具有高度的一致性。菌株ML-64与L.chungkukjangi、L.sinduriensis、 L.massiliensis、L.xylanilyticus之间的16S rRNA相似率分别为100%、99.01%、97.14%、97.11%。用邻近法、最大相似法和最大简约法(本文省略)构建的进化树上菌株ML-6与L.chungkukjangi以99%的靴带值聚类在同一分支上，表明ML-64与L.chungkukjangi 的16S rRNA基因高度保守未发生异化。ML-64与L.chungkukjangi 2RL3-2^T 之间的基因组杂交率为82%，高于鉴定一个新种的杂交率阈值70%。ML-64的基因组(G+C)mol%含量为36.8%，低于菌株L.chungkukjangi 2RL3-2^T的(G+C)mol%含量(41.8%)，这组数据揭示这两个菌株虽隶属于同一个物种，但在基因组结构水平上已产生了较大的异化。由于菌株ML-64的生存环境不同，在环境条件的胁迫下选择了不同的适应性与进化途径，基因组结构已产生了较大变异。

菌株ML-64与L.chungkukjangi 在最适生长温度、盐浓度、其他生理生化等方面都表现出了较大的差异。虽然菌株ML-64与L.chungkukjangi 生长温度范围均为10-45 ℃，但L.chungkukjangi 的最适生长温度为30 ℃^[17]，ML-64的最适生长温度为37 ℃(图2-C)。 L.chungkukjangi 的盐浓度生长范围0-3%，最适盐浓度为0%^[17]；ML-64的盐浓度生长范围是0-6%，最适盐浓度为0-2%，对盐的耐受性有较大幅度的增强。这一趋势也在这两个菌株的脂肪酸组分和优势脂肪酸的类型与比例上有所反映(表2)。脂肪酸主要构成细胞双层膜结构，在调节细胞的渗透压与物质和能量代谢方面起着关键性作用。L.chungkukjangi的优势脂肪酸是anteiso -C_15：0(47.3%)、iso-C_16：0(16.3%)和anteiso-C_17：0(11.3%)，ML-64的优势脂肪酸为iso-C_15：0(55.05%)和anteiso-C_15：0(20.7%)。ML-64在PEG6000质量浓度为5-25 g/100 mL 的LB液体培养基中能生长(图2-C)，脂肪酸组分及细胞膜通透性能上的变化可能是ML-64具备一定抗旱能力的成因。ML-64与L.chungkukjangi在类脂酯酶(C8)、精氨酸双水解酶活性和VP实验有明显的差异(表1)。上述生理生化特征上的差异进一步揭示了ML-64在基因组结构上与L.chungkukjangi已产生了较大程度的异化，ML-64选择性地适应了胡杨内生环境。

菌株ML-64在生理生化特征上与Lysinibacillus 属保持了较高的一致性，虽然和该属的其他菌株及L.chungkukjangi存在一定的差异，但与L.chungkukjangi具有最高的相似性。在分子遗传学特性上，ML-64与L.chungkukjangi 的16S rRNA基因序列表现出100%的相似性，然而在基因组(G+C)mol%与基因组杂交率上都产生了较大幅度的变异。二者的基因组杂交率仅为82%，没有低于不同种的杂交阈值70%这一界限。因此将菌株ML-64定为L.chungkukjangi 的新变异种。菌株ML-64的16S rDNA序列注册号为KC609752。

胡杨是生命力很强的植物，在寒冷、干旱、炎热的环境条件下都能生存，并在高度的盐渍化土壤中能生长。成片天然胡杨林的存在，对改善当地气候、阻挡风沙侵袭具有积极作用。胡杨通过发达的根系从土壤中吸收盐分，增强细胞的渗透压，提高吸收土壤中水分的效率^[39]。胡杨能适应干旱高温环境的关键要素是其茎秆液^[3]。胡杨茎秆液是胡杨应对高蒸发量的蓄水储备。胡杨树利用发达的根系吸收地下水，通过微管组织输送到树干、树枝及其末端的体内蓄水。胡杨树中的茎秆液量有季节性的变化规律。胡杨茎秆液的累积开始于春季，在夏季其量达到最高从而应对烈日照射下的蒸腾，秋季减少借此减轻负担，冬季消失以防植物躯干冻裂^[40]。这种独特的生理作用显示了胡杨特殊的生存环境。Forchetti等^[41]研究发现利用从干旱土壤的向日葵根际分离出的细菌处理向日葵种子能够增强向日葵幼苗的耐旱性。国内已有筛选耐旱菌株^[42]、用丛枝菌根真菌提高柑橘耐旱性的相关报道^[43]，然而利用内生菌提高植物耐旱性的研究较少。从茎秆液分离得到的菌株ML-64，作为胡杨内生菌有一定的耐旱、耐盐、耐高温的特性，可为拓宽内生细菌资源的应用范围和利用价值提供一定的科学基础，并且为增强植物耐旱、耐盐、耐高温等特性及改善其品质特性提供新的思路。