小白链霉菌(Streptomyces albulus)是Shima和Sakai于1977年从土壤中分离得到的1株能够产生生物碱物质的放线菌，该生物碱物质经化学结构鉴定，确定为ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，简写ε-PL)^[1]。由于ε-PL对细菌、酵母和真菌等微生物和病毒具有较强的抑制活性，且其水溶性好、耐高温、安全性高，故被开发用作一种天然防腐剂，广泛用于食品和化妆品领域^[2-4]。

目前，小白链霉菌是工业生产ε-PL的主要生产菌，也被用作ε-PL研究的模式菌株。发酵生产ε-PL的关键控制要素就是ε-PL积累阶段的pH值要控制在酸性环境(pH 4.0左右)，其主要原因是要抑制小白链霉菌中ε-PL分解酶(Pld)活性，避免已合成的ε-PL被分解^[5-6]。为此，研究者们研究了ε-PL产生菌中的Pld酶学性质，以期更精准控制发酵过程pH值，实现更高浓度ε-PL积累。Kito等首次从小白链霉菌中分离纯化到Pld，发现其是一种亚基分子量为54 kDa、分布于细胞膜中的氨肽酶，在中性pH环境能够从ε-PL的N端将赖氨酸残基一个一个地水解下来，其分解活性随pH值降低而迅速下降^[5]。随后，冯小海^[7]和谭之磊^[8]等相继在ε-PL产生菌Kitasatospora sp. CCTCC M205012和淀粉酶产色链霉菌TUST2中分离纯化到相似性质的Pld。有趣的是，Kito等在ε-PL耐受菌Sphingobacterium multivorum OJ10中分离纯化到外切型Pld^[9]，而在另一株ε-PL耐受菌Chryseobacterium sp. OJ7中分离纯化到内切型Pld^[10]。

为了研究Pld在S. albulus CR1中的生理功能，Hamano等构建了一株Pld失活菌株S. albulus CRM001。研究发现，S. albulus CRM001降解ε-PL能力有所下降，但仍存在较强的ε-PL降解活性，推测Pld失活菌株S. albulus CRM001可能还存在另外一种能降解ε-PL的降解酶^[6]。随后，Yamanaka等在S. albulus CR001中发现了第二种Pld (PldⅡ)，该分解酶基因编码467个氨基酸，计算分子量为51.9 kDa，其氨基酸序列与PldⅠ具有36%一致性和51%相似性。通过在S. albulus CRM001菌株中敲除pldⅡ基因，发现敲除株S. albulus CRM004完全丧失了降解ε-PL能力，同时发现PldⅡ通过内切方式降解ε-PL^[11]。由此可见，S. albulus中同时存在2个Pld，一个为外切型(命名为PldⅠ)，另一个为内切型(命名为PldⅡ)。巧合的是，我们实验室前期在研究小白链霉菌M-Z18分解酶时，意外地分离纯化到PldⅡ，成为目前唯一被分离纯化和研究酶学性质的PldⅡ^[12]。研究发现，PldⅡ同样也是一种膜蛋白，其酶促反应的最适温度为37 ℃、最适pH为7.0，降解活性随pH降低而快速下降，能够通过内切方式降解ε-PL^[12]。

综上所述，ε-PL产生菌中存在两种不同降解方式的Pld。然而，两种Pld是否广泛分布于ε-PL产生菌，以及2种Pld是否具有协同生理功能等问题仍然不清楚。为此，本研究以小白链霉菌M-Z18为研究对象，通过基于全基因组的Pld序列搜索，考察了2种Pld在6株ε-PL产生菌中的分布情况和同源性；再通过基因敲除、回补和过表达等遗传手段，构建了pldⅠ或/和pldⅡ敲除、回补和过表达重组菌；最后研究了重组菌降解ε-PL的过程、对ε-PL抗性变化以及对合成ε-PL的影响，以期揭示PldⅠ和PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中发挥的生理功能。

1 材料和方法 1.1 菌株与质粒

小白链霉菌M-Z18由本实验室保藏。由小白链霉菌M-Z18衍生而来的pld敲除株、回补过表达菌株均由本研究构建。敲除载体pKC1132由张克诚老师课题组惠赠。用于回补、过表达菌株构建的整合型质粒pIB139由山东大学王浩鑫老师惠赠。本研究所用的菌株和质粒见表 1。所用引物(表 2)由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 主要试剂和仪器

研究中用到的限制性内切酶、基因组提取试剂盒、片段纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自TaKaRa (大连)有限公司；ClonExpress^Ⓡ MultiS One Step Cloning Kit、2×Phanta^Ⓡ Max Master Mix购自诺唯赞生物科技(南京)有限公司；卡那霉素(Km)、安普霉素(Am)、氯霉素(Cm)、萘啶酮酸(Nal)、50×TAE缓冲液等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ε-聚赖氨酸标准品购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

PCR仪、凝胶成像仪购自Bio-Rad公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；高效液相色谱仪戴安U-3000购自赛默飞世尔科技公司；微量分光光度计K5800购自北京凯奥科技发展有限公司；分光光度计购自优尼科仪器有限公司。

1.3 培养基和培养条件

LB培养基(g/L)：NaCl 10；胰蛋白胨10；酵母提取物5；琼脂粉20 (固体培养基)，pH 7.0。若需要添加抗生素，Km、Am和Cm添加的终浓度分别为50 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL。大肠杆菌采用LB培养基在37 ℃下200 r/min进行培养。

BTN琼脂培养基(g/L)：葡萄糖10；蛋白胨2；酵母提取物1；琼脂20，pH 7.5。若需要添加抗生素，Am、Nal添加的终浓度为50 μg/mL、25 μg/mL。此培养基为链霉菌的产孢培养基。

种子培养基(M3G) (g/L)：葡萄糖50；酵母提取物5；(NH₄)₂SO₄ 10；KH₂PO₄ 1.36；K₂HPO₄·3H₂O 0.8；MgSO₄·7H₂O 0.5；ZnSO₄·7H₂O 0.04；FeSO₄·7H₂O 0.03，pH 6.8。此培养基用于链霉菌发酵时的种子培养。从产孢平板上刮3环孢子接入M3G种子培养基，30 ℃、200 r/min培养24 h，用作种子液。

MS培养基(g/L)：甘露醇20；黄豆粉20；琼脂20。灭菌后加入MgCl₂至终浓度10 mmol/L。

YT培养基(2×) (g/L)：胰蛋白胨16；酵母提取物10；NaCl 5，pH 7.0。

营养肉汤培养基(g/L)：胰蛋白胨10；牛肉膏3；氯化钠5，pH 7.0。

第一阶段菌体生长培养基(g/L)：甘油10；酵母粉5；MgSO₄·7H₂O 0.5；KH₂PO₄ 0.13；Na₂HPO₄·12H₂O 0.14，pH 6.8。

第二阶段ε-PL合成培养基(g/L)：葡萄糖50；柠檬酸40；(NH₄)₂SO₄ 10。NaOH调至所需pH。

1.4 生物信息学分析所用网站

SignalP 3.0 Server：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP。

TMHMM Server v.2.0：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM。

PROSITE：http://www.expasy.org/prosite。

1.5 pld基因单敲除株及双敲除株的构建

采用同源重组的方法进行基因无痕敲除，原理如图 1所示。以小白链霉菌M-Z18的基因组为模板，PCR扩增得到pldⅠ、pldⅡ基因的上下游同源臂，扩增pldⅠ上游同源臂所用的引物为PldⅠU-F和PldⅠU-R，下游同源臂扩增所用引物为PldⅠD-F和PldⅠD-R。pldⅡ上下游同源臂扩增引物分别为pldⅡU-F/pldⅡU-R、pldⅡD-F/pldⅡD-R。具体序列见表 2。PCR产物经纯化后与线性化的载体(pKC1132)通过一步克隆连接，转化至E. coli DH5α感受态中，挑选具有安普霉素抗性的菌落培养12–16 h，提取重组质粒pKC1132-pldⅠ、pKC1132-pldⅡ进行酶切验证。经验证成功的重组质粒转化E. coli ET12567后经接合转移(步骤见1.7)转入小白链霉菌M-Z18中，在抗性平板(Am、Nal)上筛选出接合子，将接合子在无抗平板上无抗松弛培养三代后，进行影印接种选择对Am敏感的菌株进行PCR验证，根据野生型和敲除株PCR产物长度不同来筛选正确的突变株。

双敲除菌株的构建：将构建好的重组质粒pKC1132-pldⅡ经接合转移转入ΔPldⅠ菌株中，后续步骤同上。

1.6 pld基因回补和过表达菌株的构建

pld基因单回补和单过表达菌株的构建：以小白链霉菌M-Z18的基因组为模板，分别设计引物SCPldⅠ-F/ScPldⅠ-R、SCPldⅡ-F/SCPldⅡ-R对基因pldⅠ、pldⅡ进行扩增。将扩增的片段与线性化的pIB139载体进行连接，转化E. coli DH5α感受态，挑取转化子在含有Am抗性的LB培养基中培养12–16 h。提取质粒进行双酶切验证。验证正确的质粒转化E. coli ET12567经接合转移将重组质粒整合到相应的ΔpldⅠ、ΔpldⅡ及小白链霉菌M-Z18基因组中，构建相应的回补和过表达菌株。

pld双回补及双过表达菌株的构建：以小白链霉菌M-Z18的基因组为模板，分别利用引物DCPldⅠ-F/DCPldⅠ-R、DCpldⅡ-F/DCpldⅡ-R扩增出pldⅠ和pldⅡ基因。将pldⅠ、pldⅡ片段与线性化的pIB139载体通过一步克隆进行连接，将连接产物转化E. coli DH5α感受态，提取转化子培养，提质粒进行验证，正确的质粒命名为pIB139-pldⅠpldⅡ。将正确质粒通过接合转移整合到ΔpldⅠΔpldⅡ及小白链霉菌M-Z18基因组中。将有安普霉素抗性的菌株提取基因组后进行PCR验证。

pIB139质粒可以通过整合位点将表达质粒整合到链霉菌基因组中，从而实现目标基因的回补和过表达。为了排除质粒在基因组中存在的影响，我们将空载质粒pIB139通过接合转移整合到小白链霉菌M-Z18基因组中，获得的菌株作为对照。

1.7 接合转移

将正确的重组质粒转化E. coli ET12567 (pUZ8002)后，挑取单菌落接种含Am、Cm和Km的5 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min过夜培养。以1.0% (V/V)的接种量转接同样含有以上3种抗生素的50 mL LB培养基，继续培养至OD₆₀₀达到0.4–0.6之间。于4 ℃离心收集菌体，用同体积的LB液体培养基洗涤2次除去抗生素，洗涤好的菌体用1/10体积的LB培养基重悬并置于冰上备用。与此同时，刮取新鲜培养的小白链霉菌M-Z18孢子至无菌水中，充分打散后过滤，制备孢子悬浮液(约10⁸个/mL)。50 ℃热激10 min，冷却至室温后加入同等体积的2×YT孢子预萌发培养基，37 ℃培养2.5–3.0 h让孢子萌发，收集萌发后的孢子用500 μL的2×YT重悬。取500 μL已培养好的E. coli ET12567和500 μL预萌发的孢子充分混匀，浓缩至100 μL，涂布MS培养基，30 ℃倒置培养18 h。18 h后覆盖安普霉素50 μg/mL和萘啶酮酸25 μg/mL，继续培养3–4 d，挑取接合子划线含有Am和Nal的BTN平板，待接合子长出孢子后于无抗平板上松弛培养三代，刮取孢子制成孢子悬浮液，并稀释涂布无抗BTN平板，30 ℃倒置培养4–5 d。对单菌落进行影印接种，选择在Am抗性平板上不生长在无抗平板上生长的菌株进行PCR验证。

1.8 重组菌降解ε-PL活性的测定

测定方法参考文献[11]并稍作修改。将培养的种子液按8.0% (V/V)接种量转接菌体生长培养基，30 ℃培养12 h。于4 ℃离心收集菌丝体，然后用100 mmol/L MES缓冲液(pH 6.0)洗涤2次。将100 mg菌体(湿重)加入到含有10 mg/mL ε-PL的MES缓冲液中。振荡孵育3 h后通过离心除去菌丝体，用HPLC分析上清液中ε-PL的聚合度分布。

1.9 重组菌的ε-PL最小抑制浓度(MIC)测定

将出发菌株小白链霉菌M-Z18及各重组菌的种子液按1.0% (V/V)接种量接入含有不同ε-PL浓度的10 mL营养肉汤培养基中，30 ℃、200 r/min培养48 h，根据菌体生长情况获得MIC值。

1.10 重组菌在不同pH值下合成ε-PL情况

采用两阶段恒定pH发酵方法进行重组菌ε-PL产量的评估^[13]。两阶段恒定pH发酵：第一阶段为菌体生长阶段，此阶段主要用于菌体培养；第二阶段为ε-PL合成阶段，将第一阶段收集的菌体洗涤后重悬入含有葡萄糖、硫酸铵的不同pH柠檬酸缓冲液中进行ε-PL生物合成，此阶段主要用于ε-PL积累。具体操作步骤如下：刮3环出发菌株小白链霉菌M-Z18及各重组菌孢子接种M3G种子培养基，将种子液按8.0% (V/V)接种量接种至第一阶段的菌体生长培养基中，30 ℃、200 r/min培养12 h。随后于4 ℃离心、收集菌体，并用0.85%生理盐水洗涤菌体1次，再次离心后，接入10 mL的第二阶段的ε-PL合成培养基中，于30 ℃、200 r/min培养48 h后，进行ε-PL浓度检测。

1.11 分析方法

ε-PL聚合度分布检测：采用HPLC检测，条件参考文献[5]。流动相配制：流动相A：10 mmol/L NaH₂PO₄，100 mmol/L NaClO₄·H₂O，10 mmol/L辛烷磺酸钠，用磷酸调pH 2.6；流动相B：20 mmol/L NaH₂PO₄，200 mmol/L NaClO₄·H₂O，20 mmol/L辛烷磺酸钠，50% (V/V)乙腈，用磷酸调pH 2.6。

ε-PL浓度测定：采用甲基橙比色法^[14]。

2 结果和分析 2.1 ε-PL产生菌的pld基因同源性分析

以往研究报道了在ε-PL产生菌Streptomyces albulus和Kitasatospora sp. CCTCC M205012以及ε-PL耐受菌Sphingobacterium multivorum OJ10和Chryseobacterium sp. OJ7中存在ε-PL分解酶^{[5, 7-10]}，并通过生化分析研究了这些分解酶的酶学性质。然而，尚未有研究者对ε-PL产生菌中Pld的分布情况以及不同产生菌之间Pld同源性进行研究。为此，本研究对已在NCBI公布的5株ε-PL产生菌(S. albulus NBRC14147、S. albulus CCRC11814、S. albulus NK660、S. albulus ZPM、S. albulus PD-1)和本实验室未公布的小白链霉菌M-Z18全基因组进行pld基因序列搜索，并在氨基酸水平对其进行同源性分析，结果如图 2-A所示。6株ε-PL产生菌全基因组搜索pld基因，发现它们均存在两种pld基因序列，命名为pldⅠ和pldⅡ。氨基酸水平同源性比对分析，发现6株ε-PL产生菌之间的PldⅠ氨基酸序列相似性为100%，而PldⅡ氨基酸序列相似性为99%–100%，这表明PldⅠ和PldⅡ在6株ε-PL产生菌中具有高度的保守性。

pldⅠ基因大小为1485 bp，编码495个氨基酸；pldⅡ基因大小为1401 bp，编码467个氨基酸。在氨基酸水平对PldⅠ和PldⅡ的同源性进行比对分析(图 2-B)，发现两者之间只有34.57%的一致性和43.33%的相似性，表明二者可能具有明显的功能差异性。利用BLASTp将PldⅠ、PldⅡ与蛋白数据库进行对比，发现两者广泛存在于链霉菌属中，属于M1家族金属肽酶，是可以催化肽键水解的一类蛋白酶。利用在线网址SignalP 3.0 Server、TMHMM Server v.2.0以及PROSITE进行功能预测分析，发现PldⅠ和PldⅡ均是膜蛋白且都结合在细胞膜的外部，N末端也均有信号肽序列，同时都是一种Zn²⁺金属结合蛋白。

2.2 小白链霉菌M-Z18降解ε-PL能力分析

基于上述同源性基因分析，发现了小白链霉菌M-Z18基因组中同时存在pldⅠ和pldⅡ基因。为确定pldⅠ和pldⅡ基因在小白链霉菌M-Z18中是否发挥ε-PL的降解功能，本研究将经过30 ℃培养12 h的小白链霉菌M-Z18菌体收集、洗涤后，重悬于含有10 mg/mL ε-PL的MES缓冲液(pH 6.0)中，30 ℃孵育3 h后，利用HPLC检测上清液的ε-PL聚合度分布，结果如图 3所示。相比于ε-PL标准品(图 3-A)，含有小白链霉菌M-Z18菌体的MES缓冲液中的ε-PL高聚合度含量明显减少而低聚合度ε-PL含量显著增加，表明小白链霉菌M-Z18具有将高聚合度ε-PL分解为低聚合度ε-PL的能力，意味着pldⅠ和/或pldⅡ基因在小白链霉菌M-Z18中发挥了降解ε-PL的功能。

2.3 小白链霉菌M-Z18 pld基因敲除、回补和过表达菌株的构建

为探究PldⅠ和PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中的作用，本研究通过基因敲除、回补和过表达遗传方法，分别构建得到了小白链霉菌M-Z18的pldⅠ敲除菌株ΔpldⅠ、pldⅡ的敲除菌株ΔpldⅡ和pldⅠ、pldⅡ双敲除菌株ΔpldⅠΔpldⅡ，回补菌株ΔpldⅠ: : pldⅠ、ΔpldⅡ: : pldⅡ、ΔpldⅠΔpldⅡ: : pldⅠpldⅡ，过表达菌株OE-pldⅠ、OE-pldⅡ、OE-pldⅠpldⅡ。

2.3.1 小白链霉菌M-Z18 pld基因敲除菌株的构建:

按照材料与方法中1.5所述方法，PCR扩增得到pldⅠ长度为3329 bp和3162 bp的上下游同源臂后，通过一步克隆试剂盒将其整合到载体pKC1132上，得到重组质粒pKC1132-PldⅠ。采用同样的方法，将pldⅡ长为3387 bp的上游同源臂和3262 bp的下游同源臂连接载体pKC1132，得到重组质粒pKC1132-pldⅡ。验证正确的重组质粒，通过接合转移转入小白链霉菌M-Z18中，经过3次松弛培养后，利用质粒上携带的安普霉素抗性影印筛选对抗性敏感的菌株。筛选得到候选突变株，提取突变株基因组DNA，进行PCR验证并测序，最终成功筛选得到pldⅠ、pldⅡ敲除菌株ΔpldⅠ、ΔpldⅡ (图 4-A和图 4-B)。

为获得pld双敲除菌株，将已构建好的pldⅡ敲除质粒pKC1132-pldⅡ接合转移转入ΔpldⅠ中，同样经过松弛培养、影印等步骤获得候选突变株。提取候选突变株基因组DNA进行PCR验证并测序，最终成功筛选得到双敲除菌株ΔpldⅠΔpldⅡ (图 4-C和图 4-D)。

2.3.2 小白链霉菌M-Z18 pld基因回补和过表达菌株的构建:

按照材料与方法1.6中所述方法，PCR扩增得到目的基因pldⅠ (1485 bp)和pldⅡ (1401 bp)，随后整合到载体pIB139中，分别得到重组质粒pIB139-pldⅠ和pIB139-pldⅡ。将重组质粒通过接合转移分别转入到ΔpldⅠ、ΔpldⅡ菌株中，筛选得到具有安普霉素抗性的菌株，提取它们的基因组并利用pIB139通用引物PldⅠsyz-F/PldⅠsyz-R进行验证，最终成功得到回补菌株ΔpldⅠ: : pldⅠ和ΔpldⅡ: : pldⅡ (图 5-A)。采用同样的操作和验证方法，将重组质粒pIB139-pldⅠ、pIB139-pldⅡ通过接合转移分别转入小白链霉菌M-Z18中，成功得到过表达菌株OE-pldⅠ和OE-pldⅡ (图 5-A)。

按照材料与方法1.6中所述方法，构建pld双回补和双过表达菌株。首先，通过PCR扩增得到pldⅠ (1485 bp)、pldⅡ (1401 bp) 2个目的片段，再将2个片段与线性化后的载体pIB139通过一步克隆试剂进行连接，得到重组质粒pIB139-pldⅠpldⅡ。将重组质粒分别转入ΔpldⅠΔpldⅡ和小白链霉菌M-Z18中，利用抗性筛选和PCR验证，成功得到双回补菌株ΔpldⅠΔpldⅡ: : pldⅠpldⅡ和双过表达菌株OE-pldⅠpldⅡ (图 5-B)。

将空载质粒pIB139通过接合转移整合到小白链霉菌M-Z18基因组中，通过PCR验证得到control-pIB139菌株作为对照(图 5-A)。

2.4 重组菌降解ε-PL活性分析

为了评估上述构建的重组菌对ε-PL的降解影响，各重组菌分别经过30 ℃培养12 h，收集、洗涤菌体后，重悬于含有10 mg/mL ε-PL的MES缓冲液(pH 6.0)中，并在30℃条件下孵育3 h，再利用HPLC检测上清液的ε-PL，结果如图 6所示。相比于野生型菌株小白链霉菌M-Z18 (图 3-B)，ΔpldⅠ菌株降解ε-PL能力明显减弱，而ΔpldⅡ菌株几乎丧失了降解ε-PL的能力，达到了与双敲除菌株ΔpldⅠΔpldⅡ同等效果。通过回补pldⅠ、pldⅡ和pldⅠ-pldⅡ，均能使得对应重组菌恢复ε-PL降解能力，但都没能达到小白链霉菌M-Z18降解ε-PL的效果(图 3-B)。有趣的是，在野生型菌株小白链霉菌M-Z18中分别过表达pldⅠ和pldⅡ时，过表达菌株降解ε-PL的能力并未得到明显提高；而同时过表达pldⅠ和pldⅡ时，重组菌降解ε-PL的能力被显著增强。这些结果表明，PldⅠ、PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中均能行使降解ε-PL的功能，但PldⅡ降解活性占主导地位，且PldⅠ和PldⅡ对降解ε-PL具有一定的协同作用。

2.5 重组菌对ε-PL的MIC值测定

为了评估Pld在小白链霉菌抵御ε-PL中的作用，将液体培养20 h后的重组菌按1.0%比例接入含有不同ε-PL浓度的营养肉汤培养基中(pH 7.0)，30 ℃振荡培养48 h，各重组菌的生长情况如图 7所示。图 7-A显示，出发菌株小白链霉菌M-Z18 (WT)和敲除重组菌ΔpldⅠ、ΔpldⅡ、ΔpldⅠΔpldⅡ对ε-PL的MIC值分别为320、250、100和60 μg/mL。可见，不管是单敲除ΔpldⅠ、ΔpldⅡ还是组合敲除ΔpldⅠΔpldⅡ，与出发菌株相比，重组菌对ε-PL的MIC值显著降低，其中双敲除菌株ΔpldⅠΔpldⅡ对ε-PL的MIC值仅为出发菌株的18.8%，下降最为显著。图 7-B显示的是各回补重组菌株在不同ε-PL浓度营养肉汤培养基中的生长情况，ΔpldⅠ: : pldⅠ、ΔpldⅡ: : pldⅡ和ΔpldⅠΔpldⅡ: : pldⅠpldⅡ对ε-PL的MIC值分别为270、300、350 μg/mL，表明各回补菌株对ε-PL的抵抗能力基本恢复至野生菌株水平。图 7-C显示的是各过表达重组菌在不同ε-PL浓度营养肉汤培养基中的生长情况，OE-pldⅠ、OE-pldⅡ和OE-pldⅠpldⅡ对ε-PL的MIC值，分别达到400、600、700 μg/mL。与出发菌株相比，过表达重组菌对ε-PL的MIC值显著提高，其中双过表达菌株OE-pldⅠpldⅡ对ε-PL的MIC值是出发菌株的2.19倍。上述研究结果与重组菌降解ε-PL能力(图 6)保持了较好的一致，表明Pld在小白链霉菌中的主要生理功能是保护自身免受ε-PL的抑制。

2.6 重组菌在不同pH值下合成ε-PL能力分析

为考察Pld对小白链霉菌合成ε-PL的影响，本研究通过两阶段恒定pH值发酵分析了出发菌株小白链霉菌M-Z18 (WT)、pldⅠ敲除菌株ΔpldⅠ、pldⅡ敲除菌株ΔpldⅡ、pldⅠ和pldⅡ双敲除菌株ΔpldⅠΔpldⅡ以及含空载pIB139出发菌株小白链霉菌M-Z18 (WT-pIB139)、pldⅠ过表达菌株OE-pldⅠ、pldⅡ过表达菌株OE-pldⅡ、pldⅠ和pldⅡ过表达菌株OE-pldⅠpldⅡ在不同pH值下(pH 3.0–5.5)合成ε-PL的情况。如图 8-A所示，不管是单敲除pldⅠ、pldⅡ还是同时敲除pldⅠ和pldⅡ，与出发菌株相比，敲除菌株在任何考察pH值下(pH 3.0–5.5)的ε-PL产量均未表现出显著差异。同时，如图 8-B所示，不论是过表达pldⅠ、pldⅡ还是同时过表达pldⅠ和pldⅡ，与含空载pIB139质粒出发菌株相比，过表达菌株在考察pH值下(pH 3.0–5.5)的ε-PL产量也均未表现出明显差异。由此可见，Pld对小白链霉菌合成ε-PL不会造成任何影响，说明Pld在小白链霉菌的ε-PL生物合成中不发挥生理功能作用。

3 讨论

Pld是一种在ε-PL产生菌或耐受菌中发现的蛋白酶，依据其降解ε-PL方式分为内切型(PldⅠ)和外切型(PldⅡ)两种类型。截止目前，仅在1株ε-PL产生菌中同时发现存在2种类型Pld^[11]。为了调查2种类型Pld在ε-PL产生菌中的分布特点以及同时存在2种Pld的生理功能，本研究基于NCBI数据库公布的5株ε-PL产生菌和本实验室未公布的小白链霉菌M-Z18全基因组数据进行Pld序列搜索，发现2种Pld在6株ε-PL产生菌中均同时存在且保持高度同源性(99%–100%)。进一步的基因功能实验证明，PldⅡ相比于PldⅠ具有更高的ε-PL降解能力，且二者在降解和抵御ε-PL方面存在一定的协同增效作用，但在ε-PL生物合成中不发挥作用。本研究为明确ε-PL产生菌中2种Pld的分布特点以及2种Pld在小白链霉菌中发挥的生理功能奠定了基础。

通过6株不同来源的小白链霉菌全基因组搜索，发现pldⅠ和pldⅡ基因序列均同时存在它们的各自基因组中。氨基酸水平同源性比对分析发现6株ε-PL产生菌之间的PldⅠ氨基酸序列相似性为100%，而PldⅡ氨基酸序列相似性为99%–100%，显示PldⅠ和PldⅡ在6株ε-PL产生菌中具有高度的保守性(图 2-A)。进一步分析PldⅠ和PldⅡ之间的同源性(图 2-B)，发现二者之间只有34.57%的一致性和43.33%的相似性，说明它们的功能可能不一致。另外，功能预测发现PldⅠ和PldⅡ均是膜蛋白且都结合在细胞膜的外部，N末端均有信号肽序列，同时都是一种Zn²⁺金属结合蛋白，这与已报道的生化结果相一致^[11]。从文献报道来看，本研究是首次系统分析Pld在ε-PL产生菌中的分布情况，且发现两种类型Pld具有高度同源保守性。由于已公布的ε-PL产生菌全基因组信息仅局限在小白链霉菌，尚不清楚两种Pld在其他ε-PL产生菌中的情况，如北里胞菌、麦角真菌^[15]和芽胞杆菌^[16]等。

目前发现的ε-PL产生菌Pld除降解方式不同外(PldⅠ属于外切型，而PldⅡ是内切型)，两种降解酶酶学性质均表现出高度一致性。如，二者均存在于细胞膜上，PldⅠ和PldⅡ在pH 4.0条件下都没有活性，但随着pH值升高，它们的降解活性逐渐增强，并在pH 7.0时达到最高。本研究借助基因敲除、回补和过表达等遗传手段，构建了pldⅠ或/和pldⅡ敲除、回补和过表达重组菌，并研究了这些重组菌降解ε-PL的效果。研究发现，PldⅠ、PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中均能行使降解ε-PL的功能，但PldⅡ降解活性明显高于PldⅠ，且PldⅠ和PldⅡ对降解ε-PL具有协同增效作用(图 6)。重组菌对ε-PL的MIC值测试结果表明，中性pH值环境下PldⅠ、PldⅡ对小白链霉菌抵御ε-PL的抑制作用明显，且双过表达pldⅠ和pldⅡ的重组菌对ε-PL的抵制能力明显优于单一过表达(图 7)。由此可见，中性pH值环境下Pld在小白链霉菌中的主要生理功能是保护自身免受ε-PL的抑制。

本研究通过将pldⅠ或/和pldⅡ敲除菌株以及它们的过表达菌株进行恒定pH值发酵，发现不管是敲除菌株还是过表达菌株在pH 3.0–5.5内ε-PL的合成趋势及最终ε-PL产量较出发菌株均未表现出明显差异(图 8)，该结果与Yamanaka等一致^[11]。Yamanaka等认为ε-PL在低pH环境下的抑菌活性会被抑制，故pld敲除菌株能够在酸性pH值正常积累ε-PL。因此，小白链霉菌在低pH环境中实现ε-PL的大量积累，一方面是因为低pH值抑制了Pld活性，另一方面低pH值也限制了ε-PL抑菌活性从而避免了对自身产生菌的抑制作用。