酪氨酸酶是普遍存在于微生物、植物、无脊椎动物及哺乳动物中的一种多酚氧化酶^[1]。在氧气的参与下，酪氨酸酶能将单酚类化合物(如酪氨酸)氧化为多酚类化合物(如L-多巴)及醌类化合物进而形成肉眼可见的黑色素^[2]。酪氨酸酶属于三型铜蛋白，其酶活性中心含有一个双核的铜原子位点^[3-4]，铜原子与分子氧形成侧面桥连，从而发挥催化活性。因此酪氨酸酶发挥催化活性需要铜离子的参与。

目前来源于假单胞菌^[5]、曲霉菌^[6]、木霉菌^[7]、漏斗棱孔菌^[8]等微生物的酪氨酸酶基因均已被分离鉴定。其中双孢蘑菇来源的酪氨酸酶是真菌中最早被研究的^[9]。酪氨酸酶在食品药品生产、医学、美容、生物传感器^[10]及废水处理等多个领域中都发挥着重要作用。来源于双孢蘑菇的酪氨酸酶是目前唯一商品化的酪氨酸酶，但由于提取纯化的技术限制，商品化酪氨酸酶的价格昂贵且纯度不高。已有文献报道，商品酪氨酸酶中含有杂蛋白、碳水化合物、酚类化合物及漆酶等可能会干扰酪氨酸酶活性鉴定的杂质^[11]，因此对于获得低成本、高纯度、相对安全的异源酪氨酸酶的研究具有重要的意义。

酿酒酵母作为真核模式生物，且为非致病菌，用于表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶具有天然的优势，是进行微生物发酵生产黑色素的合适宿主。除此之外，针对酿酒酵母中酪氨酸产量测定方法的缺陷，酪氨酸酶在酿酒酵母中的表达亦可作为酪氨酸产量的生物传感器，为高通量筛选高产酪氨酸菌株提供了可能^[12-13]。

本文在酿酒酵母中异源表达了双孢蘑菇来源的酪氨酸酶基因PPO2，对酪氨酸酶蛋白进行了分离纯化和鉴定，并对其在体外的催化条件进行了探索，特别对酪氨酸酶在酿酒酵母胞内的酶学特性进行了探究，为其在酿酒酵母中作为酪氨酸产量的生物传感器提供了实验依据。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 本研究中用到的菌株和质粒如表 1所示。

1.1.2 培养基和生长条件: YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10。营养缺陷培养基SC-ura (g/L)：葡萄糖20，硫酸铵5，无氨基酵母氮源1.7，无尿嘧啶氨基酸混合物1.3。LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。氨苄青霉素的使用浓度为100 μg/mL。固体培养基加入20 g/L琼脂粉。BY4741的培养条件为30 ℃、200 r/min；大肠杆菌培养条件为37 ℃、200 r/min。

1.1.3 主要试剂: 实验所用PCR相关试剂、限制性内切酶、RNAiso Plus试剂盒、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；Super-Bradford Protein Assay Kit试剂盒、大肠杆菌感受态DH5α购自康为世纪生物科技有限公司；质粒快速小提试剂盒购于天根生物科技公司。

1.1.4 主要仪器设备: PCR热循环仪、DNA凝胶电泳仪、冷冻离心机、蛋白质半干转膜仪、752紫外可见分光光度计、凝胶成像仪、915型Accument pH计。

1.2 酪氨酸酶基因表达载体的构建

按照TaKaRa公司的RNAiso Plus及PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书提取双孢蘑菇的总RNA并合成第一链cDNA，利用引物对PPO2-F (ATAACTAGTATGTCGCTGATTGC TACTGT)和PPO2-R (ATAAGATCTTCAATGGTG ATGGTGATGATGACCACCGTTAATAACATGCACCGCGA)进行PCR扩增克隆得到PPO2基因，并连接至pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α。测序验证序列正确的质粒与表达载体pSP-G1均通过Bgl Ⅱ、Spe Ⅰ双酶切后回收并连接，转化大肠杆菌，通过酶切验证后命名为pSP-G1-PPO2并保存菌种。

1.3 酪氨酸酶在酿酒酵母中的表达及纯化

将质粒pSP-G1-PPO2转化至酿酒酵母BY4741中，利用营养缺陷标记URA3进行筛选，涂布至SC-ura培养基平板。通过菌落PCR验证正确的转化子命名为SC-PPO2。分别接种SC-PPO2与对照SC-pSP-G1菌株至5 mL SC-ura液体培养基中，培养至OD₆₀₀为1.5–1.7时收集菌体，加入100 μL裂解液和50 mg玻璃珠振荡破碎10 min，4 ℃离心收集上清。取100 μL上清液，加入25 μL上样缓冲液，加热变性10 min后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，银染显色及Western blot蛋白杂交。当凝胶电泳蛋白条带与预期一致后进行扩大培养，按照上述方法，同样进行细胞破碎，收集上清液，进行Ni-NTA柱纯化蛋白并脱盐处理。根据康为世纪Super-Bradford Protein Assay Kit试剂盒说明绘制BSA标准曲线，计算纯化样品中的蛋白浓度，纯化后的蛋白于–80 ℃保存。

1.4 酪氨酸酶活力的测定

酪氨酸酶活力的测定参照文献[14]中的方法，以L-酪氨酸和L-多巴为底物，在酶促作用下生成产物黑色素，利用黑色素最大光吸收波长为475 nm，通过分光光度计测定黑色素光吸收值来测定酪氨酸酶的活力。

1.5 酪氨酸酶的体外酶学特性

1.5.1 底物浓度与酪氨酸酶活力的关系: L-酪氨酸浓度设置为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L；L-多巴浓度设置为1、2、5、10、15、30 mmol/L。取100 μL酶液与2.9 mL分别含有底物L-酪氨酸或L-多巴的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)充分混匀后测定反应体系的起始OD₄₇₅，分别于常温条件下反应60 min与15 min，反应结束后测定终止OD₄₇₅。

1.5.2 温度与酪氨酸酶活力的关系: L-酪氨酸浓度2 mmol/L，L-多巴浓度15 mmol/L，同样取100 μL酶液与2.9 mL含有底物的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)混匀后测定初始OD₄₇₅，分别置于20、30、37、45、55、65、75 ℃充分反应，L-酪氨酸与L-多巴反应体系分别于60 min和15 min后测定终止OD₄₇₅。

1.5.3 pH与酪氨酸酶活力的关系: 分别配置含2 mmol/L L-酪氨酸，15 mmol/L L-多巴的磷酸盐缓冲液，分别将pH调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。同样取100 μL酶液与2.9 mL含有底物的磷酸盐缓冲液混匀后测定初始OD₄₇₅，分别于常温条件下反应60 min与15 min，反应结束后测定终止OD₄₇₅。

1.6 酪氨酸酶在酿酒酵母中的酶学特性测定

1.6.1 pH与酪氨酸酶活力的关系: 挑取酿酒酵母SC-PPO2单菌落于5 mL SC-ura液体培养基，30 ℃、220 r/min过夜培养，取250 μL培养物转接至5 mL SC-ura培养基，培养至OD₆₀₀为3.5–4.0，补加酪氨酸至其终浓度为5 mg/mL，加入CuSO₄至终浓度为1 mmol/L。加入NaOH分别调节pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。30 ℃继续培养24 h后，观察颜色变化，取出1 mL培养物，离心取上清测定OD₄₇₅。

1.6.2 底物浓度与酪氨酸酶活力的关系: 同1.6.1所述培养菌体至OD₆₀₀ 3.5–4.0，加入NaOH调节pH至9.0，加入CuSO₄至终浓度为1 mmol/L。补加L-酪氨酸至终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL，30 ℃继续培养24 h后，观察颜色变化，取出1 mL培养物，离心取上清测定OD₄₇₅。

1.6.3 铜离子浓度与酪氨酸酶活力的关系: 同1.6.1所述培养菌体至OD₆₀₀为3.5–4.0，补加酪氨酸至其终浓度为2.5 mg/mL，加入NaOH调节pH至9.0，分别加入CuSO₄至终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L。30 ℃继续培养24 h后，观察颜色变化，取出1 mL培养物，离心取上清测定OD₄₇₅。

2 结果和分析 2.1 酪氨酸酶基因表达载体的构建

处理新鲜双孢蘑菇提取总RNA，结果如图 1-A所示。利用引物对PPO2-F/R克隆基因PPO2，其中下游引物引入his-TAG。反转录克隆到的基因PPO2如图 1-B所示。条带大小为1.7 kb，符合预期。连接pGEM-T Easy载体后验证正确的质粒与表达载体pSP-G1双酶切后纯化并连接。质粒通过Bgl Ⅱ、Spe Ⅰ双酶切，如图 1-C所示，得到7.3 kb与1.7 kb两条条带，符合预期，并进行测序将序列正确的转化子用于下一步实验。

2.2 酪氨酸酶在酿酒酵母中的表达及纯化

菌株SC-PPO2与对照SC-pSP-G1过夜培养，添加外源酪氨酸继续培养24 h，肉眼可见菌株SC-PPO2培养物变黑，如图 2-A中2号试管所示。1号试管为空白对照，无黑色素产生。表明PPO2基因在酿酒酵母中正确表达且具生物活性，能够将底物酪氨酸催化为黑色素。蛋白杂交检测结果如图 2-B所示，SC-PPO2菌株正确表达65 kDa大小的酪氨酸酶，泳道1空白对照中无此条带。

酶液经过镍柱纯化且进行脱盐处理后，通过SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。如图 2-C所示，纯化后条带单一，大小正确，表明纯化结果较好，可用于酪氨酸酶的活性检测。蛋白质定量采用牛血清蛋白BSA作为标准品，由标准曲线计算蛋白含量约为0.604 mg/mL。

2.3 重组酪氨酸酶的体外酶学特性

2.3.1 底物浓度与酪氨酸酶活力的关系: 酪氨酸酶同时具有单酚氧化酶与多酚氧化酶的活性^[15]，因此我们选用L-酪氨酸与L-多巴分别作为底物表征酪氨酸酶的两种酶活性。酪氨酸酶活力与L-酪氨酸浓度的关系如图 3-A所示，可见当酪氨酸浓度低于2 mmol/L时，酶催化速率随底物浓度增加而升高，高于2 mmol/L时反应速率没有明显变化，表明此时底物已饱和；酪氨酸酶活力与L-多巴浓度的关系如图 3-B所示，当L-多巴浓度低于10 mmol/L时，酶催化速率也随底物浓度增加而升高，高于10 mmol/L后酶催化速率保持不变。根据Linewear-Burk方程1/V=(K_m/V_max)×1/[S]+1/V_max，计算可得以酪氨酸为底物时K_m=0.12 mmol/L，V_max=97 U/min；以L-多巴为底物时，K_m=1.86 mmol/L，V_max=132 U/min。其中K_m是酶催化反应的重要常数，表征酶与底物的亲和力，K_m越小，酶与底物之间的亲和力越高。

2.3.2 温度与酪氨酸酶活力的关系: 图 4显示的是酪氨酸酶活性受温度的影响，可见在45 ℃时酶活力达到最高，30–65 ℃酪氨酸酶均表现出较高的酶活力。

2.3.3 pH与酪氨酸酶活力的关系: 酪氨酸酶活力与pH关系如图 5所示，以L-酪氨酸为底物时最适pH约为7.0，以L-多巴为底物时最适pH约为8.0，表明酪氨酸酶发挥单酚氧化酶与多酚氧化酶的最适pH有所差别，但总体相近。

2.4 酪氨酸酶在酿酒酵母中的酶学特性

2.4.1 pH与酪氨酸酶活力的关系: 将生长至稳定期的SC-PPO2培养体系分别调节pH至5.0–10.0，继续培养24 h后，培养体系的颜色变化如图 6所示。测得上清OD₄₇₅的结果见表 2，与肉眼观察结果较为一致。将生长至稳定期的培养体系pH调为9.0时，培养24 h后，培养液中的pH值降为7.7，黑色素积累量最高。

2.4.2 底物浓度与酪氨酸酶活力的关系: 通过在培养体系中外源添加不同浓度的酪氨酸，颜色变化如图 7所示，上清OD₄₇₅结果如表 3，可见酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时，黑色素随底物浓度增加而积累，高于2.5 mg/mL时，黑色素积累量保持稳定，底物达到饱和。

2.4.3 铜离子浓度与酪氨酸酶活力的关系: Cu²⁺对酪氨酸酶发挥酶活性起着重要作用，添加不同浓度的CuSO₄对酪氨酸酶活性的影响如图 8所示，上清OD₄₇₅结果如表 4，可见Cu²⁺浓度不低于0.2 mmol/L时，酪氨酸酶可以发挥较高的催化活性。

3 讨论

酪氨酸酶在微生物及动植物中普遍存在，并发挥着重要的生理功能。近年来，由于酪氨酸酶在食品、药品及环境领域有潜在用途，酪氨酸酶受到广泛的关注。但是从生物体中直接分离纯化酪氨酸酶的工艺复杂、产量较低^[16]，致使商品化酪氨酸酶的价格昂贵且纯度不高，制约了酪氨酸酶在各领域的应用，因此酪氨酸酶的异源表达成为了研究热点。Wichers等在大肠杆菌中成功克隆了酪氨酸酶基因PPO2的cDNA^[17]，但是表达出的蛋白并没有表现出酪氨酸酶活性。酿酒酵母作为真核模式生物，在表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶上具有天然的优势。

本研究在酿酒酵母中异源表达了双孢蘑菇的酪氨酸酶，并鉴定了其相关酶学特性。在体外实验中发现，酪氨酸酶发挥催化作用的最适温度为45 ℃，以酪氨酸为底物时酪氨酸酶K_m=0.12 mmol/L，最适pH为7.0；L-多巴作为底物时，K_m=1.86 mmol/L，最适pH为8.0，表明相较于L-多巴，酪氨酸酶对酪氨酸的亲和力更高。当酪氨酸浓度低于2 mmol/L时，酶催化速率随底物浓度增加而升高，高于2 mmol/L时底物饱和；底物L-多巴浓度高于10 mmol/L后酶催化速率保持不变，底物达到饱和。同时，在酿酒酵母中测定了酪氨酸酶在胞内的相关特性，在适合酿酒酵母生长的30 ℃条件下，酪氨酸酶发挥催化活性需要不低于0.2 mmol/L的Cu²⁺。培养物生长至稳定期后将pH调节为9.0时，24 h后黑色素积累量最高。该培养条件偏碱性，推测与酿酒酵母胞内产酸相关。在底物酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时，黑色素的产量与底物酪氨酸的浓度呈正相关性。

酪氨酸酶通过催化酪氨酸生成肉眼可见的黑色素，且在一定范围内黑色素的产量与酪氨酸浓度呈正相关性，可将酪氨酸酶作为酿酒酵母细胞酪氨酸产量的传感器，为高通量筛选酪氨酸高产菌株提供了思路。但是酿酒酵母的培养条件偏酸性，需要人工调节培养体系的pH，这可能成为影响最终结果的因素，是下一步工作需要解决的问题。