西藏位于我国青藏高原西南部，平均海拔高于4 000 m，具有低温、高海拔、紫外照射强烈、地形地貌多样、气候层次丰富等特点，蕴藏着丰富的生物资源，包含多种特有的动植物与独特的微生物库^[1]。对西藏来源的独特的微生物资源进行多样性分析和开发利用，对于实现可持续发展具有重要意义。酵母菌广泛应用于食品和发酵等不同领域，但是目前西藏来源酵母的相关研究报道还较少，已报道的结果多集中于发酵食品、植物及土壤等来源酵母^[1–4]。

松萝是藻类和真菌共生的复合体，属于枝状地衣，常生于深山的老树枝干或高山岩石上，是有着悠久药用历史的药材^[5]。松萝内含有多种天然活性成分，具有杀菌、抗肿瘤等多重药用价值^[5–6]。近年有研究指出，包括松萝在内的地衣除构成其本体的藻类与真菌外，同样可形成复杂的生态系统，为细菌、内生真菌、外生真菌提供生存环境^[7–8]。对松萝的内生菌的分离与挖掘，有利于加深对松萝这一特殊生态系统的了解，获得更多具有特色的酵母菌，进一步确定内生菌的环境胁迫耐受性响应与调控机制，并最终用于构建综合耐受性优良的工业菌株。目前，松萝和其他地衣来源内生酵母的研究还相对有限。本课题组在国内外首次鉴定了松萝内部分离的耐低温产油酵母Curvibasidium属菌种^[9]，另外，近期本团队还利用扩增子测序对西藏不同地点采集的松萝内部细菌和真菌微生物组进行了分析，发现了一些真菌在多样性方面具有很强的新颖性^[10]。此外，我国学者还在内蒙古地衣内部发现可产油的黑酵母^[11]，国外学者对不同地衣内部的酵母多样性也进行了分析^[12]，探究了地衣来源酵母生产水解酶的应用可能性^[13]。这些研究都提示，松萝和其他地衣来源的酵母可能具有丰富的多样性和较好的应用潜力。

有机羧酸包括乳酸、丁二酸和苹果酸等，广泛应用于食品、化工和饲料等不同领域，生物发酵法生产有机酸近年来引起了持续的关注。酿酒酵母和非常规酵母可用于生物法生产有机酸^[14]，但是对不同天然酵母菌株产酸和耐酸潜能的研究还比较有限，西藏来源酵母也未发现有产有机酸相关的研究。

本文从西藏松萝样品中分离获得一株内生酿酒酵母菌株2-2，对其产酸以及酸性耐受性进行了验证，并对该菌株可能的耐酸相关的关键基因在转录水平进行分析。本文的研究结果丰富了松萝内生酵母应用相关的信息，也为进一步开发利用天然酵母菌株提供了参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

本文使用的酵母菌株和来源见表 1。本研究所用松萝酵母采用文献[11]的方法对松萝严格表面消毒后从松萝内部分离获得。所用实验室模式菌株S288C为本实验室菌种库保藏菌种。

1.1.2 培养基

普通YPD培养基：酵母浸出粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，自然pH值，固体培养基灭菌前额外加入琼脂粉2%；高糖YPD液体培养基中葡萄糖浓度修改为10%；酸性胁迫液体培养基使用稀盐酸调pH至2.5，使用瓶塞密封。

以上培养基均在高压蒸汽锅121 ℃灭菌20 min后使用。

1.2 菌株产酸发酵

对菌种进行2次活化后，将其接种于装有50 mL液体YPD培养基的250 mL锥形瓶中，于30 ℃、200 r/min条件下培养12 h。在50 mL离心管5 mL YPD培养液中接种种子液，于30 ℃、200 r/min条件下培养24 h与48 h后取样5 mL，将取样液体离心后取上清进行pH检测。

1.3 菌株胁迫耐性检测

对菌种进行2次活化后，制备种子液。以OD₆₀₀值为0.1的接种量接种于装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，每个菌株接种6瓶，3瓶为自然pH的普通液体YPD培养基，3瓶为酸性胁迫液体培养基。30 ℃、200 r/min条件下培养并于合适时间点进行取样，并用分光光度计检测该时间点培养基的OD₆₀₀值。

1.4 基因组测序

将松萝酵母2-2与实验室模式菌株S288C进行2次平板划线分离纯化后，使用液体进行2次活化，将活化后菌株以OD₆₀₀值为0.1的接种量接种于装有50 mL液体YPD培养基的250 mL锥形瓶中，于30 ℃、200 r/min条件下培养5–6 h。取菌液100 mL，在4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌水洗涤沉淀后再次在4 ℃条件下4 000 r/min离心2 min，重复洗涤2次后弃上清，用液氮迅速冷冻，放置于干冰或者–80 ℃冰箱中，委托广州诺禾生物科技有限公司检测。对检测数据进行覆盖度(coverage)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)以及得失位(insertion and deletion，InDel)分析。

在自然pH的液体YPD中发酵获得对数期的菌株2-2和模式酵母培养液50 mL，在4 ℃条件下分2次置于50 mL离心管中使用冷冻离心机4 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌水洗涤沉淀后再次在4 ℃条件下4 000 r/min离心2 min，重复洗涤2次后弃上清，菌体进行转录分析。

在自然pH与酸性pH (2.3)液体YPD中发酵获得对数期的菌株2-2和模式酵母培养液，采用上述步骤进行采样后进行总RNA提取与cDNA文库构建，利用实时荧光定量PCR对PDR15、PDR12、RGD1和SUR1进行基因转录水平检测，参考本课题组前期报道的方法进行^[15]，引物序列见表 2。

2 结果与分析 2.1 西藏松萝酵母产酸发酵结果

由于产酸会导致培养液pH下降，因此通过检测比较不同菌株培养液不同条件和不同时间的pH值初步判断产酸性能的差异，对比结果如图 1所示。从图 1A结果可见，不同菌株在YPD培养基发酵48 h后的pH在4.85–8.46之间，其中松萝酵母2-2发酵液的pH和多株其他菌株比较相对较低(5.36)，优于模式菌株S288C和产酸研究较多的解脂椰氏酵母Yarrowia lipolytica Polf菌株。对产酸潜力相对较好的菌株进一步利用高糖培养基进行比较研究(图 1B)，可以发现，菌株2-2在24 h时发酵液和产酸较多的其他菌株类似pH较低，明显低于空白培养基，pH值下降相对显著；在48 h时pH回升属于相对较少的水平，提示保持了相对稳定的有机酸产物。对发酵液中常见的有机酸进行检测，包括柠檬酸、丁二酸和苹果酸等，发现浓度都比较低，在0.1–0.2 g/L之间(结果未显示)，提示后续还需要进行菌株改造和过程优化，才有可能有应用价值。

2.2 菌株胁迫耐性检测结果

由于松萝酵母2-2来源的特殊性，检测松萝酵母2-2与模式酵母S288C在无胁迫培养基以及pH为2.5的酸性胁迫培养基中生长情况，结果如图 2所示，松萝酵母在无胁迫培养基中生长情况与模式酵母S288C相近，但在酸性胁迫培养基中对数期出现更早，生长相对迅速，最终菌液浓度更高，受酸胁迫条件的抑制效应更小，因此其耐酸性相对优于模式酵母S288C。

2.3 菌株组学分析结果 2.3.1 全基因组分析

将松萝酵母2-2测序后的基因组数据与模式酵母S288C进行比对分析。松萝酵母2-2与参考基因组S288c的比对分析结果显示，reads对参考序列基因的平均覆盖度为77，95.4%的reads与参考序列的覆盖度超过20×。菌株2-2与参考序列reads的比对率为98.3%，比对存在mismatch的位点占比对区域的百分比为0.88%。以上结果表明，松萝酵母2-2基因组与参考序列的覆盖度高，同时存在一定特异性。

松萝酵母2-2与参考基因组S288c的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析结果如表 3所示，其中转换SNP的个数为9 510，颠换SNP的个数为17 104，换颠换率为2.89%，杂合SNP的个数为10 926，纯合SNP的个数为55 688，杂合SNP个数占参考序列基因组的比例为0.09%。SNP的总数为66 614。SNP在参考序列基因组上的密度为5.48。纯合SNP个数为杂合SNP个数的5倍，杂合SNP占比极低。

松萝酵母2-2与参考基因组S288c的SNP注释结果显示，位于编码序列(coding sequence，CDS)区域的非同义突变的SNP为14 454个，位于CDS区域的同义突变的SNP为26 899个，位于基因间区的SNP为25 261个，同义突变数量远大于非同义突变。

松萝酵母2-2与参考基因组S288c的InDel注释结果显示，类型为插入(insertion)的InDel的个数为2 788，类型为删除(deletion)的InDel的个数为2 485，杂合InDel的个数为781，纯合InDel的个数为4 492，杂合InDel在参考序列基因组上的个数密度为0.01%，InDel的总数为5 273。

松萝酵母2-2与参考基因组S288c的SNP_InDel基因富集结果显示，位于CDS区域未引起移码的InDel个数为378，位于CDS区域引起移码的InDel个数为198，位于基因间区的InDel个数为4 697，InDel的总数为5 273。位于基因间区的InDel占到了InDel的绝大部分。

2.3.2 酵母菌株关键基因的转录分析结果

鉴于松萝酵母2-2相较于模式酵母S288C更好的酸性胁迫耐受性，使用实时荧光定量PCR分别检测松萝酵母2-2和模式酵母S288C中，PDR15、PDR12、RGD1、SUR1^[16–19]这4个已被验证与酿酒酵母酸性胁迫耐受性相关的蛋白基因在酸性条件下的表达水平变化，结果如表 4所示。

2.3.3 耐酸性相关蛋白SNP分析

对相对于模式酵母S288C转录变化较大、报道影响酿酒酵母菌株耐酸性的部分蛋白进行SNP分析，其SNP突变与蛋白错义突变结果如表 5所示。可以看到，在基因RTC6、HTL1、DDR2^[20–23]中，RTC6存在5个SNP，同时存在错义突变，HTL1和DDR2存在5个SNP，但是为同义突变。而在4个与菌株耐酸性相关的基因中都存在超过或等于6个SNP，有3个基因存在错义突变。其中，结合Alphafold 2的结构预测，SUR1存在4个错义突变，其中有3个错义突变集中在SUR1蛋白一段二级结构α-螺旋中部。

3 讨论与结论

本研究重点关注了从西藏松萝样本中分离得到的一株酿酒酵母2-2，这是国内外第一次报道从松萝中发现内生酿酒酵母菌株，同时，我们在扩增子测序结果中也发现有酿酒酵母^[14]，进一步证明了松萝中的确存在酿酒酵母。本研究分析了松萝酵母2-2基因组序列和模式酿酒酵母S288C的全基因组、SNP与InDel比对结果，证实了该菌株在基因组水平和模式酵母存在很多差别，具有分子多样性，后续可对该菌株进行深入的基因组水平进化分析和性能测试，为充分利用所分离的天然菌株作为宿主提供了基础。对该菌株以及其他菌株在不同葡萄糖培养基中的综合产酸情况进行了比较后发现，松萝酵母2-2具有一定的产酸潜力，尤其是在48 h后pH变化很小，推测有可能是对产生的酸重新吸收比较少。但是，该菌株产已知有机酸的产量很低，有待进一步利用代谢工程和合成生物学技术进行改造和优化^[14]。对该菌株进行基因敲除，发现成功率比模式酵母低很多(未发表资料)，结合基因组分析结果，进一步提示该菌株具有独特的遗传多样性，值得进一步深入研究。

酸性耐受性是酿酒酵母菌株工业应用的一个重要指标，也是酿酒酵母菌株优化的一个重要方向^[24]。本研究中，松萝酵母2-2相对于模式酵母S288C表现出更好的酸性耐受性，并且在pH值为2.5时，仍然能在10 h内快速进入对数期，这揭示了该菌株在生产有机酸时具有特殊优势。经过基因组分析，松萝酵母2-2与模式酵母S288C总体相似度很高，但存在大量的单核苷酸突变，大量的SNP或许是松萝酵母性状特异性的来源。

2-2与模式酵母S288C在酸性条件与无胁迫条件下转录水平的比较，发现在4个稳定发生转录水平变化的耐酸性相关蛋白基因PDR15、PDR12、RGD1、SUR1中，松萝酵母2-2在培养基pH值降低为2.3后转录水平变化方向都与模式酵母S288C相反。根据酿酒酵母基因组数据库(Saccharomyces genome database，SGD)的信息，PDR12为弱酸、低pH下表达量显著提高的酸性响应ABC家族蛋白，在菌株2-2中于酸性胁迫环境下却反而下调。此外，据相关研究记载，PDR12、SUR1这2个蛋白的基因序列在敲除后丙酸的胁迫耐受性会下降，RGD1在敲除后低pH的耐受性会降低^[21–22]。在本研究多次重复实验中，胁迫条件下松萝酵母2-2的PDR12与SUR1基因转录水平却相对下调，RGD1则表达上调不显著。为探究松萝酵母2-2的酸性耐受性与转录水平的特殊变化是否是由基因水平突变造成的，对相关的基因进行SNP分析，发现基因RTC6、PDR12、RGD1和SUR1都发生了错义突变，其中SUR1基因不仅转录变化水平与对照组S288C及此前研究都相反^[25]，还在308‒315这连续8个氨基酸中发生了3个错义突变。推测PDR12和SUR1在低pH胁迫条件下的下调一部分可能是由于这2个蛋白是通过提高酿酒酵母的丙酸化学毒性的抵抗力来提高酵母的丙酸胁迫耐受性，但是没有影响酵母对高浓度H⁺的耐受性，因而在本实验中出现下调。此外，也可能是由于松萝酵母2-2中的错义突变影响了这2个基因在H⁺耐受性调控网络中的功能，从而影响了低pH条件下PDR12和SUR1基因的表达。这些研究结果一定程度地揭示了松萝酵母2-2酸性胁迫耐受性的分子基础，也为后续深入分析松萝酵母2-2的独特性提供了参考。

松萝复合体作为近年来比较受关注的特殊生态系统，其内生真菌多样性和产业应用都具有独特的研究价值。本文对西藏地区松萝样本来源的内生酿酒酵母2-2进行了研究，揭示了其独特的生理特征，初步探索了耐酸的分子机制，但是胁迫耐性比较复杂，深入的作用机理还需要进一步验证与深入探索。未来有可能有更多地衣来源的酵母和其他微生物被开发利用，为促进可持续发展提供基础。

致谢

感谢上海交通大学程海荣老师对产酸酵母筛选的建议，感谢上海交通大学范婷婷和杨雨晴同学对菌株分离和保存的贡献。