细菌生物被膜(Biofilm)是细菌粘附于一个物体(或人体组织)的表面，通过分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将自身包绕其中而形成的大量高度组织化、系统化的膜样聚合物^[1]，自然界中大部分细菌以生物被膜这种多细胞的复杂结构形式而存在。研究表明，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等致病性弧菌能形成生物被膜，成熟被膜能增强细菌的存活能力、毒力因子表达以及对环境压力的耐受性^[2]。副溶血性弧菌V. parahaemolyticus是水产品中重要的食源性致病菌，已发现该菌能分泌不同类型的粘附因子(包括鞭毛、菌毛等)定殖于鱼、虾、蟹和贝类等多种水产品表面，形成生物被膜^[3]，造成食品安全隐患。然而，目前对V. parahaemolyticus生物被膜的控制主要停留在抗生素^[4]或化学清洁剂疗法^[5]，在水产品工业中应用存在诸多问题，如出现抗生素耐药型菌株^[6]等。

近年来，利用可食用植物素抑制致病菌生物被膜形成逐渐成为国内外研究的热点。Packiavathy等^[7]发现天然无毒的植物化学成分姜黄素在亚抑菌浓度下能显著抑制V. parahaemolyticus、V. vulnificus和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)生物被膜形成及毒力因子产量。白藜芦醇(3,4,5-三羟基-二苯乙烯)是一种天然存在的植物多酚及植物抗毒素类物质，主要存在于葡萄、浆果等果皮中，是红酒中的主要活性物质，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌、神经保护以及潜在的抗癌效用^[8]。近年来，部分研究显示白藜芦醇能有效抑制致病菌毒力因子的表达及生物被膜形成，Guo等^[9]首次报道亚抑菌浓度白藜芦醇能显著抑制V. cholerae生物被膜形成，Morinaga等^[10]发现白藜芦醇处理能显著干扰肾脏细胞中霍乱毒素诱导的cAMP累积，Lee等^[11]发现白藜芦醇能有效抑制大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜形成。可见，白藜芦醇是一种天然高效的抗生物被膜活性成分，然而白藜芦醇对水产品中V. parahaemolyticus生物被膜的影响报道较少，并且白藜芦醇抗食源性致病菌生物被膜的作用机制仍不明确。

近年来，基于新一代高通量测序平台的转录组测序(RNA-Seq)技术成为大规模获取转录组相关生物信息的有效手段之一，具有通量高、成本低、灵敏度高等优点。本研究首先分析亚抑菌浓度白藜芦醇对V. parahaemolyticus生物被膜形成的影响，并采用RNA-Seq技术解析白藜芦醇作用下该菌的转录组信息变化，旨在分子水平识别重要差异表达基因功能及其参与的代谢通路，并利用荧光定量PCR进一步验证与生物被膜形成相关的重要差异表达基因，初步探索白藜芦醇抑制V. parahaemolyticus生物被膜形成的分子机制。

白藜芦醇(Resveratrol)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；RNase-Free DNase购自Qiagen公司；TRIzol^® Plus RNA Purification Kit和SuperScript™ Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix购自美国Invitrogen公司；LB、TSB等培养基购自青岛海博生物技术有限公司。主要仪器包括：TM-1000型台式扫描电镜；CFX384多重实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；NanoDropl000微量紫外可见分光光度计；Illumina HiSeq^TM 2000 测序平台(Illumina Inc.，USA)。

将白藜芦醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)，经0.22 μm膜过滤后，用无菌水稀释到合适浓度。参考Silván等^[12]方法，取1%过夜活化的菌种接种于3% NaCl LB肉汤(菌体初始浓度约10⁵ CFU/mL)，分别加入终浓度为160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 μg/mL的白藜芦醇，在30 ℃摇床培养24 h后，测定600 nm处吸光值，每个浓度梯度组设3个平行。以添加等量溶剂DMSO为对照组，MIC是指经24 h培养后实验组无明显生长的最低浓度。

将上述菌悬液与含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)以1:3(V/V)混合后，加入24孔板，分别加入工作浓度为1、5、10 μg/mL的白藜芦醇，以添加等量DMSO组作为空白对照，30 ℃静置培养36 h,采用结晶紫定量测定生物被膜^[13]。另一组相同条件下在24孔板中加入无菌玻璃片(1 cm×1 cm)，玻璃片用于扫描电镜观察。

参照Nithya等^[14]方法，V. parahaemolyticus分别接种于添加终浓度为1、5、10 μg/mL白藜芦醇的3% NaCl TSB培养基中，以添加等量溶剂DMSO为对照组，在30 ℃孵育36 h后采用苯酚硫酸法^[15]测定EPS。

参照Kim等^[16]方法，1.4中制备的玻璃片经2.5%戊二醛溶液4 ℃固定过夜后，用PBS溶液漂洗3遍后，在1%锇酸溶液中固定1-2 h。再用PBS溶液洗3遍后，分别用50%、70%、80%、90%、95%乙醇脱水各15 min后，用100%乙醇脱水2次，每次20 min。经50%醋酸异戊酯(醋酸异戊酯/乙醇)置换20 min后，最后加入醋酸异戊酯溶液过夜置换。CO₂临界点干燥仪干燥，喷金，TM-1000型扫描电镜观察被膜结构。

取过夜菌液1 mL接种至99 mL含3% NaCl LB培养基中30 ℃摇床培养4 h (对数生长中期)，加入终浓度为10 μg/mL白藜芦醇，以添加等量DMSO为对照组，相同条件下继续培养3 h后离心富集菌体。根据TRIzol^®试剂盒说明书提取RNA,总RNA用RNase-free DNase进行消化处理去除残留DNA。使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDropl000微量紫外分光光度计检测RNA样品的片段大小、浓度(μg/μL)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)。

将rRNA去除后，加入破碎缓冲液将mRNA打断成短片段后反转录，对获得的cDNA做末端修复、加PolyA并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳进行目的片段大小选择后，进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM 2000进行测序，所得序列通过比对(有参考基因组)形成全基因组范围的转录谱。实验中参考基因为V. parahaemolyticus RIMD 2210633基因组数据库(NCBI下载)。本研究中的序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve数据库，登录号：SRX1074993。

转录组数据分析主要基于TopHat和Cufflinks软件处理样品的差异表达基因，根据基因的表达量(RPKM值)计算该基因的差异表达倍数，错误发生率(false discovery rate,FDR)多重检验校正P值。研究中将FDR≤0.01，且差异倍数在2倍及以上的基因定义为白藜芦醇处理后的差异表达基因。采用Gene Ontology、KEGG分析和SwissProt功能注释，分析差异表达基因生物学功能和分类汇总分析。

参照1.7方法培养获得菌体，分别提取总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,获得的cDNA在-20 ℃备用。荧光定量PCR反应体系(20 μL)：SDW 8 μL；Power SYBR® Master Mix (2×)，10 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；模板cDNA 1.0 μL。反应条件：95 ℃ 1 min；40个循环(95 ℃ 15 s; 63 ℃ 25 s,收集荧光)；熔点曲线分析，55-95 ℃。每个样品重复3次，以16S rRNA基因作为内参基因，各个基因的相对表达水平以2 ^{(Ct内参基因－Ct目的基因)}进行统计分析。引物序列如表 1所示。

采用二倍稀释法测定白藜芦醇对V. parahaemolyticus的抑菌活性，结果见图 1。经30 ℃培养24 h后，白藜芦醇在20 μg/mL时能显著抑制细菌的生长(P<0.05)，浓度越高抑制活性越强(图 1-A)。可见，白藜芦醇对V. parahaemolyticus的最小抑菌浓度为20 μg/mL。并分析白藜芦醇在1、5、10、20 μg/mL浓度下对该细菌整个生长过程的影响(图 1-B)。结果发现，在亚抑菌浓度下整个生长曲线过程中白藜芦醇均没有抑制菌体细胞生长(P>0.05)，而20 μg/mL白藜芦醇能显著减慢对数生长期和稳定期的细菌生长(P<0.05)。

图 1. 白藜芦醇对V. parahaemolyticus抑菌活性 Figure 1. The antimicrobial activity of resveratrol against V. parahaemolyticus. None: containing no resveratrol and solvent DMSO. Means in the columns with the different letters were significantly differences (P<0.05).

图选项

分析白藜芦醇在亚抑菌浓度下对V. parahaemolyticus生物被膜形成能力的影响，如图 2所示。结果表明，白藜芦醇1、5、10 μg/mL对V. parahaemolyticus生物被膜形成抑制率分别为10.40%、21.03%和39.10% (图 2-A)，而对其胞外多糖的抑制率分别为3.38%、36.09%和48.49% (图 2-B)。白藜芦醇对V. parahaemolyticus生物被膜和胞外多糖分泌的抑制表现相似的趋势，均呈现浓度依赖效应。扫描电镜照片(图 2-C、D)直观地显示10 μg/mL白藜芦醇处理后V. parahaemolyticus生物被膜结构的变化。对照组玻璃片表面粘附大量菌细胞，且被细菌所分泌的一层厚厚胞外聚合物所包裹，而处理组的菌群结构显得松散，粘附量及胞外分泌物显著减少，菌体裸露。

图 2. 亚抑菌浓度白藜芦醇对V. parahaemolyticus生物被膜及其胞外多糖产量的影响 Figure 2. The anti-biofilm capability of resveratrol at sub-MIC against V. parahaemolyticus. A: Quantitative assessment of biofilm biomass; B: Quantitative analysis of biofilm EPS; C: Scanning electron microscopy (SEM) images of untreated control; D: SEM images of treated sample by resveratrol at 10 μg/mL. Data was expressed as means± standard deviations (n=3). None: containing no resveratrol and solvent DMSO. Means in the columns with the different letters were significantly differences (P<0.05).

图选项

图 3. V. parahaemolyticus转录组unigene的GO功能分类 Figure 3. Gene ontology of V. parahaemolyticus unigene in digital transcriptome. A, B and C represent cellular component, molecular function and biological proces, respectively. The percent of each metabolic pathway was shown.

图选项

以16S rRNA基因作为内参基因，采用qRT-PCR检测白藜芦醇作用下与生物被膜密切相关的4个基因luxS、trh、tlh和flaA的转录水平变化，结果如图 4所示。与对照组相比，白藜芦醇处理组4个基因luxS、trh、tlh和flaA的表达量均出现明显的下调(P<0.05)，对照组与处理组相应基因表达量的比值分别为2.60、2.83、2.83、3.81，相应的RNA-Seq测定转录产物比值为3.53、2.62、2.62、2.79，两种方法分析所得基因表达水平趋势基本一致，表明RNA-Seq技术结果较可靠。

图 4. RT-PCR检测V. parahaemolyticus 4个差异表达基因 Figure 4. Detection of four gene expression profiles by qRT-PCR. Means in the columns with the different letters were significantly differences (P<0.05).

图选项

V. parahaemolyticus是海水养殖中的一种重要条件致病菌，食源性致病菌生物被膜的形成给食品安全控制带来不可忽视的潜在危害。近年来，研究发现香豆素、姜黄素、肉桂醛和丁香酚等多种可食用植物素均具有抗致病菌生物被膜的潜能^{[17, 18, 19, 20]}。本研究发现白藜芦醇在亚抑菌浓度下对V. parahaemolyticus生物被膜和胞外多糖具有较强的抑制效果，表明该菌的生物被膜对白藜芦醇较为敏感。Lee等^[21]发现10 μg/mL白藜芦醇及其衍生物反式对二苯代乙烯能显著抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)溶血素分泌。

经RNA-Seq及GO功能、SwissProt功能注释和KEGG通路分析显示，白藜芦醇作用下V. parahaemolyticus基因水平发生明显的变化，差异表达基因主要参与物质合成与转运、新陈代谢、SOS应答反应等生物学过程。并发现在白藜芦醇作用下V. parahaemolyticus在蛋白运输、细菌分泌系统和双组分系统通路发生变化，在差异表达的5个膜蛋白基因中，编码外膜蛋白合成的w(VP_3063)、yedS(VP_3132)、ompK(VP_2265)呈现表达下调。而外膜蛋白Omp基因簇中ompA已经在很多细菌中被证实作为一种粘附素在生物被膜形成过程中促进细菌间及细菌与表面间的交流^{[23, 24]}。除了细菌本身分泌的蛋白质，生物被膜基质还包括大量的周质蛋白、细胞质蛋白、内膜及外膜蛋白，其中膜蛋白已被发现是V. cholerae生物被膜的重要基质蛋白之一^[25]。Park等^[26]发现V. vulnificus中OmpA蛋白的上调表达可能受3′,5′-环二鸟苷酸(cyclic di-GMP)调控，进而促进其生物被膜形成过程。可见，白藜芦醇的添加影响细菌蛋白运输和分泌通路，导致细胞膜蛋白及一些重要基质蛋白的改变，从而干扰细菌在宿主表面的粘附及生物被膜的成熟。

研究表明，白藜芦醇的添加引起V. parahaemolyticus luxS的表达量显著下调。由luxS编码合成的AI-2信号分子是许多细菌进行种内和种间交流的群体感应(Quorum sensing,QS)语言^[27]，参与调控细胞毒力因子表达^[28]、生物被膜形成^[29]、毒素分泌^[30]等多种过程。已发现弧菌属(Vibrio sp.)存在luxM/N、cqsA/S、luxS/AI-2三种类型QS系统，生物被膜的形成、毒力因子的诱导主要受到luxS/AI-2相关的QS系统调控^[31]。双组分系统通路也发现，白藜芦醇不仅引起OmpR家族、NarL家族和NarC家族的变化，还能影响Lux家族、LuxR家族及其他家族。可溶性的信号分子能影响RpfC和RpfG,进而通过环二鸟苷酸抑制Clp和δ54调控生物被膜、运动性和毒力的活性，该通路在分子层面部分解释了其在群体感应和生物被膜的表型变化及关联。相似地，Shafreen等^[19]已证实肉桂醛及其衍生物通过抑制luxS基因表达，影响酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的生物被膜形成及毒素分泌。秦皮乙素能显著抑制E. coli O157: H7中志贺类毒素基因(stx2)表达，并影响QS基因(lsrA,luxS)的表达^[17]。Qin等^[32]运用RNA-Seq分析发现白藜芦醇主要通过干扰S. aureus QS系统及毒力因子荚膜多糖的合成抑制其生物被膜的形成。因此，luxS基因可作为潜在的靶点来抑制致病菌生物被膜的形成及毒力因子的表达。

依赖于鞭毛调控的运动性可影响细胞与接触表面的交流与粘附，与生物被膜形成密切相关^[33]。Rendón等发现E. coli O157: H7菌毛蛋白与其生物被膜的形成密切相关^[35]，已发现V. parahaemolyticus菌毛与黏附作用也有关^[34]。本研究中V. parahaemolyticus在白藜芦醇作用下鞭毛蛋白A及菌毛组装蛋白PilQ出现显著下调，Lee等^[11]运用qRT-PCR分析发现20 μg/mL白藜芦醇通过抑制E. coli O157: H7菌毛基因(csgA,csgB)及鞭毛运动性基因(fimA,fimH,flhD,fliA,motB,qseB,qseC)表达抑制生物被膜形成。因此，白藜芦醇可通过干扰鞭毛的组装通路影响细菌的运动性^[7]，并抑制菌毛形成干扰V. parahaemolyticus的粘附过程。

外源白藜芦醇添加后，V. parahaemolyticus多个新陈代谢过程相关基因表达量明显下调，其中细胞色素C类蛋白torC基因作为呼吸链中一个重要的电子载体下调表达最显著。此外，三羧酸循环的多种酶等均参与糖脂代谢，直接或间接影响细菌生理学状态。因此，推测V. parahaemolyticus在外源生物被膜抑制剂胁迫下，细胞可能出现代谢重构，通过降低自身的新陈代谢水平以减弱对白藜芦醇的敏感性。Qin等^[31]也发现乌索酸在抑制抗甲氧西林S. aureus生物被膜形成的同时，细菌自身与氨基酸代谢相关的arcA、arcB2、arcD和aur基因出现下调，提示与代谢相关基因与生物被膜存活密切相关。此外，转录表达上调的基因还有编码多药耐药相关蛋白(Mrp)和伴侣蛋白，包括Mrp K(VP_3064)，Mrp B(VP_3065)，TorD(VP_1450)，可能与启动SOS应答，通过激活Mrp表达抵御白藜芦醇渗透入细胞核内，并调动热休克蛋白来修复可能出现的损伤。

qRT-PCR证实，白藜芦醇作用下该弧菌中4个与生物被膜形成密切相关的luxS、trh、tlh和flaA基因表达量显著低于对照组，与转录组测序分析结果相符。相似地，Lee等^[11]运用qRT-PCR测定白藜芦醇及其多聚物作用下与生物被膜相关基因的表达量变化，发现其显著抑制了E. coli O157:H7中菌毛基因(csgA,csgB,csgC,csgD,csgF,csgG)、QS基因(larA,luxS,tnaA)及运动性基因(flhD,motB)。

本研究发现亚抑菌浓度白藜芦醇能显著抑制V. parahaemolyticus生物被膜的形成。通过转录组数据的分析、挖掘及qRT-PCR验证，发现在白藜芦醇作用诱导下V. parahaemolyticus中新陈代谢、QS系统、膜蛋白分泌及溶血素分泌等通路可能参与调控生物被膜的形成，白藜芦醇可能主要通过干扰LuxS相关的QS系统、鞭毛合成及蛋白分泌通路，影响溶血素蛋白等毒力因子、鞭毛的运动性、胞外多糖合成，从而干扰细胞的粘附和定殖及胞外分泌物的产生，协调控制生物被膜形成，其深层机制仍有待于进一步研究。