2022, Vol. 62
表1(Table 1)
代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210116
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 王世杰, 张海冰, 沈微, 杨海泉, 夏媛媛, 曹钰, 陈献忠. 2022
- Shijie WANG, Haibing ZHANG, Wei SHEN, Haiquan YANG, Yuanyuan XIA, Yu CAO, Xianzhong CHEN. 2022
- 代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸
- Efficient synthesis of medium-chain ω-hydroxy fatty acids by metabolic engineering in Candida tropicalis
- 微生物学报, 62(1): 77-89
- Acta Microbiologica Sinica, 62(1): 77-89
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文章历史
- 收稿日期：2021-02-22
- 修回日期：2021-04-10
- 网络出版日期：2021-04-19
引用本文 |
王世杰, 张海冰, 沈微, 杨海泉, 夏媛媛, 曹钰, 陈献忠. 代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸[J]. 微生物学报, 2022, 62(1): 77-89.
Shijie WANG, Haibing ZHANG, Wei SHEN, Haiquan YANG, Yuanyuan XIA, Yu CAO, Xianzhong CHEN. Efficient synthesis of medium-chain ω-hydroxy fatty acids by metabolic engineering in Candida tropicalis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(1): 77-89.
代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸
江南大学生物工程学院, 微生物合成生物制造重点实验室, 江苏 无锡 214122
摘要：[目的] ω-羟基脂肪酸（ω-hydroxyfatty acid，ω-HFAs）是一种绿色安全无毒，具有良好生物相容性的理想生物降解材料，广泛应用于化工、食品、药学等方面，微生物发酵法生产ω-羟基脂肪酸具有重要的研究意义和应用前景。[方法] 为了得到高产ω-羟基脂肪酸的代谢工程菌株，通过同源重组技术，连续敲除二倍体热带假丝酵母β-氧化途径中酰基辅酶A氧化酶基因（ACO）的同工酶POX基因，考察基因缺失对细胞生长以及合成ω-羟基脂肪酸能力的影响。[结果] 基于脂肪醇氧化酶（FAO）基因缺陷菌株，成功构建了重组菌株F4PT（ΔPOX4，ΔPOX5），在碳源为葡萄糖的培养基中，重组菌株出现生长减缓，但在碳源为脂肪酸甲酯（C12-C14）的培养基中生长明显减缓，说明删除POX4、POX5基因使脂肪酸甲酯的代谢能力降低，其次通过摇瓶发酵实验，12-羟基十二酸和14-羟基十四酸的产量分别为3.01 g/L和8.69 g/L，转化率分别为11.44%和33.14%，达到积累ω-羟基脂肪酸的目的，并且代谢十四酸甲酯的能力是明显强于代谢十二酸甲酯。[结论] FAO、POX基因双缺失的热带假丝酵母可以明显积累ω-羟基脂肪酸，不同碳链的积累效率有差异，其中14-羟基十四酸的产量及转化率更高，重组菌株有定向转化十四酸甲酯为14-羟基十四酸的潜能。
关键词：热带假丝酵母 β-氧化 ω-氧化 ω-羟基脂肪酸 精细化工品
Efficient synthesis of medium-chain ω-hydroxy fatty acids by metabolic engineering in Candida tropicalis
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Abstract: [Objective] ω-hydroxy fatty acid (ω-HFAs) is a green, safe, non-toxic, ideal biodegradable material with good biocompatibility. It is widely used in chemical industry, food, pharmacy. Microbial fermentation, the method for producing ω-HFAs has important research significance and application prospects. [Methods] In order to obtain high-yield metabolically engineered strains of ω-hydroxy fatty acids, the POX gene in the β-oxidation of Candida tropicalis was continuously knocked out through homologous recombination technology. The effect of gene deletion on cell growth and the ability to synthesize ω-hydroxy fatty acids was investigated. [Results] The recombinant strain F4PT (ΔPOX4, ΔPOX5) was successfully constructed. Growth in the medium with fatty acid methyl esters (C12~C14) as the carbon source was significantly slower than that in glucose, indicating that the deletion of the POX4 and POX5 genes reduced the metabolic ability of fatty acid methyl esters. Secondly, through the fermentation experiment, the concentration of 12-hydroxydodecanoic acid and 14-hydroxytetradecanoic acid were 3.01 g/L and 8.69 g/L, the conversion rates were 11.44% and 33.14%, respectively. The ability to metabolize fourteen-carbon fatty acids is significantly stronger than that of twelve-carbon fatty acids. [Conclusion] Candida tropicalis with double deletion of FAO and POX genes can obviously accumulate ω-hydroxy fatty acids, but the accumulation efficiency of different carbon chains is different. The production and conversion rate of 14-hydroxytetradecanoic acid are higher, and the recombinant strain has the potential to convert methyl tetradecanoate to 14-hydroxytetradecanoic acid.
Keywords:
Candida tropicalis β-oxidation ω-oxidation ω-hydroxy fatty acids fine chemical products
ω-羟基脂肪酸的碳骨架中含有羟基，是生物体内三酰基甘油、蜡、脑苷脂和其他必需脂质的组成部分[1]。羟基团位于末端碳位的脂肪酸成为ω-羟基脂肪酸，与非极性脂肪酸相对比，具有熔点高、沸点高、粘度高的特点，并更易形成二聚物，但是在水中难溶[2-3]。ω-羟基脂肪酸是现今最理想的合成生物降解材料的化合物之一，合成的聚合物不仅对高温、化学试剂和撞击耐受性更高，而且绿色安全无毒，具有良好的生物相容性[4]。所以，ω-羟基脂肪酸这种精细化工品具有其他材料所没有的优势与发展潜力。
目前，获得ω-羟基脂肪酸的途径主要是化学合成法和微生物发酵法，化学合成反应路线复杂且分离困难，而微生物发酵法绿色环保，发酵周期短、能有效节约成本[5]。微生物有芽孢菌属、假单胞菌属和微菌属等都可以生产羟基脂肪酸，但是生产的羟基脂肪酸类型差异较大[6]，其中对ω-羟基脂肪酸的研究主要集中在细胞色素P450单氧合酶的研究。迄今为止，国内外定向转化ω-羟基脂肪酸的报道很少，因而限制了对ω-羟基脂肪酸的研究开发，从而影响其应用的发展和新型产品的研制。
热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种具有重要工业应用生产战略意义的菌株，拥有十分强大的ω-氧化酶系，该酵母最显著的特征是可以代谢烷烃或脂肪酸进行生长增殖[7]。鉴于不同的培养因素，热带假丝酵母会呈现出适应环境的形态[8]，相较于酿酒酵母，有着耐高温、适应性强和利用多种有机物等优势，作为基因工程改造菌更有前景[9-10]。热带假丝酵母氧化烷烃或脂肪酸，转化成为二元酸的途径是α-氧化和ω-氧化，如图 1代谢途径所示。脂肪醇氧化酶(FAO)、脂肪醇脱氢酶(ADH)、细胞色素P450单加氧酶(CYP)和脂肪醛脱氢酶(FALDH)参与了相关反应[11-12]，烷烃进行的是α-氧化，经过6步氧化反应生成二元酸；脂肪酸进行的是ω-氧化，经过3步氧化反应生成二元酸，代谢烷烃与脂肪酸主要区别就是多了3步氧化反应。热带假丝酵母中还有强大的β-氧化途径，烷烃代谢能产生大量二元酸但不能累积或分泌，二元酸和一元酸多数会在过氧化物酶体中，发生β-氧化反应[13]，POX基因是酰基辅酶A氧化酶(ACO)的同工酶基因。研究发现，在以烷烃为唯一碳源的诱导培养基中，POX5的诱导表达水平较POX4低，通过对酰基辅酶A氧化酶POX4和POX5这2对等位基因进行敲除，发现菌株不能代谢烷烃，且二元酸的积累量明显增加[14-15]，说明POX4和POX5基因的缺失就能阻断β-氧化途径。本实验通过对FAO基因缺失的菌株，进一步删除POX基因，达到能够阻断β-氧化并且局部限速ω-氧化，展示FAO、POX基因双缺失对热带假丝酵母菌体的影响。
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| 图 1 热带假丝酵母中代谢烷烃或脂肪酸的途径[16] Figure 1 Metabolic pathway of alkane or fatty acid in Candida tropicalis[16]. ①: cytochrome P450 and NADPH-Cytochrome P450 reductase; ②: fatty-alcohol oxidase and Fatty alcohol dehydrogenase; ③: fatty-aldehyde dehydrogenase; ④: fatty acyl-CoA synthetase; ⑤: acyl-CoA oxidase; ⑥: enoyl-CoA hydratase; ⑦: β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase; ⑧: carnitine acetyltransferase. |
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和引物:
实验所用菌株见表 1，U-204是通过C. tropicalis ATCC 20336利用CRISPR-Cas9基因编辑系统构建出的菌株；质粒Tm-gda324-URA3、Ts-POX41-gda324-URA3、Ts-POX42-gda324-URA3和Ts-POX5-gda324-URA3均由本实验室保藏，相对应的引物均参考文献[12]，gda324为URA3基因序列通过引物Ugda324和Dgda扩增得到的324 bp片段，主要作用是URA3基因弹出的辅助序列；PCR引物如表 2，都由苏州金唯智股份有限公司合成。
表 1. 本研究所用菌株
Table 1. Strains used in this study
| Strains | Characteristics | Sources |
| C. tropicalis ATCC20336 | URA3/URA3 FAO/FAO POX4/POX4 POX5/POX5 | ATCC |
| C. tropicalis U-204 | ura3/ura3 | This lab |
| C. tropicalis F3YT | ura3/ura3 fao11:: gda324/fao12:: gda324 fao2a: : gda324 fao2b: : gda324 | This lab |
| C. tropicalis F1PT | ura3/ura3 fao1/fao1 fao2/fao2 pox41:: gda324/POX42 | This study |
| C. tropicalis F2PT | ura3/ura3 fao1/fao1 fao2/fao2 pox41:: gda324/pox42:: gda324 | This study |
| C. tropicalis F3PT | ura3/ura3 fao1/fao1 fao2/fao2 pox41:: gda324/pox42:: gda324 pox5:: gda324/POX5 | This study |
| C. tropicalis F4PT | ura3/ura3 fao1/fao1 fao2/fao2 pox41:: gda324/pox42:: gda324 pox5:: gda324/pox5:: gda324 | This study |
表 2. 本研究所用引物
Table 2. Primers used in this study
| Primers | Sequences (5′→3′) | Restriction sites |
| Ugda324 | AACTGCAGACTAAGCTTCTAGGACGTCAT | Pst I |
| Dgda | GCGTCGACACCCGATTTCAAAAGTGCAGA | Sal I |
| UPOX4 | TCTGGCAATGTCTGTAGCTC | |
| DPOX4 | ACAATCTGATGATGGCAAC | |
| U2POX4 | ACGGCTCCTACTACGACT | |
| D2POX4 | CTTAAAGATAGCCTTGGTGT | |
| UPOX5 | TTTGGCCTCGGTTCCAC | |
| DPOX5 | GTAATGATACCGTACTGCAAG | |
| rUPOX4 | AACTGCAGAGGACCTTGTGATACACT | Pst I |
| rDPOX4 | GCTCTAGATGCTGAAGCCATTGACC | Xba I |
| rUPOX5 | AACTGCAGACTCCTTTGGGTTGAACTTG | Pst I |
| rDPOX5 | GCTCTAGAGGTAAAGCCTACTCCGACT | Xba I |
| The underlined are restriction ezyme cutting sites. | ||
1.1.2 主要培养基:
(1) LB培养基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，氯化钠10；(2) MM培养基(g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸铵10；(3) SM培养基：MM培养基中添加0.006% (W/V)尿嘧啶；(4) 5-氟乳清酸培养基：SM培养基中添加0.2% (W/V) 5-氟乳清酸；(5) 单一碳源培养基(g/L)：YNB 6.7，硫酸铵10，尿嘧啶0.06，液体培养基碳源为下列1种：2%葡萄糖、2% (V/V)正十二烷、2% (V/V)正十四烷、0.1% (V/V)月桂酸甲酯、0.1% (V/V)肉豆蔻酸甲酯。固体培养基在液体培养基的基础上，加入2% (W/V)琼脂粉；(6) YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10；(7) 发酵培养基(g/L)：蛋白胨3，酵母粉6，YNB 6.7，K2HPO4 7.2，KH2PO4 9.4，葡萄糖20，尿嘧啶0.06。
1.1.3 主要试剂与仪器:正十二烷、正十四烷、月桂酸甲酯(C12)、肉豆蔻酸甲酯(C14)等购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5-氟乳清酸(5-FOA)、酵母氮基(YNB)购自上海麦克林生化科技有限公司；氯化锂、山梨醇、EDTA-2Na、乙醇(色谱级)、二氯甲烷、甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；一步克隆试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。高速台式离心机、TSQ quantum Ultra EMR三重四级杆液质联用仪购自美国赛默飞世尔科技有限公司；UV2000紫外可见分光光度计购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PCR扩增仪购自杭州米欧仪器有限公司。
1.2 敲除盒的使用引物和敲除盒的使用及构建方法参考文献[17]，已经通过对热带假丝酵母ATCC 20336基因组进行分析，获得3个POX基因，分别为POX41、POX42、POX5基因，POX41和POX42为POX4的1对等位基因，POX5里有1对相同的等位基因，根据基因序列构建敲除盒。最后通过PCR扩增获得敲除盒POX42-gda324-URA3-POX42和POX5-gda324-URA3-POX5片段，上述所用引物见表 2。
1.3 β-氧化限速酶基因敲除过程采用酵母氯化锂转化法[18]，将敲除盒转入热带假丝酵母。本研究以F3YT为出发菌株，筛选标记基因是URA3基因，将URA3基因构建入敲除盒，转化后转化子将在MM固体培养基上生长，培养时间为3 d，需要提取基因组，通过PCR验证鉴定出正确转化子；正确转化子在5-氟乳清酸培养基上弹出标记基因，培养时间为4 d，生长出的转化子，通过PCR验证基因组，确保菌株弹出URA3后，PCR产物进行测序，保证序列比对无误，然后保藏为正确的菌株；本研究重复利用筛选标记URA3[19]。具体敲除过程以POX4基因敲除过程为例如图 2，POX5基因敲除过程是POX5基因敲除盒连续敲除2次。
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| 图 2 热带假丝酵母的POX4基因敲除流程图 Figure 2 Sequential gene disruption of POX4 in C. tropicalis. |
1.4 酵母细胞在单一碳源培养基上的点滴生长情况
生长平板点滴实验参照文献[20]。生长平板点滴实验: 野生型U-204、F3YT、F4PT菌株进行划线活化，接单菌落到SM培养基，菌浓度控制OD600=10，用0.9 %生理盐水清洗菌体2次，分别稀释100、101、102、103倍，点滴10 μL在单一碳源固体培养基上。在30 ℃，菌株以葡萄糖为碳源培养基上生长2 d，或以正十二烷、正十四烷、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯为碳源的培养基上生长3 d。热带假丝酵母菌体呈现白色，通过菌苔进行分辨并且记录菌体的生长情况。
生长曲线实验: 野生型U-204、F3YT和F4PT接种在SM培养基中培养过夜，控制种子液OD600=10时，接种量为0.5%，接入50 mL SM培养基中。在30 ℃，每隔4 h测定一次OD600，制成相应的生长曲线。
1.5 摇瓶发酵实验摇瓶发酵方法参照文献[3]，将菌株U-204、F3YT、F4PT划线活化，接单菌落到20 mL YPD培养基中，30 ℃、250 r/min培养2 d；接着以2% (V/V)接种量转接到30 mL YPD培养基在500 mL锥形瓶中培养，同时加入2% (V/V)正十二烷或2% (V/V)月桂酸甲酯培养2 d；然后以10 % (V/V)接种量转接至发酵培养基中，接种12 h后开始生物转化阶段，加入3% (V/V)正十二烷或2% (V/V)月桂酸甲酯，30 ℃培养4 d，每株菌3个生物学平行；发酵开始后，整个过程用2 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4将pH调至7.0，每隔24 h补加2.5% (V/V)甘油(50% (V/V))。
1.6 发酵产物中羟基脂肪酸的检测混标配制方法：准确称取12-羟基十二酸、十二烷二酸、14-羟基十四酸、十四烷二酸各10 mg，都溶解在1 mL色谱级乙醇中，配制成终浓度为10 mg/L的标准品。
样品配制方法[4]：30 mL发酵液中加入2 mol/L H2SO4，酸化至pH 1.0，与60 mL萃取液[二氯甲烷︰甲醇=2:1(V/V)]混匀于锥形瓶中，通过8 000 r/min冷冻离心，吸取10 mL下层萃取液加入旋蒸瓶中，在40 ℃下旋蒸10 min，使用2 mL色谱级乙醇复溶，统一稀释104制成样品。
最后通过液质联用仪检测发酵产物，液质联用检测采用文献[21]方法。
产物转化率按照公式(1)计算：
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公式(1) |
其中，n1：产物的摩尔量，n2：底物的摩尔量，m1：产物的质量，M1：产物的摩尔质量，m2：底物的质量，M2：底物的摩尔质量。
2 结果与分析 2.1 POX基因突变株的构建采用来自实验室POX4、POX5基因敲除盒质粒Ts-POX41-gda324-URA3、Ts-POX42-gda324-URA3和Ts-POX5-gda324-URA3[17]。参考上述重组质粒为模板，通过PCR扩增相应的敲除盒片段，如图 3A泳道1，将纯化后的删除盒片段转入目标菌株F3YT中，生长出的菌株使用上下游引物UPOX4和DPOX4进行基因组验证，如图 3B，初步验证泳道1为正确转化子菌株F1PT(URA3+)，通过PCR产物测序验证为正确的转化子，将转化子接种于SM培养基中，再涂布于5-氟乳清酸固体培养基上，长出的转化子，再使用上下游引物UPOX4和DPOX4进行基因组PCR，验证泳道2为菌株F1PT(URA3-)，通过PCR产物测序验证为URA3标记弹出菌株，泳道A1为U-204出发菌株；反复经过上述的过程，分别再构建出菌株F2PT、菌株F3PT、菌株F4PT。
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| 图 3 POX基因缺失菌株的构建 Figure 3 Construction of a gene deletion strain of POX gene. A: knockout cassettes. M: DL 5kb DNA Maker; 1: plasmid Ts-POX41-gda324-URA3 PCR products; 2: plasmid Ts-POX42-gda324-URA3 PCR products; 3: plasmid Ts-POX5-gda324-URA3 PCR products. B: POX4 gene disruption, M: DL 5kb DNA Maker. 1-A1 are PCR products of primers UPOX4 and primers DPOX4, the templates are F1PT(URA3+), F1PT (URA3-), U-204, respectively; 3-A2 are the PCR products of primers U2POX4 and primers D2POX4, the templates are F2PT(URA3+), F2PT(URA3-), U-204, respectively; 5-A3 are PCR products of primers UPOX5 and primers DPOX5, the templates are F3PT(URA3-), F3PT(URA3-), U-204, respectively; 7-A4 are PCR products of primers UPOX5 and primers DPOX5, and the templates are F4PT (URA3+), F4PT (URA3-), U-204, respectively. |
2.2 FAO和POX基因敲除对细胞的生长影响
U-204为本实验的对照菌株(URA3基因缺陷型菌株)，F3YT为本实验出发菌株(URA3和FAO基因缺陷型菌株)，通过同源重组的方法构建菌株，得到菌株F4PT为本实验目的菌株(URA3、FAO、POX基因缺陷型菌株)。分析这3株菌体在葡萄糖、正十二烷、正十四烷、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯5种单一碳源下的生长情况。
平板稀释培养结果如图 4所示。以葡萄糖为碳源时，U-204、F3YT、F4PT的生长依次递减，说明基因的缺失会使重组菌株生长变缓；F3YT以十四烷和肉豆蔻酸甲酯为碳源的生长好于以十二烷和月桂酸甲酯为碳源的生长，说明十四碳底物更利于菌株的生长；F4PT菌株在十四碳底物中的生长明显好于十二碳底物中的生长，说明在缺失FAO和POX基因的同时，不同碳链长度的底物会影响菌株的生长。
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| 图 4 对照菌株与基因缺失突变体在不同碳源固体培养基上的生长 Figure 4 Growth of control strain and mutants on solid medium with different carbon sources. |
不同重组菌的液体培养生长性能如图 5所示。在不同碳源培养基上如图 5A，敲除多个基因的F4PT菌株的生长速率明显低于其他菌株，说明基因累积敲除会影响重组菌株的生长。F4PT以十二烷与月桂酸甲酯为唯一碳源的生长速率差距较大(图 5B、C)，而以十四烷与肉豆蔻酸甲酯为唯一碳源的生长速率差距较小(图 5D、E)，反映出重组菌株对十四碳底物的耐受性较强。图 5E中F3YT的生长速率明显快于图 5D中F3YT生长速率，由图 1可知，脂肪酸甲酯代谢比烷烃代谢少3步氧化反应，因此证明以烷烃或脂肪酸为碳源时的生长情况不同。U-204、F3YT、F4PT在不同碳源的液体培养生长性能与平板稀释培养实验(图 4)的结果相一致。
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| 图 5 对照菌株与基因缺失突变体在不同碳源液体培养基上的生长 Figure 5 Growth of control strain and mutants on liquid medium with different carbon sources. A: Glucose as a single carbon source; B: Dodecane as a single carbon source; C: Methyl laurate as a single carbon source; D: Tetradecane as a single carbon source; D: Methyl myristate as a single carbon source; error bars represent the standard deviation of three independent experiments. |
这些结果表明，连续敲除基因确实能对重组菌株有一定的生长影响；另一方面证实了FAO限速酶基因在ω-氧化中参与了烷烃或脂肪酸的氧化，但是还有其他限速酶基因也对烷烃或脂肪酸代谢有影响；以葡萄糖为唯一碳源时，菌株有明显的生长差距，以烷烃或者脂肪酸甲酯(C12、C14)为唯一碳源时，十二碳底物和十四碳底物的生长速率各不相同，说明菌株对不同碳链长度的底物有一定的适应差异。
2.3 FAO基因和POX基因缺失对生产中链ω-羟基脂肪酸的影响经过4 d发酵，通过对发酵液的萃取旋蒸处理，将混标与待测样品同时采用液质联用仪进行检测，结果如图 6所示，图 6A中混标含有12-羟基十二酸和十二烷二酸，出峰时间分别为5.02 min、4.68 min；图 6C中混标含有14-羟基十四酸和十四烷二酸，出峰时间分别为5.61 min、5.81 min。
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| 图 6 液质联用分析发酵产物 Figure 6 LC-MS analysis of fermentation products. A: LC of 12-hydroxydodecanoic acid and dodecanedioic acid; B: MS of 12-hydroxydodecanoic acid; C: LC of 14-hydroxytetradecanoic acid and dodecanedicarboxylic acid; D: MS of 14-hydroxytetradecanoic acid. |
如图 1所示，热带假丝酵母中有强大的β-氧化体系，通过对其β-氧化途径的阻断，再敲除ω-氧化中限速酶基因FAO，可以达到累积产物ω-羟基脂肪酸的目的。热带假丝酵母代谢烷烃或脂肪酸途径中所有代谢产物最后都进入TCA循环，产生菌体所需的能量，当敲除POX基因阻断了β-氧化时，会积累二元酸，同时再累积敲除ω-氧化中的FAO基因，获得重组菌株F4PT进行发酵实验，可以验证是否产生ω-羟基脂肪酸。
由图 7A、B可知，以月桂酸甲酯为底物时，重组菌株F4PT有无挡板都能产生大量次要产物十二烷二酸，无挡板和有挡板摇瓶的十二烷二酸产量分别为16.53 g/L、19.67 g/L，转化率分别为67.78%、80.23%，而12-羟基十二酸的产量最高达到3.01 g/L，转化率为11.44%，F4PT并不能很大程度提升12-羟基十二酸的产量，说明FAO基因代谢十二碳底物的能力不强。
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| 图 7 F4PT在月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯为底物的发酵培养基中的产量及转化率 Figure 7 The yield and conversion rate of F4PT in fermentation medium with methyl laurate and methyl myristic acid ester as substrates. A: concentration of 12-hydroxydodecanoic acid under the substrate of methyl laurate; B: transformation rate of 12-hydroxydodecanoic acid under the substrate of methyl laurate; C: concentration of 14-hydroxytetradecanoic acid under the substrate of methyl myristate; D: transformation rate of 14-hydroxytetradecanoic acid under the substrate of methyl myristate; baffle-represents shake flask without baffle; baffle+ represents shake flask with baffle; error bars represent the standard deviation of three independent experiments. |
由图 7C、D可知，以肉豆蔻酸甲酯为底物时，F4PT无挡板产生较少次要产物十四烷二酸，产量为3.67 g/L，转化率为12.25%，但是14-羟基十四酸的产量也很低，只有0.87 g/L，然而当F4PT有挡板发酵时，十四烷二酸和14-羟基十四酸产量都明显提升，十四烷二酸产量为11.4 g/L，相较少于十二烷二酸产量，14-羟基十四酸最高产量达到8.69 g/L，转化率为33.14%，说明重组菌株F4PT代谢底物时需要大量的氧气，同时产物14-羟基十四酸也达到了快速积累，并且菌株在氧化十四碳底物时的效率明显高于十二碳底物。
发酵实验表明，POX基因的敲除确实能大量累积二元酸，FAO基因的限速作用在不同碳链长度的底物中各有差异；ω-羟基脂肪酸在有挡板摇瓶培养时的产量明显高于无挡板摇瓶的产量，并且会呈现较大的底物差异，说明热带假丝酵母在发酵过程中溶氧要求较高；有挡板条件下，F4PT的14-羟基十四酸的产量明显高于12-羟基十二酸，产量分别为3.01 g/L和8.69 g/L，转化率分别为33.14%和11.44%，14-羟基十四酸的转化率是12-羟基十二酸的将近3倍，说明构建的菌株F4PT代谢十四酸甲酯的能力相对于十二酸甲酯更为快速。
3 讨论长链二元酸是热带假丝酵母代谢烷烃或脂肪酸的最终产物，具有良好的市场前景，而ω-羟基脂肪酸是其代谢中间产物，但在生物医药领域应用前景更为广泛，物化性能更占优势[22]，因此定向将脂肪酸甲酯转化成ω-羟基脂肪酸，具有重要的研究意义。目前，国内外研究主要集中在产羟基脂肪酸的菌种筛选或代谢工程改造方面，工业化生物技术路线生产羟基脂肪酸的报道较少。最近的研究主要通过成功表达细胞色素P450单加氧酶基因，从葡萄糖为碳源出发，直接生成ω-羟基脂肪酸和二元酸，但是产量较低[23]。本研究通过对热带假丝酵母菌株的限速酶基因改造，以脂肪酸甲酯(C12、C14)为碳源，高效合成ω-羟基脂肪酸。
热带假丝酵母可以利用烷烃和脂肪酸通过生物氧化来合成从C11到C18的长链二元酸，α, ω-氧化形成的脂肪酸都会进入β-氧化途径[24]。Picataggio等研究发现在以烷烃为碳源的培养基中，对POX4和POX5这两对等位基因进行敲除，构建的突变株产生的二元酸的积累量明显增加[14]。刘树臣等用十二烷发酵，十二烷对二元酸的分子转化率为100%，说明POX4、POX5基因的缺失必然会积累二元酸[11]。因此本研究在敲除FAO基因的基础上，敲除POX4、POX5基因，就能阻断β-氧化的进行，另一方面FAO基因的限速能使ω-羟基脂肪酸积累。
本研究重复使用URA3基因作为选择标记[17]，成功构建出的菌株F4PT为FAO基因、POX基因双缺失，并对基因功能进行相应验证。根据发酵结果显示，达到了阻断β-氧化，限速ω-氧化的目的，重组菌株能够累积目标产物ω-羟基脂肪酸，但也大量积累了二元酸；其中14-羟基十四酸的产量明显高于12-羟基十二酸的产量，说明ω-氧化途径中，存在其他限速酶控制氧化不同碳链脂肪酸的能力。
本研究提供了从脂肪酸甲酯直接氧化到ω-羟基脂肪酸高转化率的可能，也说明了重组菌株对不同碳链脂肪酸甲酯的代谢能力差异，为代谢途径中改造其他限速酶基因，以达到定向转化特定目标产物提供了相应的依据与可能性。
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