砷是广泛分布于自然界中的一种毒性较强的、具有致癌作用的重金属^[1]，它可以通过多种途径，如饮用或食用砷污染的水和食物、或者由于工业活动经皮肤或消化道进入人体^[2-4]。流行病学研究表明，长期暴露于砷污染的环境中可以引起人体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平显著升高，并增加心血管疾病、糖尿病、皮肤病等多种疾病及癌症的发病率^[5-6]。

丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)级联反应是真核生物控制细胞增殖、分化和死亡的重要信号通路之一，而p38 MAPK可被胞内较高水平的ROS激活，并导致细胞凋亡^[7-8]。在模式生物酵母中，迄今为止已有5条MAPK通路被发现^[9]。其中，HOG1 MAPK与哺乳动物中的p38 MAPK高度同源，对调控细胞的存活至关重要^[10]。大量研究结果显示，多种外界刺激如高温^[11]、低温^[12]和柠檬酸^[13]均可激活高渗透压(high-osmolarity and glycerol，HOG)信号通路。Thorsen等^[14]研究发现，砷可激活酵母细胞中HOG信号通路，而HOG1 MAPK缺失后可显著增加酵母细胞对砷化物的敏感性。本课题组研究发现，亚砷酸钠处理诱发酵母细胞ROS增高的同时，可诱导细胞凋亡^[15]，使1991个基因差异表达，差异表达基因的功能涉及代谢过程、结合、转运等，其中HOG1表达显著上调。但是，HOG1 MAPK是否参与砷诱导的酵母细胞凋亡未见报道。因此，本实验选用酵母野生株BY4741及其突变体ΔHOG1为研究材料，研究HOG1在亚砷酸钠诱导酵母细胞凋亡中的作用，以期为砷的毒性机理提供实验依据。

1 材料和方法 1.1 实验材料

酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)野生株BY4741 (MATa，his3Δ1，leu2Δ0，met15Δ0，ura3Δ0)及其突变体ΔHOG1 (hog1::KanMX4)由天津大学张丽琳老师惠赠^[16]。酵母细胞接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)液体培养基中，28 ℃、180 r/min恒温振荡培养至对数期后用于毒性处理。

1.2 药物处理及细胞生长测定

取适量对数期酵母细胞接种于含有不同浓度亚砷酸钠(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)的液体培养基中，28 ℃、180 r/min恒温振荡培养24 h，取培养液在600 nm测其光密度值(OD₆₀₀)，并计算相对生长率(OD_600处理组/OD_600对照组×100%)。收集对照组和0.5 mmol/L处理组细胞用于胞内ROS水平、线粒体膜电位、细胞凋亡率以及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的检测。所有实验均设置3次重复，其中流式细胞仪检测的每个样品的细胞数不少于50000个。

1.3 细胞相对存活率检测

将相同浓度的对数期细胞涂布至含有不同浓度亚砷酸钠的平板上，使每个平板含有细胞数约200个，28 ℃恒温培养48 h后观察计数单菌落数，并计算细胞相对存活率(处理组单菌落数/对照组单菌落数×100%)。

1.4 细胞耐受性检测

收集对数期细胞，洗涤并用无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)将细胞悬液调整至OD₆₀₀为2；然后用PBS将菌液以10倍梯度逐级稀释，每个梯度取5 μL并依次点样至固体培养基上(浓度由高到低)；28 ℃恒温培养48 h后观察并拍照。

1.5 细胞凋亡率检测

收集酵母细胞并用PBS洗涤，用适量异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V (fluorescein isothiocyanate-labeled annexin V，Annexin V-FITC)结合液重悬细胞后加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，混匀，室温避光孵育20 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 胞内ROS水平和MDA含量检测

胞内ROS检测参照文献[17]方法；丙二醛(MDA)含量检测参照文献[18]方法。

1.7 线粒体膜电位检测

利用荧光探针罗丹明123 (Rhodamine 123，Rho123)检测酵母细胞线粒体膜电位。将酵母细胞在2 μmol/L Rho 123中暗孵育15 min后，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。

1.8 数据统计分析

采用SPSS 18.0对结果进行统计分析，处理组与对照组间的差异显著性用“*”表示(^*P < 0.05，^**P < 0.01)，ΔHOG1突变株与野生株BY4741间的差异显著性用“ & ”表示( ^& P < 0.05，^{& &} P < 0.01)。

2 结果和分析 2.1 HOG1对亚砷酸钠抑制酵母细胞生长和相对存活率的影响

亚砷酸钠对酵母细胞生长和相对存活率的影响如图 1所示。从图中可以看出，随着亚砷酸钠浓度的升高，野生株BY4741相对生长率和相对存活率逐渐下降；在相同浓度砷处理组中，ΔHOG1突变株相对生长率和存活率均显著低于野生株BY4741。在0.5 mmol/L处理组中，ΔHOG1突变株的相对生长率和存活率仅为野生株BY4741的4.08%和6.41%。结果表明，亚砷酸钠可抑制酵母细胞生长和分裂，HOG1在砷引起的酵母细胞生长抑制中起了重要作用。

2.2 亚砷酸钠胁迫下WT与ΔHOG1突变株耐受性研究

从图 2可以看出，在不含亚砷酸钠的培养基中，野生株BY4741和ΔHOG1突变株生长状况无明显差异，均在稀释倍数为10⁴处长出了浓密的菌落。当培养基中含有0.5 mmol/L亚砷酸钠时，ΔHOG1突变株生长状况显著差于野生株BY4741，仅在稀释倍数为10⁰和10¹的地方长出了少量的菌落。结果说明，ΔHOG1突变株对亚砷酸钠的敏感性较高，即HOG1在提高酵母细胞对砷的抗性中起重要作用。

2.3 HOG1对亚砷酸钠诱导酵母细胞凋亡的影响

采用Annexin/PI双染法检测亚砷酸钠对酵母细胞凋亡的影响(图 3)。结果显示，酵母细胞经0.5 mmol/L亚砷酸钠胁迫24 h后，野生株BY4741和ΔHOG1突变株早期凋亡率分别为对照组的2.30倍和4.21倍，且ΔHOG1突变株早期凋亡率显著高于野生株BY4741凋亡率。结果表明，亚砷酸钠可诱导酵母细胞发生凋亡，且HOG1可能与酵母细胞凋亡的抑制有关。

2.4 HOG1对亚砷酸钠引起酵母细胞氧化损伤的影响

经0.5 mmol/L处理24 h后，酵母细胞用ROS荧光探针标记，野生株BY4741胞内荧光强度与对照组间无显著差异，而ΔHOG1突变株平均荧光强度为45.54，约为野生株BY4741的2.4倍(图 4-A)；同期，ΔHOG1突变株MDA含量比野生株BY4741增加了17.43倍，两者间具有极显著差异(图 4-B)。结果表明，亚砷酸钠可诱导酵母细胞内ROS水平升高，并引起氧化损伤，HOG1对抵抗亚砷酸钠引起的酵母细胞氧化损伤起重要作用。

2.5 HOG1对亚砷酸钠致酵母细胞线粒体膜电位下降的影响

经0.5 mmol/L亚砷酸钠胁迫24 h后，用Rho 123荧光探针标记细胞，检测发现野生株BY4741细胞平均荧光强度略高于对照组，但两者之间无显著差异；ΔHOG1突变株细胞平均荧光强度为173.51，显著高于对照组，且与野生株BY4741之间具有极显著差异(图 5)。结果表明，亚砷酸钠可引起酵母细胞线粒体膜电位下降，HOG1对亚砷酸钠胁迫下维持酵母细胞线粒体膜电位起重要作用。

3 讨论

MAPK是一类广泛存在于真核生物中由脯氨酸依赖型的丝氨酸/苏氨酸组成的蛋白激酶，在进化途径上高度保守^[19]。p38是MAPK家族中参与生物体生理过程调节的重要成员之一，在调控细胞周期和凋亡中起着至关重要的作用^[20]。廖朝霞等^[21]研究发现，异氟醚可激活p38 MAPK通路，诱导海马神经细胞凋亡；而p38抑制剂能减轻异氟醚麻醉引起的神经细胞凋亡。将p38 MAPK基因敲除后，小鼠胚胎成纤维细胞对亚砷酸盐的耐受性显著下降，并伴随着细胞凋亡的发生^[22]。

HOG-MAPK途径是酵母细胞中发现的MAPK途径之一，与p38 MAPK高度同源，在高渗应激环境下可控制信号转导和基因表达^[23]。Thorsen等^[14]研究证明，亚砷酸盐可导致酵母细胞HOG1磷酸化水平增加，而ΔHOG1突变体对亚砷酸盐的敏感性增加。本研究中，我们以HOG1基因缺失的酵母细胞为材料，研究了亚砷酸钠对酵母细胞凋亡的影响。结果显示，酵母细胞经亚砷酸钠胁迫后，ΔHOG1突变体相对生长率、存活率和耐受性均低于野生株BY4741，HOG1基因缺失后，细胞凋亡率显著升高。细胞凋亡是存在于酵母细胞中主动结束生命的死亡过程，可被多种外源性刺激诱导。大量研究表明，酵母细胞的凋亡依赖于胞内ROS水平的升高和线粒体膜电位的变化^[24-25]。

ROS是机体受到外界刺激后产生的一种代谢产物，在正常的生命活动过程中起着重要作用。现有研究证明，砷可引起植物、动物、微生物等多种细胞内ROS产生^[26-29]。过量的ROS可导致DNA、蛋白质和脂类等生物大分子功能的破坏，引起细胞凋亡或坏死^[30-33]。课题组在前期实验中发现，亚砷酸钠可改变酵母细胞抗氧化酶活性，导致胞内ROS升高，MDA含量升高，进而引起氧化损伤^[17]。本实验中，在相同浓度的砷处理组中，ΔHOG1突变株胞内ROS水平和MDA含量均显著高于野生株酵母细胞，说明HOG1基因的缺失使酵母细胞的抗氧化能力下降，细胞发生氧化胁迫。用0.5 mmol/L的亚砷酸钠刺激酵母细胞后，ΔHOG1突变株线粒体膜电位显著下降，与野生株间具有显著差异，有可能是因为线粒体作为真核生物进行呼吸作用的细胞器，对氧化应激更加敏感，胞内ROS水平的升高引起了线粒体膜电位的改变，进而调控细胞凋亡的发生^[34]。

综上所述，HOG1基因缺失菌株在亚砷酸钠处理后，细胞活性显著下降，ROS水平和MDA含量升高，更容易发生依赖于线粒体途径的细胞凋亡。结果说明，HOG1 MAPK可能通过对胞内ROS水平和线粒体膜电位的影响调控亚砷酸钠诱导的酵母细胞凋亡。