短杆菌属(Brevibacterium)属于放线菌门，是短杆菌科中有效种数目最多的一个属。1953年Breed首次以Brevibacterium linens为模式种建立了该属^[1]。目前该属有效发表的菌种有35个(https://lpsn.dsmz.de/genus/brevibacterium)，菌株分离自多种环境，例如大米^[2]、奶酪^[3]、人类皮肤^[4]、受损的壁画^[5]，部分菌株是从发酵海鲜^[6]、腐烂的褐藻体^[7]和深海沉积物^[8-9]等高盐度的海洋环境中分离获得。短杆菌属菌株在工业上具有很多应用，研究发现短杆菌属可以利用细胞外蛋白酶和脂肪酶分解脂类和蛋白质(如酪蛋白)^[10-11]，同时，许多短杆菌属细菌也具有修饰含硫氨基酸以产生挥发性硫化物的能力，从而有利于挥发性风味物质的产生^[12-14]。短杆菌属菌株常在许多不同类型的奶酪中用作表面成熟培养物，来缩短奶酪的成熟时间，减少变质，更好地控制奶酪香气并提高食品安全性^[15]。除此之外，研究表明部分短杆菌还具有使合成染料脱色的功能^[16]。在农业中，菌株B. linens RS16可通过调节抗氧化剂防御和H⁺ATPase活性赋予水稻基因耐盐性^[17]。Brevibacterium antiquum DSM 21545^T被用于通过在混合培养的废水流中生长来回收富含磷的产品^[18]。

由于短杆菌在工业奶酪制造、生物降解和污水处理等生物技术方面应用成果显著，越来越多的短杆菌完成了基因组测序，为了解短杆菌菌株的生物学特征提供了有力支撑。Tettelin等^[19]于2005年第一次提出了泛基因组(pan-genome)的概念。泛基因组分析能够获得同一物种内的许多个体的基因组，用以完善该物种的遗传信息，能够捕获只存在于单个或部分个体及种群基因组上的特异性序列和功能基因，为深入研究该物种的系统进化地位以及与形态差异相关的功能生物学奠定基础。本文以实验室前期分离鉴定的6株来自不同海域的短杆菌属菌株作为主要研究对象，结合从NCBI数据库下载的23株短杆菌属模式菌株或非模式菌株的基因组数据，采用泛基因组学方法，分析比较不同菌株之间的基因组特征。利用核心基因簇，研究菌株之间的演化关系。此外，结合基因组功能分析，探讨海洋短杆菌与其他生境中的短杆菌在基因组上的差异，探究短杆菌属对海洋环境的适应机制。

1 材料与方法 1.1 菌株来源及选择标准

本研究中所使用的短杆菌基因组数据主要是从NCBI下载，有模式菌株基因组数据的种优先下载该种的模式菌株基因组数据，没有模式菌株基因组数据的种，下载该种非模式菌株的相关基因组数据。目前，短杆菌属共有35个有效发表的种，在NCBI数据库中，已有14个种的模式菌株基因组数据被公开，另有9个种虽没有该种的模式菌株基因组数据，但该种中有非模式性菌株的相关基因组数据。因此，我们从NCBI下载了这14个种的模式菌株及另外9个种中的9个非模式菌株的基因组数据，共计23个种的相关菌株基因组数据进行后续研究。此外，本实验室也从不同洋区获得了大量的短杆菌属菌株，以16S rRNA基因序列相似性99%为标准共划分为6个操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)，从每个OTU中各选取了1株菌株(YB235、Wo024、WW007、O1、o2、W7.2)作为代表性菌株进行了全基因测序，其中菌株O1已完成新种鉴定并公布了有效名，YB235、Wo024、W7.2和o2为潜在的新种。29株短杆菌的具体相关信息见表 1，其中有9株菌来源于海洋，称为海洋来源菌株，其他20个菌株来自多个生境(人、土壤、奶酪和肉汤等)，称为多重来源菌株。

1.2 基因组测序、组装和注释

本实验所分离的6株海洋来源的短杆菌完整基因组由天津生物芯片公司采用第三代测序技术PacBio Sequel系统测序完成。利用HGAP 4^[20]软件进行De novo组装获得。为了避免由于各项目所采用的基因预测及注释方法不同而造成的偏差，我们对29株菌采用Prokka1.13进行了重预测。同样，利用BLAST分别对nr库和COG直系同源蛋白数据库进行基因注释和COG注释，利用软件Canoco5对基因组大小、CDS和GC含量进行主成分分析。利用CRISPRCasFinder^[21]，在线预测各个菌株中的CRISPR元件，统计每个菌株中CRISPR元件的数量。

1.3 泛基因组学分析

1.3.1 泛基因组特征分析:

利用原核生物泛基因组自动化分析软件(pan-genomics analysis pipline，PGAP)^[22]对29株短杆菌进行泛基因组分析。首先，根据流程中的格式要求，编写python程序，依据Prokka的注释结果，准备核酸(nuc)、蛋白(pep)和功能(function)文件。功能聚类选择GF方法进行直系同源基因鉴定，将聚类结果Orthologs_Cluster.txt输入PanGP绘制泛基因组特征曲线和核心基因组特征曲线^[23]。我们从PGAP功能基因的聚类结果中，统计了各个菌株的核心基因、非必需基因以及特异性基因的分布等信息。

1.3.2 核心基因组建树、分化时间鉴定及ANI (average nucleotide identity)分析:

为更深入了解29株短杆菌的进化关系，我们挑选与短杆菌属同科不同属的Spelaeicoccus albus D3-40^T (accession：JACBZP000000000)菌株作为外源。对这30个菌株进行PGAP分析，得到单拷贝核心基因；利用MAFFT v7.471进行多序列比对^[24]，并用TrimAL切割多序列比对结果；利用软件IQ-TREE1.6.12筛选碱基替换模型并构建系统进化树^[25]。

从TIMETREE (http://www.timetree.org/)上获取不同物种的分化时间，然后利用r8s软件在系统进化树的基础上对菌株系统发育的分化时间进行鉴定^[26]。

利用perl脚本ANI.pl (https://github.com/jhbadger/scripts/blob/master/ANI.pl)计算29个短杆菌相互之间的ANI，并通过Heml软件绘制热图。

1.3.3 单拷贝核心基因一致性分析:

将29株短杆菌分成海洋来源和多重来源两大分支，比较2个分支内部以及2个分支之间短杆菌基因序列的一致性，利用blastn对物种中单拷贝核心基因序列进行all to all比对。分别提取出两个分支内序列一致性大于70%的比对结果，用python绘制序列一致性的密度分布曲线来观察两个分支内部基因序列的一致性差异。

1.3.4 转运系统:

为研究不同环境下短杆菌与环境的相互作用，我们比较了海洋来源和多重来源两个分支短杆菌中转运蛋白系统的差异。提取注释为转运蛋白(transporter protein)和假定蛋白(hypothetical protein)的基因作为转运蛋白的候选集，编写python脚本，下载TransportDB数据库中所有的fasta序列，通过BLAST比对(identity大于50%，evalue值1e-5，如果一个基因比对上多个功能基因，选取identity最大的一个)，进一步注释各个候选集中的转运蛋白。然后根据TransportDB中的转运蛋白家族功能分类对各个菌株中注释后的转运蛋白进行分类并统计数量，绘制热图比较分析具有差异的转运蛋白家族。

1.3.5 KEGG代谢通路分析:

为研究短杆菌属在不同环境下的信号通路，利用KEGG注释网站(https://www.genome.jp/kegg/kaas/)对各个菌株进行了在线的KEGG代谢通路分析，然后编写python脚本下载菌株所有通路的结果。比较细菌的信号系统、双组分系统以及磷酸转移酶系统3个与环境适应相关的通路^[27]。

1.3.6 基因家族扩增和收缩:

为研究短杆菌属在不同环境下的基因家族的变化，利用Orthofinder2.3.3分析短杆菌属所有菌株的基因组^[28]，获取统计基因家族中基因数量的文件。据此，用CAFÉ软件计算分析短杆菌属基因家族的扩增和收缩^[29]。

2 结果与分析 2.1 基因组组装和注释

对29株短杆菌的注释结果如表 1，本实验室所测6株菌株均组装成1条完整的contig，说明组装质量比较好，基因组大小在4 Mb左右，GC含量等于或大于0.65，编码DNA序列(coding DNA sequences，CDS)的数量为2 020–4 041。

2.2 基因组特征比较

为研究不同环境下短杆菌基因组基本特征的差异，我们对29株短杆菌的基因组大小、CDS数量和GC含量进行比较(图 1A)，发现海洋来源的短杆菌普遍具有较大的基因组，对以上三者进行主成分分析(图 1B)，发现CDS和基因组大小可以比较明显的将海洋短杆菌和部分其他生境来源的短杆菌分开。

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)是一种特异性的防御机制，能够有效防御质粒或噬菌体对细菌本身的水平基因转移，保持自身遗传信息的完整性。短杆菌属CRISPR分析发现，所有短杆菌均含有CRISPR元件。海洋来源短杆菌和多重来源短杆菌含有的CRISPR数量的均值都为4。在9株海洋来源短杆菌株中，有2/3的菌株含有的CRISPR元件数量大于等于平均值；而20株其他生境来源的短杆菌有1/2菌株CRISPR元件数量大于等于平均值，说明大部分海洋来源短杆菌含有更多的CRISPR元件。这可能是因为海洋环境中含有更多的噬菌体，因此海洋来源的短杆菌需要进化出更多的CRISPR元件，以抵御外源DNA的侵害，降低水平基因转移。

2.3 泛基因学分析

2.3.1 泛基因组大小及其特征曲线:

为了直观展示29株短杆菌泛基因组特征，根据PGAP聚类结果，利用PanGP绘制短杆菌的泛基因组特征曲线(图 2)，蓝色表示泛基因组特征曲线，绿色则表示核心基因组特征曲线。可以看出，随着菌株数量增多，泛基因组呈现明显增大趋势，因此短杆菌具有开放型泛基因组，同时随着短杆菌数量增加核心基因组明显减小。这29株短杆菌的泛基因组大小为17 445。泛基因组的特征方程为y=2 561.89x^0.55+696.79，同时R²=0.999 946、平均每增加一个基因组就增加500多个基因。通常认为细菌需要改变自身的基因组，适应不同的环境，因此在多种不同的生境中生存的细菌需要一个更大的泛基因组，由于短杆菌生境的多样性，短杆菌属开放型的泛基因组与其生境多样性一致。

对海洋来源分支和多重来源分支分别进行泛基因组分析，可以看出两分支内也具有开放型泛基因组(图 2B、C)，泛基因组的特征方程分别为y=1 823.19x^0.53+1 762.53且R²=0.999 901和y=3 034.61x^0.53+43.88且R²=0.999 957。

2.3.2 核心基因及菌株特异性基因组分布:

为研究短杆菌属的基因组的差异，我们分析了各个菌株中核心基因和菌株特异基因的分布。PAGP功能聚类结果显示，29株菌株共有的核心基因为838个，其中734个是单拷贝核心基因(图 3A)。分析两个分支内部核心基因和特有基因，海洋分支来源短杆菌共有的功能基因有2 042个，其中1 912个是单拷贝核心基因(图 3B)。多重分支来源短杆菌共有的功能基因有857个，其中757个是单拷贝核心基因(图 3C)。将29株短杆菌特异性基因的分布进行比较，两个分支内各个菌株中特异性基因的数量较多，这是由于随着菌株数量的增加，一部分菌株特异性基因变成非必需基因。

2.3.3 进化分析:

为了深入研究短杆菌属进化关系，以菌株Spelaeicoccus albus D3-40^T作为外群，以30个物种共有的640个单拷贝核心基因构建系统进化树。借助软件IQ-TREE测试了748个碱基替换模型，最优模型是Blosum62+F+R4，之后利用最大似然法，进行1 000次自展，成功构建了核心基因组系统进化树(图 4A)。同时构建了30个菌株的16S rRNA基因序列进化树(图 4B)。二者的拓扑结构并不一致，在核心基因组树中，基本所有分支的bootstrap值均为100，而16S rRNA基因树只有3个，说明核心基因组树具有更大的可靠性。

在核心基因组树的基础上，探索短杆菌属的分化时间，发现短杆菌属最近共同祖先最早出现在大约88百万年前(图 5)。菌株B. siliguriense DSM 23676^T和Brevibacterium sp. o2分化时间最近，在100万年前。

平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)是在核苷酸水平上比较两个基因组亲缘关系的指标，在近源物种之间具有较高的相似性，我们将29个短杆菌进行相互比较，计算ANI。结果如图 6所示，可以看出B. iodinum、B. sediminis、B. permense的ANI聚类在一起，说明它们之间的遗传距离比较接近。

2.3.4 单拷贝核心基因序列一致性:

为了研究不同生境下短杆菌基因序列的差异，我们提取短杆菌核心基因，分成海洋和多重来源两大分支。在两大分支内部，不同物种的核心基因序列进行相互比较，统计序列一致性。结果如图 7所示，海洋来源的短杆菌核心基因一致性密度分布曲线的峰值约为87%，而多重来源分支一致性密度曲线峰值约为83%。海洋来源分支核心基因更保守，而多重来源分支核心基因具有更高的多样性以适应不同的生存环境。

2.3.5 转运蛋白家族比较:

为了研究短杆菌和环境之间的相互作用，我们分析比较了海洋来源和多重来源跨膜运输系统的差异。我们根据TransportDB数据库中转运蛋白家族的分类，对两个分支富集的转运蛋白进行了比较(图 8)。海洋来源均含有的转运蛋白有ABC (The ATP-binding cassette superfamily)、BCCT (The betaine/carnitine/choline transporter (BCCT) Family)、MFS (The major facilitator superfamily)、SSS (The solute：sodium symporter family)、Nramp (The metal ion transporter family)、MgtE (The Mg²⁺ transporter-E family)、CitMHS (The citrate-Mg²⁺：H⁺ citrate-Ca²⁺：H⁺ symporter family)、NSS (The neurotransmitter：sodium symporter family)、NCS2 (The nucleobase：cation symporter-2 family)、PiT (The inorganic phosphate transporter family)、BASS (The bile acid：Na⁺ symporter family)，基本含有的是Sulp (The sulfate permease family)、TRAP-T (The tripartite ATP-independent periplasmic transporter family)、DASS (The divalent anion：Na⁺ symporter family)。海洋来源富集更多ABC、MFS、BCCT、SSS、Nramp、MgtE、CitMHS、DASS等转运蛋白。其中BCCT有助于协助相容性溶质甜菜碱，肉毒碱和胆碱的积累。这不仅有利于维持细胞渗透平衡，而且还充当蛋白质和细胞成分的稳定剂，防止变性，抵制高离子强度的影响。海洋来源菌株含有更多与营养吸收相关的转运蛋白：SSS、NCS2。ABC转运蛋白可能与其需要转运和代谢各种有毒物质和几丁质、支链淀粉、纤维素和淀粉能力相关。MFS促进糖、药物分子、肽、三羧酸循环代谢产物、有机阴离子和无机阴离子等溶质在电化学梯度下进行跨膜运输^[30]。

2.3.6 KEGG代谢通路:

为研究短杆菌如何针对不同环境做出适应性反应，针对各个短杆菌的KEGG代谢信号通路进行了分析。主要比较了两个分支中的双组分系统(two-component system)、细菌分泌系统(bacterial secretion system)以及磷酸转移酶系统(phosphotransferase system)。结果显示，在细菌分泌系统中，所有短杆菌均含有SecDF、SecY、YidC、SecA、FstY、ffh、TatC。部分海洋来源短杆菌(O1、o2、Wo024、YB235、FXJ8.269)含有SecE基因，只有少部分多重来源短杆菌含有SecE基因(NBRC 14811、NCTC9742、ATCC 19391s、VKM Ac-2280、DSM 23676)。Sec途径是细菌中第一个发现的跨细胞质膜向细菌周质和外膜输出蛋白质的分泌途径^[31]。SecE基因是一个与细胞胞外运输相关的基因^[32]，这可能是因为大部分海洋来源短杆菌向周围环境释放一类大分子的蛋白杂多糖胞外聚合物，防止冰晶形成，以适应低温环境。此外，在双组分系统中，只有O1同时含有与盐压力相关的DegS基因，与低温相关的DesK基因，细胞壁压力刺激物VraS基因，细胞壁活性物LiaS基因。这可能是因为短杆菌O1生活在7 000 m下的海底，这些基因可以帮助其适应高压、低温的环境。磷酸烯醇式丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统(PTS)是一个大的碳水化合物活性转运系统，可以催化底物葡萄糖苷和葡萄糖、海藻糖磷酸化。我们发现含有SecE基因的菌株(O1、o2、YB235、DSM 21545、FXJ8.269、FDAARGOS_902、NBRC 14811、VKM Ac-2280、DSM 22082、DSM 23676)基本含有与葡萄糖苷和葡萄糖、海藻糖磷酸化相关基因，可能是这些菌株为适应生存而在进化过程中获得的一种自身调节机制，可以更高效地利用碳源。

2.3.7 基因家族扩增和收缩:

为研究短杆菌在进化过程中基因家族的变化，我们做了基因家族的扩张和收缩分析(图 9)。最近共同祖先含有的基因家族有5 966个，在短杆菌进化过程中大部分基因家族都在收缩，在55百万年、50百万年、41百万年、35百万年、30百万年分支节点的时候，基因家族收缩得最剧烈，从而导致大量的基因丢失，而海洋来源的短杆菌基本不在这些分支上(图 5，图 9)，且大部分海洋来源短杆菌近期也没有经历大规模基因家族的收缩，这可能就是海洋来源短杆菌基因组偏大的原因。

3 总结

通过对短杆菌属不同生境菌株基因组进行比较分析，短杆菌基因组大小变化范围是2.4–4.9 Mb。与多重来源短杆菌基因组相比，海洋来源短杆菌基因组偏大。这可能与多重来源短杆菌经历更多的基因家族收缩相关。比较两个分支的核心基因的一致性密度曲线，发现海洋来源短杆菌具有更高的一致性，而多重来源短杆菌具有更高的多样性，这可能是短杆菌属菌株为适应不同的生存环境，其核心基因的大小随环境的变化而调整导致的。

在转运蛋白家族上，海洋来源短杆菌富集更多的ABC、MFS、BCCT、SSS、Nramp、MgtE、CitMHS、DASS及BCCT转运蛋白家族成员，这些物质有助于协助相容性溶质甜菜碱、肉碱和胆碱的积累。这些兼容的溶质可维持细胞渗透平衡，充当蛋白质和细胞成分的稳定剂。分析KEGG代谢路径，发现部分短杆菌菌株为适应海洋环境进化出了自己独特的基因以适应高压、寒冷的环境，同时为了更加高效地利用碳源获得了与PTS代谢相关的基因。海洋来源短杆菌也具有更多的CRISPR元件以应对海洋中大量噬菌体的威胁。

综上，本研究通过比较海洋来源与其他生境来源的短杆菌在基因组水平上的差异性，主要是进化过程中的基因家族扩增收缩、转运蛋白家族、代谢通路和CRISPR等方面的差异揭示了短杆菌的海洋环境适应性机制。下一步可对特定基因进行相关实验验证，深入分析短杆菌的海洋环境适应性机制。