2022, Vol. 62中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 邹莹, 吴嘉炳, 张雨欣, 李殿怡, 牛国清, 司军. 2022
- ZOU Ying, WU Jiabing, ZHANG Yuxin, LI Dianyi, NIU Guoqing, SI Jun.
- 茎瘤芥根际一株产紫色杆菌素杜擀氏菌的分离鉴定及其基因组分析
- Identification and genome analysis of the violacein-producing Duganella sp. isolated from Brassica juncea var. tumida rhizosphere
- 微生物学报, 62(11): 4122-4140
- Acta Microbiologica Sinica, 62(11): 4122-4140
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-20
- 修回日期：2022-05-19
- 网络出版日期：2022-07-26
引用本文 |
2. 西南大学园艺园林学院, 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400715;
3. 西南大学园艺园林学院, 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400715
2. Chongqing Key Laboratory of Olericulture, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China;
3. Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China
茎瘤芥(Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee)，俗称青菜头或菜头，是十字花科芸薹属的一种重要蔬菜，既可鲜食又可加工成榨菜食用。重庆是中国榨菜生产的发祥地，是国内规模最大、加工原料生产最集中的优势产区[1]。2021年，重庆市种植面积约12.0×104 hm2，占全国种植面积56%左右，主要分布在涪陵、武隆、万州等13个区县。其中，核心种植区涪陵区种植面积4.9×104 hm2，年产量达到162.6万t，总产值达到130亿元，成为当地农村经济优势特色支柱产业[2]。
涪陵地处重庆市中部、三峡库区腹地，位于长江、乌江交汇的河谷地带，其独特的气候条件和土壤环境不仅为茎瘤芥种植提供了极佳的地理要素，而且塑造了当地特有的微生物群落。植物根际存在大量种类丰富、功能多样的微生物，这些微生物群落在促进植物生长、营养吸收、胁迫耐受和病原抵御等方面发挥着重要的作用[3]。涪陵茎瘤芥种植区域微生物群落，特别是根际微生物，在茎瘤芥的生长发育和病原抵御方面发挥着重要的作用[4–5]。同时，茎瘤芥根际微生物是一个重要的微生物资源库，但相关资源的挖掘和利用方面的研究却鲜有报道。
紫色杆菌素(violacein)是微生物产生的吲哚类次级代谢产物，已报道的产生菌包括紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)[6]、蓝黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)[7]、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp. 520P1)[8]和杜擀氏菌(Duganella spp.)[9–11]等。紫色杆菌素具有广泛的生物活性，如抗肿瘤[12]、抗真菌[13]，抗病毒[12]和抗细菌[14–15]等，具有一定的药物开发价值。此外，紫色杆菌素对天然原料(如丝绸、棉、毛)及合成原料(如尼龙)都有很好的着色效果，在生物染料领域具有广阔的应用前景[16]。目前，已在多种紫色杆菌素产生菌中鉴定了其生物合成基因簇，由5个基因组成一个转录单元vioABCDE (图 1A)，通过各基因的功能解析，已阐明了紫色杆菌素的生物合成途径[16]。L-色氨酸经VioA (FAD依赖氧化还原酶)氧化形成吲哚-3-丙酮酸亚胺(indole-3-pyruvic acid imine, IPA imine)，后者经VioB (亚胺苯基丙酮酸二聚体合成酶)催化缩合形成IPA imine dimer。IPA imine dimer在VioE (紫色杆菌素生物合成酶)的作用下形成脱氧紫色杆菌素前体(protodeoxyviolaceinic acid, PDVA)，PDVA在VioD (色氨酸羟化酶)和VioC (FAD依赖单加氧酶)的作用下生成紫色杆菌素。此外，PDVA可以直接经VioC催化形成DVA，后者经自发反应形成脱氧紫色杆菌素(图 1B)。
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| 图 1 紫色杆菌素生物合成基因簇(A)及其合成途径(B) Figure 1 Genetic organization of violacein biosynthetic gene cluster (A) and biosynthetic pathway of violacein (B). |
杜擀氏菌是常见于土壤和水等自然环境的革兰氏阴性细菌，属于变形菌门、β变形菌纲、伯克氏菌目、草酸杆菌科。杜擀氏菌是一类嗜温、好氧、可游动、不产孢的杆状细菌[17]。该属的第一个种于1968年分离自污水，并于1977年命名为类动胶杜擀氏菌(Duganella zoogloeoides)[18]。随后，科研人员陆续从森林土壤、植物叶表、甘蔗根际和河流等环境中分离到了不同的杜擀氏菌[19–22]。目前，对杜擀氏菌在自然生境中的功能知之甚少，且仅有少数菌株完成了基因组测序[23]，但已有研究表明杜擀氏菌属的部分菌株可以产生紫色杆菌素[9–11]。
本研究从茎瘤芥根际分离得到256株微生物，初步鉴定了120株，从中选择一株杜擀氏菌进行了全基因组测序和生物信息分析，发现该菌含有9个次级代谢产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)，其中7个基因簇与已知化合物编码基因簇同源性很低。同时，我们发现该菌含有紫色杆菌素合成基因簇，并在其发酵液中分离得到了紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素。此外，通过分段酶切连接的方法，克隆得到了紫色杆菌素生物合成基因簇，并在变铅青链霉菌TK23中进行了异源表达。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集采样地点位于重庆市涪陵区二渡村和邓家村(29°72ʹN，107°40ʹE)，田间随机采取茎瘤芥，除去泥土后将截取的茎瘤芥根装入洁净的样品袋中，取回后置于冰箱中保存备用。
1.1.2 培养基选择10种常用的微生物培养基，用于微生物的分离和纯培养。这些培养基包括：LB (g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，琼脂12.0；1/10 LB (g/L)：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，琼脂12.0；ISP2 (g/L)：酵母提取物4.0，麦芽提取物10.0，葡萄糖4.0，琼脂20.0，调节pH值至7.0；ISP3 (g/L)：燕麦片20.0，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，琼脂20.0；ISP4 (g/L)：可溶性淀粉10.0，K2HPO4 1.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 1.0，(NH4)2SO4 2.0，CaCO3 2.0，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·7H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，琼脂20.0；NA (g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨5.0，琼脂12.0；TSA (g/L)：TSB 30.0，琼脂20.0；Gauze’s Synthetic Medium No.1 (g/L)：K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，KNO3 1.0，可溶性淀粉20.0，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂20.0；PDA (g/L)：土豆200.0，葡萄糖20.0，琼脂20.0；YEPDA (g/L)：蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，酵母提取物10.0，琼脂12.0。链霉菌培养基包括：MS (g/L)：豆粉20.0，甘露醇20.0，琼脂20.0；R5MS (g/L)：葡萄糖10.0，酵母提取物5.0，酪氨酸0.1，K2SO4 0.25，MgCl2·6H2O 10.12，TES buffer 5.73，微量元素2.0 mL，琼脂20.0，调节pH值至7.2；SCM3 (g/L)：可溶性淀粉30.0，黄豆饼粉10.0，酵母提取物2.5，CaCO3 5.0。
1.1.3 菌株本研究所用菌株见表 1，所用质粒见表 2。本研究所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表 3。
| Strains | Genotype/description | Reference/source |
| Duganella sp. BjR8 | Wild-type, violacein producer | This work |
| Escherichia coli | ||
| JM109 | endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk+), relA1, supE44, Δ(lac-proAB), [F´traD36, proAB, lacIqZΔM15] | Promega |
| BW25113/pIJ790 | K-12 derivative, ΔaraBAD, ΔrhaBAD/pIJ790 | [24] |
| ET12567/pUZ8002 | dam dcm hsdS cat tet/pUZ8002 | [25] |
| Streptomyces | ||
| S. lividans TK23 | spc-l, SLP2–, SLP3– | [26] |
| TK23-pSET152 | S. lividans TK23 containing pSET152 | This work |
| TK23-vio | S. lividans TK23 containing pSET152:: vio | This work |
| Plasmids | Relevant characteristics | Reference/source |
| pBluescript Ⅱ KS(+) | Routine cloning and subcloning vector, AmpR | Stratagene |
| pSET152 | Integrative vector, AprR | [27] |
| pSET152:: PhrdB-neo | pSET152 containing neo driven by hrdB promoter | [28] |
| pBS: : vio | A derivative of pBluescript Ⅱ KS(+) containing the violacein biosynthetic gene cluster, AmpR | This work |
| pSET152:: PhrdB | pSET152 containing the constitutive hrdB promoter, AprR | This work |
| pSET152:: vioUpDn | pSET152 containing hrdB promoter, 503 bp of vioA and 500 bp orf0372–0373, AprR | This work |
| pSET152:: vio | A derivative of pSET152 containing the violacein biosynthetic gene cluster with vioA driven by the hrdB promoter, AprR | This work |
| Primers | Sequences (5′→3′) | Purpose |
| vio 1-F | AATTTCTAGAGGCCCGCCCCCGCTCCGTGCAC | PCR 1 620 bp of F1 |
| vio 1-R | AATTGAATTCGGATCCGTGTAGAACTCGACCCCGTGCGG | PCR 1 620 bp of F1 |
| vio 2-F | AATTTCTAGAGGATCCGCAAAGCGCGCATC | PCR 4 121 bp of F2 |
| vio 2-R | AATTCTCGAGCGCCATGTTCATGCC | PCR 4 121 bp of F2 |
| vio 3-F | AATTTCTAGACTCGAGGATGTGTACGTCTTCATCACG | PCR of 2 038 bp of F3 |
| vio 3-R | AATTGGTACCCCCGGGTTGGATGCGCCGCCG | PCR of 2 038 bp of F3 |
| vio 4-F | AATTTCTAGACCCGGGCGCGGGCCGCATCG | PCR of 3 213 bp of F4 |
| vio 4-R | AATTGGTACCACAATGAACGATGCTGAACC | PCR of 3 213 bp of F4 |
| hrdB-F | AATTTCTAGACCGCCTTCCGCCGGAACG | PCR 428 bp of hrdB |
| hrdB-R | AATTGGATCCGAACAACCTCTCGGAACGTTG | PCR 428 bp of hrdB |
| vio Up-F | tccgagaggttgttcATGACACAGTATTCCGACATTTG | PCR 503 bp of vioA |
| vio Up-R | AAGCTTTGCGTTTCCGGATGC | PCR 503 bp of vioA |
| vio Dn-F | tccggaaacgcaaagcttGGATCCGGGCTGCGCGAACCAGCTGTG | PCR 500 bp of orf0374 |
| vio Dn-R | ctatgacatgattacgaattcGGTACCACAATGAACGATGCTG | PCR 500 bp of orf 0374 |
| Underlined sequences for restriction enzyme recognition sites, and lower case letters for overlapping between DNA sequences. | ||
1.1.4 主要试剂和仪器
甲醇和乙腈为国产HPLC级；氨苄青霉素、卡那霉素、安普霉素购自上海生物工程股份有限公司；KOD Plus Neo购自TOYOBO公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；电穿孔系统(Bio-Rad Gene Pulser Xcell)；PCR仪(Bio-Rad T100)；恒温培养箱(上海博讯BXS-250；上海博讯BPX-52)；震荡培养箱(上海知楚ZQZY-85BNA)；溶剂蒸发工作站(GeneVac EZ-2)；全自动凝胶成像分析系统(上海蓝梦ZF-288)；高效液相色谱仪(岛津LC-20AR)；高分辨质谱系统(安捷伦6230)；荧光正置显微镜(Zeiss Axio Imager Z2)。
1.2 样品处理与菌株分离及鉴定首先，用75%的酒精清洗破壁机内腔，置于紫外下照射10 min取出保存的茎瘤芥根，用无菌的去离子水清洗去除表面的污泥，用剪刀将根剪碎。称取20克根放入破壁机中，加入100 mL无菌水将根破碎至糊状，经无菌纱布过滤后，用生理盐水进行梯度稀释。取稀释溶液100 μL分别涂布于上述10种常用微生物培养基，其中PDA和YEPAD培养基置于26 ℃培养，其余培养基置于28 ℃培养。培养2–5 d，用平板划线法挑取单菌落于对应的固体培养基上，继续培养2–5 d，期间观察并记录菌落形态。利用通用引物27F/1492R和ITS1/ITS4分别PCR扩增细菌的16S rRNA和真菌的18S rRNA基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，将成功扩增得到的PCR产物送至上海生物工程股份有限公司测序。得到的序列用BioEdit拼接，所得序列在EzBioCloud和NCBI上比对，获得初步鉴定结果，并利用MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树。
1.3 杜擀氏菌BjR8的培养挑取杜擀氏菌BjR8单菌落，接种于液体培养基PDB中，28 ℃摇床培养至OD600=0.5。吸取液体菌液，在PDA、NA、R2A和YMA 4种固体平板上划线，28 ℃培养3 d后观察菌落形态。同时，以2%的接种量将菌液接种于50 mL PDB、NB、R2B和YMB液体培养基中，28 ℃摇床培养3 d后观察发酵液的颜色变化。
1.4 杜擀氏菌BjR8的系统进化树构建将杜擀氏菌BjR8的16S rRNA基因序列在EzBioCloud中进行比对，选取相似性较高的序列，同时选取能产生紫色杆菌素的紫色色杆菌(Chromobacterium violacein)、蓝黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)、藤黄紫假交替单胞菌(Pseudoalteromonas ulvae)的16S rRNA基因序列，利用MEGA7.0构建系统进化树。
1.5 基因组测序和生物信息学分析杜擀氏菌BjR8的基因组由上海美吉公司测序完成，基因组的特征分析在上海美吉生物的Ⅰ-Sanger云平台(www.i-sanger.com)上完成。利用antiSMASH 6.0 (http://antismash.secondarymetabolites.org/)对菌株的次级代谢产物生物合成基因簇进行分析。
1.6 菌株发酵及产物分析鉴定杜擀氏菌BjR8接种于50 mL PDB中，48 h后转接至含有200 mL PDB的1 L锥形瓶中，28 ℃培养4 d。收集所得3 L发酵液，用乙酸乙酯萃取，旋干后溶于50 mL甲醇，样品经分子筛分离得到化合物1和2。HPLC检测条件：流动相A为含0.1%甲酸的去离子水，流动相B为乙腈，流速1 mL/min，检测波长为254。HPLC洗脱程序为：0–3 min，10%乙腈；3–15 min，10%–50%乙腈；15–17 min，50%–90%乙腈；17–19 min，90%乙腈；19–21 min，90%–10%乙腈；21–35 min，10%乙腈。
1.7 基因簇的克隆与异源表达以pSET152:: PhrdB-neo为模板，以hrdB-F/R为引物，PCR扩增后可得到hrdB启动子片段，经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后连接到pSET152的相应位点得到重组质粒pSET152:: PhrdB。以杜擀氏菌BjR8基因组为模板，以vio Up-F/R为引物，扩增得到503 bp的vioA部分片段，以vio Dn-F/R为引物，扩增得到500 bp的orf0372–orf0373片段，通过重叠延伸PCR (overlap PCR)将2个片段拼接在一起，通过同源重组连入预先用BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ线性化的pSET152:: PhrdB，得到重组质粒pSET152:: vioUpDn。以杜擀氏菌BjR8的基因组为模板，分4个片段克隆紫色杆菌素基因簇，依次经酶切连接入pBluescript Ⅱ KS(+)得到重组质粒pBS: : vio。通过PCR-targeting的方法，将基因簇转移到预先用BamH Ⅰ线性化的pSET152:: vioUpDn，得到重组质粒pSET152:: vio。将pSET152:: vio转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移导入变铅青链霉菌TK23中[26]。
2 结果与分析 2.1 茎瘤芥根际微生物的分离与初步鉴定我们随机采集了重庆市涪陵区二渡村和邓家村的茎瘤芥根，选用10种常用微生物培养基对根际及内生微生物进行分离和纯培养，共得到微生物256株。首先，通过观察菌落形态、大小、颜色和干湿等特征，将菌株大致分为细菌(229株)和真菌(27株)。随后，使用通用引物分别对细菌的16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因进行PCR扩增，所得PCR产物进行测序和序列分析，对其中120个菌株进行了鉴定。通过构建系统发育树对这些菌株进行了初步分析，发现细菌主要包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)，分别归于35个属，共95个种(图 2)，其中链霉菌属(Streptomyces)的菌株最多(36株)，其次为芽孢杆菌属(Bacillus)(11株)。真菌仅有子囊菌门(Ascomycota)，分别归属于10个属，共25个种，其中青霉属(Penicillium)和篮状菌属(Talaromyces)种类较多。以上结果表明，茎瘤芥根含有丰富多样的微生物，其中细菌更为丰富。
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| 图 2 茎瘤芥根际分离微生物菌株的系统发育特征 从内圈到外圈的环分别代表分离菌株所用培养基和菌株所属门类，最外层表示分离微生物菌株的保存编号 Figure 2 Cladogram depicting the phylogenetic relationship among 120 isolates from Chinese mustard rhizosphere. The inner ring depicts the medium used for culture of the isolated microbial strains. The outer ring shows the four phyla to which the isolates belong. The outermost tag indicates strain numbers. |
2.2 杜擀氏菌BjR8的形态特征与初步鉴定
分离的菌株中有2株杜擀氏菌BjR8和BjR16，分别分离自PDA和Gauze's Synthetic Medium No.1培养基，其中BjR8在PDA平板上呈现紫色菌落，后续研究主要围绕BjR8展开。首先，将杜擀氏菌BjR8分别接种在4种不同的固体培养基(PDA、R2A、YMA和NA)平板上，培养3 d后对菌株形态进行了观察，发现BjR8在4种固体培养基上均呈现紫色(图 3A)，菌落表面光滑、湿润、黏稠，在PDA、YMA和NA培养基上呈圆形凸起，在R2A培养基上呈不规则凸起(图 3B)。将该菌株分别接种于相应的液体培养基中，培养3 d后，发现PDB发酵液呈深紫色，R2B发酵液呈淡紫色，而YMB和NB发酵液则呈现黄色(图 3C)，我们推测该菌在PDB和R2B中可以产生紫色化合物。此外，我们对液体培养液中的菌株形态进行了显微观察，发现BjR8在4种液体培养基中均呈短杆状(图 3D)。以上结果表明，BjR8是一株可以产生紫色化合物的短杆状细菌。为了进一步鉴定BjR8，将其16S rRNA基因序列(ON384039.1)在NCBI中进行Blast比对分析，选取部分同源序列，利用MEGA 7.0构建系统进化树，结果发现BjR8与Duganella aceris strain SAP-35的亲缘关系最近(图 4)，其同源性为98.56%，将其命名为Duganella sp. BjR8。
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| 图 3 杜擀氏菌BjR8在不固体培养基上(A, B)和液体培养基中的生长情况(C, D) Figure 3 Growth of Duganella sp. BjR8 on different solid media (A, B) or in liquid media (C, D). |
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| 图 4 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree showing the relationships between Duganella sp. BjR8 and closely related species. Violacein-producing strains were indicated with a purple star, and numbers in parentheses represent accession numbers of 16S RNA sequences in GenBank. |
2.3 基因组测序及分析
Illumina HiSeq二代测序质控数据显示，插入序列长480 bp，原始reads读长150 bp，经过一系列的质量剪切之后得到的高质量reads，质控后的reads用来进行基因组组装，Circos基因组如图 5所示。PacBio三代测序结果显示，总Reads的数量为210 407，平均reads读长7 361.95 bp，总碱基长1 549 006 813 bp。测序得到的基因组信息显示，该菌株为杜擀氏菌，其基因组为一条环状染色体，全长7 205 593 bp，平均GC含量为64.67%。预测有6 241个编码基因，基因总长度6 579 390 bp，占基因组百分比为91.31%，平均长度1 054 bp。基因组中有84个tRNA，共21种类型，其中rRNA共有14个，包括16S rRNA和23S rRNA各7个(表 4)。进一步分析发现KEGG数据库中共有3 001个基因，占基因数目的48.09%，根据其功能主要分为胞内生命过程(cellular processes)、代谢(metabolism)、人类疾病(human diseases)、遗传信息处理(genetic information processing)、有机体生命系统(organismal systems)和环境信息处理(environmental information processing) 6类，其中代谢相关基因数目为2 465个(图 6)。在COG数据库中共有5 479个基因，占总基因数目的87.79%，包括22种类型，除了未知功能基因外，信号转导机制(signal transduction mechanisms)和转录(transcription)相关基因数目最多，分别为443个和419个(图 7)。GO数据库中共1 720个基因，占总基因数目的27.56%，根据功能不同这些基因被分为3类，包括分子功能(molecular function)、细胞组成(cellular component)和生物过程(biological process) (图 8)。
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| 图 5 杜擀氏菌BjR8的基因组图 Figure 5 Circular genome map of Duganella sp. BjR8. Starting from the inner circle moving outwards, the following tracks are shown: GC-Skew, G+C content, rRNA and tRNA, predicted protein coding genes on forward and reverse strand, and genome size. |
| Feature | Chromosome characteristics |
| Chromosome size/bp | 7 205 593 |
| G+C content/% | 64.67 |
| Predicted genes | 6 241 |
| rRNA operons | 14 |
| tRNA genes | 84 |
| sRNA genes | 29 |
| Genes assigned to COG | 5 479 |
| Genes assigned to GO | 1 720 |
| Genes assigned to KEGG | 3 001 |
| CRISPR repeat regions | 65 |
| Prophages | 0 |
| Simple tandem repeats | 178 |
| Interspersed repeats | 56 |
| Genomic islands | 7 |
| Carbohydrate-active enzymes | 237 |
| Transposable element | 4 |
| Antibiotic resistance genes | 386 |
| Virulence factors | 858 |
| Secondary metabolite gene clusters | 9 |
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| 图 6 杜擀氏菌BjR8基因组KEGG数据库注释结果 Figure 6 The annotation result of Duganella sp. BjR8 genome against KEGG database. |
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| 图 7 杜擀氏菌BjR8基因组COG数据库注释结果 Figure 7 The annotation result of Duganella sp. BjR8 genome against COG database. |
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| 图 8 杜擀氏菌BjR8基因组GO数据库注释结果 Figure 8 The annotation result of Duganella sp. BjR8 genome against GO database. |
为了评估杜擀氏菌BjR8的次级代谢产物合成能力，对其基因组序列进行了antiSMASH分析，共发现9个次级代谢产物生物合成基因簇，分别命名为基因簇1–9 (表 5)，其中包含1个非核糖体多肽合成酶(NRPS)类、1个聚酮合成酶(PKS)类、1个NRPS-PKS类、4个核糖体合成和翻译后修饰多肽(RiPP)类、1个萜类(terpene)和1个生物碱(alkaloid)类。其中，基因簇2与来自Duganella sp. B2[29]的紫色杆菌素基因簇有100%的同源性，与来自紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)[30]的紫色杆菌素基因簇有80%的同源性，基因簇9与来自费氏弧菌(Vibrio fischeri) ES114[31]的APE基因簇有40%的同源性，其余7个基因簇与已知化合物编码基因簇同源性很低，说明该菌具有产生多种新型化合物的潜力。
| Cluster | Type | From | To | Most similar known BGC |
| 1 | RiPP | 30 602 | 41 295 | unknow |
| 2 | Alkaloid | 419 316 | 442 337 | Violacein |
| 3 | RiPP | 585 161 | 607 099 | unknow |
| 4 | RiPP | 1 604 586 | 1 613 666 | unknow |
| 5 | RiPP | 2 181 326 | 2 192 973 | unknow |
| 6 | Terpene | 3 783 019 | 3 806 355 | unknow |
| 7 | NRPS | 3 914 526 | 4 005 801 | unknow |
| 8 | PKS | 4 507 847 | 4 559 826 | unknow |
| 9 | NRPS-PKS | 5 627 658 | 5 671 264 | APE Vf |
2.4 紫色杆菌素的鉴定
基于杜擀氏菌BjR8的形态观察及基因组序列分析，我们预测该菌具备产生紫色杆菌素的能力。为了验证这一推测，我们收集了PDB、R2B、YMB和NB的发酵液，通过HPLC分析在PDB发酵液中检测到2个明显的峰，其保留时间分别为21.1 min和22.3 min，分别命名为化合物1和2 (图 9A)。在R2B和YMB中也检测到这2个化合物，但其峰值明显偏低，而在NB中几乎未检测到这两个峰的存在(图 9A)。HRMS分析发现化合物1的分子量为344.094 1 [M+H]+，化合物2的分子量为328.099 5 [M+H]+ (图 9B)，确定化合物1为紫色杆菌素，化合物2为脱氧紫色杆菌素。以上结果表明，杜擀氏菌BjR8可以产生紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素，且在PDB培养基中产量较高。
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| 图 9 杜擀氏菌BjR8发酵液的HPLC分析及其产物的HRMS分析 Figure 9 HPLC analysis of Duganella sp. BjR8 in different fermentation media (A) and the result of HRMS analysis of Compounds 1 and 2 (B). 1: violacein; 2: deoxyviolacein. |
2.5 紫色杆菌素基因簇的克隆及其异源表达
综上所述，杜擀氏菌BjR8基因组中有一个紫色杆菌素基因簇(基因簇2)，进一步分析发现，该基因簇由一个转录单元组成orf0366–0370，其编码产物分别为VioA–E的同源蛋白(表 6)。为了进一步验证该基因簇负责紫色杆菌素的生物合成，我们首先以杜擀氏菌BjR8基因组为模板，通过PCR分别获得涵盖整个基因簇的4个DNA片段F1–F4，依次经酶切、连接将其克隆到pBluescript Ⅱ KS(+)上，得到重组质粒pBS: : vio (图 10A)。随后，通过PCR-targeting的方法，将基因簇转移到链霉菌整合型质粒pSET152上，得到重组质粒pSET152:: vio (图 10A)。值得一提的是，在pSET152:: vio中，vioABCDE表达由组成型hrdB (天蓝色链霉菌sigma 70编码基因)启动子控制。获得的重组质粒经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分别酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现电泳条带与预期一致(图 10B)，说明我们成功克隆得到了紫色杆菌素基因簇。
| ORF | No. of amino acids | Proposed function | Protein Homology | Amino acid Identity/% |
| vioA | 435 | FAD-dependent oxidoreductase | Rugamonas sp. FT81W FAD-dependent oxidoreductase (WP_161087100.1) | 423/434 (97) |
| vioB | 1 007 | Iminophenyl-pyruvate dimer synthase | Rugamonas sp. FT81W iminophenyl-pyruvate dimer synthase VioB (WP_161087101.1) | 974/1 006 (97) |
| vioC | 431 | FAD-dependent monooxygenase | Rugamonas sp. FT81W FAD-dependent monooxygenase (OFA07151.1) | 426/430 (99) |
| vioD | 373 | Tryptophan hydroxylase | Rugamonas sp. FT81W tryptophan hydroxylase (MYM98255.1) | 364/372 (98) |
| vioE | 190 | Violacein biosynthesis enzyme | Rugamonas sp. FT81W violacein biosynthesis enzyme VioE (WP_161087104.1) | 183/189 (97) |
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| 图 10 重组质粒pSET152:: vio的构建示意图及其酶切验证 Figure 10 A simplified schematic diagram for the construction of pSET152:: vio (A) and confirmation of the recombinant plasmids by restriction digestion (B). |
将重组质粒pSET152:: vio通过接合转移导入变铅青链霉菌TK23中，得到重组菌株TK23-vio。同时，将质粒pSET152导入变铅青链霉菌TK23中，得到对照菌株TK23-pSET152。将变铅青链霉菌TK23、TK23-pSET152和TK23-vio分别接种于R5MS平板上，结果发现TK23和TK23-pSET152呈现红色，而TK23-vio呈现紫色(图 11A)，说明紫色杆菌素基因簇在链霉菌中成功异源表达。将TK23、TK23-pSET152和TK23-vio分别在SCM3中进行发酵，结果显示，只有TK23-vio的发酵液呈现明显的紫色(图 11 B)。取发酵液进行HPLC检测，发现TK23-vio在22.3 min有新化合物的积累(图 11C)，HRMS检测该化合物的分子量为328.109 8 [M+H]+ (图 11D)，说明vio基因簇成功在变铅青链霉菌TK23中实现异源表达，且其表达产物为脱氧紫色杆菌素，并未检测到紫色杆菌素。
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| 图 11 紫色杆菌素基因簇的异源表达及其产物鉴定 链霉菌菌株在R5MS固体平板上的表征(A)，在SCM3液体培养基中发酵(B)以及发酵液的HPLC分析(C)和HRMS检测(D) Figure 11 Heterologous expression of the vioABCDE gene cluster in S. lividans TK23. The recombinant strains were cultivated on R5MS solid plates (A), in liquid SCM3 (B), and the fermentation broths were subjected to HPLC analysis (C) and HRMS analysis (D). |
3 讨论
近年来，国内外研究人员对植物的根际微生物群落进行了较为系统的研究[32–36]，茎瘤芥根际微生物群落多样性的报道却明显偏少。罗远莉等对茎瘤芥根肿病发病程度不同的土壤中微生物多样性进行了研究，发现不同发病程度土壤中细菌和真菌种类存在差异[4]。王殿东等对茎瘤芥根肿病不同发病时期根际土壤真菌群落变化进行了研究，发现不同发病时期真菌菌群的变化规律[5]。本研究在重庆市涪陵区二渡村和邓家村随机采集了的茎瘤芥根，从中分离得到256株菌，并对其中120株菌进行了鉴定，对其微生物群落多样性进行了初步研究。后续研究中，我们计划增加不同样品的采集，如不同区域选择、不同生长时期和不同病害程度等，通过宏基因组测序对茎瘤芥根际微生物组的多样性进行系统深入的研究，结合微生物纯培养技术，建立茎瘤芥根际微生物菌种资源库。
植物根际微生物不仅在植物生长发育、胁迫耐受和病原抵御等方面发挥着重要的作用，而且是一个重要的微生物资源宝库，其中蕴藏了丰富多样的遗传资源。我们从分离鉴定的微生物菌株中选择了一株杜擀氏菌BjR8，进行了基因组测序和生物信息学分析，发现该菌含有9个次级代谢基因簇，其中7个与已知化合物编码基因簇同源性很低，说明该菌具有产生多种类型新化合物的合成潜力。目前，正在通过不同技术手段，对这7个基因簇进行功能解析，以期获得具有新结构新功能的次级代谢产物。
杜擀氏菌BjR8基因组中含有一个紫色杆菌素生物合成基因簇，通过分片段克隆，我们获得了完整的紫色杆菌素基因簇，并将其导入不同异源宿主中进行异源表达。目前，已成功在变铅青链霉菌TK23中实现了异源表达，并检测到紫色杆菌素的结构类似物脱氧紫色杆菌素，但未检测到紫色杆菌素。据文献报道，紫色杆菌素的生物合成由vioABCDE负责完成，其中脱氧紫色杆菌素的合成由其中的一个分支途径完成，需要其中4个基因vioA、vioB、vioC和vioE的参与，而紫色杆菌素合成除了这4个基因外，还需要vioD的参与。考虑到5个基因组成一个转录单元vioABCDE，而且vioD位于vioE之前，我们推测vioD可以在链霉菌中正常转录，我们未检测到紫色杆菌素可能是由于vioD的翻译水平或蛋白稳定性欠佳所致，相关机制解析正在进行之中。
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