解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母(non-conventional yeast)，其遗传背景清楚，是合成生物学常用的真核生物底盘^[1‒2]。由于该菌为食品安全微生物，在食品发酵领域已经得到广泛的应用^[3]，同时也是国际上工业生产赤藓糖醇(erythritol)的常用菌株之一，是我国相关企业生产赤藓糖醇唯一使用的菌株。赤藓糖醇是一种新型甜味剂，因其具有热量低、甜味特性好、非致龋齿性等特殊的生理功效，被认为是蔗糖的优良替代品，应用前景十分广泛，使用赤藓糖醇作为代糖的无糖饮料种类日益增多。赤藓糖醇的合成方法大多采用解脂耶氏酵母发酵高浓度葡萄糖^[4]。但是目前国内外使用的解脂耶氏酵母菌株在发酵过程中会产生大量的泡沫，需要添加消泡剂来抑制泡沫产生。发酵产生泡沫不但会降低发酵罐的有效利用率，而且容易溢罐导致染菌的现象发生，给企业带来损失。为了减少泡沫的形成，就需要向发酵液中添加消泡剂，但使用消泡剂不但会增加成本，而且还会增加产物的分离提取难度，并抑制细胞的生长^[5‒6]。因此，研究开发无泡或者低泡发酵的解脂耶氏酵母新菌株对于提高赤藓糖醇的发酵效率与降低发酵成本具有一定的意义。

微生物发酵产泡是一个复杂的过程，与培养基的种类、菌种的性能、发酵工艺条件都有很大的关系^[7‒8]，其中菌种的性能是关键因素。而决定菌种在发酵过程中是否产泡受多基因控制。微生物在发酵过程中会向发酵液中分泌多种蛋白质、多糖、脂类等物质，当积累到一定程度时可能会导致产生泡沫^[9‒10]。这些物质中有可能其中一种为决定性因素，若破坏该决定性物质的合成途径，即有可能显著减少泡沫或者消除泡沫的产生；或者通过增强宿主合成表面活性剂的能力来消除泡沫。

由于解脂耶氏酵母发酵合成赤藓糖醇的过程中产泡机理尚不明确，因此通过定向阻断促进产泡物质的合成途径或者增强具有消泡功能的表面活性剂的合成途径尚难以实现。本研究通过人工合成的外源DNA随机插入基因组的手段，随机突变基因组，来筛选产泡显著降低或者不产泡的解脂耶氏酵母工程菌株。

1 材料与方法 1.1 实验使用的菌株

本研究使用的菌株为解脂耶氏酵母菌株(Y. lipolytica) CGMCC7326^[11]，该酵母能发酵葡萄糖合成赤藓糖醇，产量达到160 g/L以上。

1.2 基因组随机插入外源DNA获得突变体

由于解脂耶氏酵母的非同源重组在DNA重组中占支配地位，外源DNA可以整合到基因组的任何区域，产生随机多样性的突变^[12‒13]。利用这一特性，我们构建了一段人工DNA序列，其中含有筛选标记潮霉素抗性基因(hph)，采用全基因合成的方法合成(图 1)。

全长DNA合成后，直接用于转化感受态解脂耶氏酵母，转化方法采用醋酸锂热激的方法^[11]。转化后涂布在含潮霉素的YPD平板上(固体YPD培养基成分为：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，琼脂粉15 g/L，121 ℃灭菌20 min)，潮霉素浓度为400 μg/mL。放置于30 ℃培养箱培养3–5 d。然后将转化子转接到含同样浓度潮霉素的YPD平板上，继续培养3–5 d以纯化转化子。

1.3 突变株初步筛选方法

将在潮霉素抗性平板上长出的单菌落逐一转接到2 mL的离心管中，每个2 mL离心管含0.5 mL液体培养基(成分为：200 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，3.5 g/L柠檬酸铵，3 g/L蛋白胨，起始pH 6.0)，放置在离心管架上于30 ℃、800 r/min摇床(TAITEC公司MBR-420FL)振荡培养。对突变株转化子的产泡性能进行初步筛选。将不产泡的突变株再进行250 mL摇瓶试验。

1.4 突变株的摇瓶产泡试验

将初步筛选获得的不产泡的突变株分别接种到含30 mL液体培养基的250 mL摇瓶以及含150 mL液体培养基的2 000 mL的摇瓶中，培养基成分同1.3所述。同时用未突变的野生菌株做对比试验。30 ℃、230 r/min摇床培养2–3 d，观察产泡情况。其中，250 mL摇瓶在旋转式摇床中培养，2 000 mL摇瓶在回往复式摇床中培养。

1.5 50 L发酵罐发酵

将在250 mL摇瓶中不产泡的突变株进一步在50 L发酵罐中进行试验。50 L发酵罐含培养基30 L，培养基成分为：300 g/L葡萄糖，12 g/L酵母浸膏，3.5 g/L柠檬酸铵，3 g/L蛋白胨，起始pH 5.9–6.0。115 ℃灭菌30 min，冷却后接入500 mL突变株摇瓶种子液。搅拌转速450 r/min，通气率为0.6 vvm，发酵温度30 ℃。同时用没有突变的对照菌(Y. lipolytica CGMCC7326)做对比试验。发酵过程中观察产泡情况。

1.6 75 m³发酵罐发酵

构建的工程菌株最终需要进行工业规模化试验，以确定放大后是否仍能保持良好的性能。在50 L发酵罐进行试验后，为了进一步确认在生产发酵罐中是否仍然不能产泡，我们在75 m³的发酵罐中进行了放大试验。同时用对照菌(Y. lipolytica CGMCC7326)做对比试验。

1.6.1 摇瓶一级种子的制备

在1 000 mL的摇瓶中装入100 mL培养基(成分同1.3)，共10个1 000 mL的摇瓶，121 ℃灭菌20 min。冷却后将在50 L发酵罐中不产泡的突变株接入5个1 000 mL的摇瓶中，对照菌接入另外5个1 000 mL的摇瓶中，30 ℃、250 r/min培养20 h。

1.6.2 30 L发酵罐二级种子的制备

将上述5个摇瓶种子液合并于一个摇瓶中(500 mL)，分别接入2台30 L的发酵罐中，一台接不产泡的突变株，另一台接对照菌。30 L发酵罐含20 L培养液(成分同1.3)。培养温度为30 ℃，搅拌转速500 r/min，通气量0.6 vvm，起始pH 6.0，培养15 h。

1.6.3 1 000 L发酵罐三级种子的制备

将上述2台30 L二级发酵罐中的种子液分别接入2台1 000 L的发酵罐中，一台接不产泡的突变株，另一台接对照菌。1 000 L发酵罐含650 L培养液(成分同1.3)。培养温度为30 ℃，搅拌转速300 r/min，通气量0.6 vvm，起始pH 6.0，培养15 h。

1.6.4 7 000 L发酵罐四级种子的制备

将上述2台1 000 L三级发酵罐中的种子液分别接入2台7 000 L的发酵罐中，一台接不产泡的突变株，另一台接对照菌。7 000 L发酵罐含5 000 L培养液(成分同1.3)。培养温度为30 ℃，搅拌转速200 r/min，通气量0.4 vvm，起始pH 6.0，培养20 h。

1.6.5 75 000 L (75 m³)发酵罐五级种子的制备

将上述2台7 000 L四级发酵罐中的种子液分别接入2台75 m³的发酵罐中，一台接不产泡的突变株，另一台接对照菌。75 m³发酵罐含50 000 L培养液(成分同1.5)。培养温度为30 ℃，搅拌转速120 r/min，通气量0.3 vvm，起始pH 6.0，当葡萄糖含量降到1 g/L以下时停止发酵。定时观察发酵罐产泡情况。

1.7 合成赤藓糖醇的性能与表面张力的测定

为了检测突变株合成赤藓糖醇的性能是否受到影响，我们在75 m³发酵罐水平上测定了突变株与对照菌株合成赤藓糖醇的产量。发酵结束后取样10 mL，10 000 r/min离心10 min，取上清，用蒸馏水稀释20倍，进行HPLC测定。所用分析柱为Shodex SP0810糖柱(铅离子结合型)，示差折光检测器RI201 (Shodex)，流速1 mL/min，流动相为超纯水，进样40 μL，柱温70 ℃，浙大N2000色谱工作站。表面张力测定仪为上海衡平BZY-1全自动表面/界面张力仪，采用铂金环法，按照产品说明书操作。

1.8 培养液的乳化性能比较

在2个2 L的摇瓶中分别装入300毫升灭菌处理的YPD液体培养基(含300 g/L葡萄糖)，分别接入YALI-nfm突变株与对比菌株，30 ℃、220 r/min培养72 h，离心去除细胞，得到澄清培养液。分别取5 mL澄清培养液于洁净试管中，加入500 μL十六烷(hexadecane)，于振荡器上剧烈振荡30 s，静置5‒10 min，观察其乳化性能。

2 结果与分析 2.1 基因组突变株的获得

采用材料与方法中人工设计合成的DNA片段转化解脂耶氏酵母(Y. lipolytica) CGMCC7326^[11]，在潮霉素抗性平板上获得约300余个单菌落。将在抗性平板上长出的单菌落再转接到新鲜的抗性平板上进行纯化。随机挑取24个转化子提取基因组，通过PCR检测其中的潮霉素抗性基因，结果显示均能扩出特异的潮霉素抗性基因片段，说明在抗性平板上长出的转化子含有潮霉素抗性基因。再随机选取50个抗性转化子在2 mL离心管中进行产泡培养试验的初步筛选。

2.2 发酵过程中产泡沫性能比较

为了检测上述获得的转化子中是否含有产泡性能降低的菌株，我们首先在2 mL离心管中进行了产泡培养试验。根据产泡液面(forming phase)的高低不同，可以将突变株的产泡性能分为3类。第一类产泡液面在3‒5 mm，第二类产泡液面在2‒3 mm，第三类产泡液面在2 mm以内。研究结果表明，95%的转化子的产泡性能与对照菌株(Y. lipolytica CGMCC7326)基本一致，产泡液面在3‒5 mm，即产泡顶端距离液面3‒5 mm。图 2A显示其中3种突变株(1‒3)与对照菌株(4)在2 mL离心管中的产泡性能。由图可以看出，2号突变株基本没有泡沫产生，将该突变菌株重新命名为YALI-nfm (non-foaming，nfm)。

由于上述YALI-nfm突变株的产泡性能显著降低，因此选取该菌株进行摇瓶验证试验。分别在250 mL与2 000 mL的摇瓶中对上述YALI-nfm突变株与对照菌株的产泡性能进行了比较，结果如图 2B‒2E所示。在250 mL摇瓶中YALI-nfm突变株经过40 h的培养，没有产生泡沫(图 2B)，而对照菌株产生较多泡沫(图 2C)；在2 000 mL摇瓶中，YALI-nfm突变株在往复式摇床培养40 h只产生少量泡沫(图 2D)，而对照菌株则产生大量泡沫(图 2E)。

2.3 在发酵罐中产泡性能的比较

在50 L发酵罐中对上述YALI-nfm突变株与对照菌进行发酵产泡性能的比较，发现经过40 h发酵培养YALI-nfm突变株产泡性能显著降低(图 3A)，而对照菌株产泡很多并达到发酵罐上部(图 3B)。说明YALI-nfm突变株产泡性能的降低可能是因为外源DNA插入到基因组中，使得其产泡途径被抑制，或者是外源DNA的插入增强了具有消泡功能的表面活性剂的合成能力。

由于获得的工程菌株最终要在工业规模的发酵罐上进行放大试验，因此很有必要在75 m³体积容量的发酵罐上进行放大试验，验证获得的突变株是否仍然保持低产泡性能，结果如图 3所示。由图 3可以看出，发酵到60 h时YALI-nfm突变菌株泡沫并未触碰到罐顶，透过视镜观察发酵罐内部，其泡沫液位仍然很低，距离发酵罐顶部约有2 m距离(图 3C、3D)；而对照菌株在45 h时即产生大量的泡沫，泡沫液位已经触碰到发酵罐视镜(图 3E、3F)。

2.4 YALI-nfm突变菌株与对照菌株合成赤藓糖醇性能的比较

低泡沫发酵在赤藓糖醇发酵技术上是一项改进，但是不能影响产物赤藓糖醇的合成。为了验证YALI-nfm突变菌株合成赤藓糖醇的性能是否有显著的改变，在75 m³发酵罐进行了3批发酵试验，并测定了放罐时发酵液的赤藓糖醇含量。测定结果显示，以(310±15) g/L一水葡萄糖为碳源，经过78‒85 h的发酵，赤藓糖醇的产量均在(190±5) g/L，对比菌株与突变菌株二者在赤藓糖醇的合成性能上无显著差异。

2.5 葡萄糖浓度与培养时间对YALI-nfm突变株产泡性能的影响

以上消泡性能的研究均在高浓度葡萄糖(300 g/L无水葡萄糖，对应330 g/L一水葡萄糖，以下均对应无水葡萄糖浓度)的条件下进行培养，为了研究消泡性能的高低是否与培养基中葡萄糖浓度以及培养时间具有一定的关系，在含不同浓度葡萄糖的培养基中培养YALI-nfm突变株(30 ℃、220 r/min)，观察其在不同时间产泡与消泡的情况，结果如图 4所示。在葡萄糖浓度为100 g/L的条件下分别培养24 h (图 4，A-1)、48 h (图 4，A-2)与72 h (图 4，A-3)，均产生大量的泡沫。在葡萄糖浓度为200 g/L的条件下分别培养24 h (图 4，B-1)、48 h (图 4，B-2)与72 h (图 4，B-3)，发现在24 h时泡沫很多，到48 h时泡沫明显减少，其中有一摇瓶中的泡沫已经消失(B-2中左边摇瓶)，到72 h时泡沫均消失(B-3)。在葡萄糖浓度为300 g/L的条件下分别培养24 h (图 4，C-1)、48 h (图 4，C-2)与72 h (图 4，C-3)，均未见泡沫产生，而对照菌株在300 g/L葡萄糖条件下培养24 h (图 4，D-1)、48 h (图 4，D-2)与72 h (图 4，D-3)，均有大量的泡沫产生。

以上结果表明，YALI-nfm突变株的消泡性能与葡萄糖的浓度以及培养时间均有密切的关系，高浓度葡萄糖培养条件下的消泡性能明显高于低浓度葡萄糖培养条件下的消泡性能。在300 g/L葡萄糖的浓度下，整个培养过程未见有泡沫产生(图 4，C-1‒C-3)。在200 g/L葡萄糖的浓度下，随着培养时间的增加，消泡性能逐渐增强，到72 h时泡沫完全消失(图 4，B-1‒B-3)。而在低浓度葡萄糖条件下(如100 g/L)泡沫始终不能消失(图 4，A-1‒A-3)。说明YALI-nfm突变株的消泡性能受葡萄糖浓度的调控。

2.6 发酵培养液的十六烷乳化试验

为了研究YALI-nfm突变株消泡性能的获得是否是其向培养基中分泌了具有消泡能力的物质(如表面活性剂)，将在300 g/L葡萄糖浓度条件下培养72 h的YALI-nfm突变株的培养液(图 4，C-3)与对照菌株的培养液(图 4，D-3)分别离心去除细胞，得到澄清培养液。分别取5 mL澄清培养液于洁净试管中，加入500 μL十六烷(hexadecane)，剧烈振荡30 s，静置5−10 min，观察其乳化性能。若培养液中含有较多的表面活性剂，则能将十六烷进行乳化成为浑浊的悬浮液，均匀悬浮于培养液中。若培养液中不含表面活性剂，十六烷不能被乳化，会分层并上浮于培养液的上层，下层水相会逐渐恢复为澄清透明。

对比菌株上清与YALI-nfm突变株培养上清离心去除细胞后，对比菌株上清清澈透明(图 5，A-1)，而突变株上清呈现明显的乳清状(图 5，B-1)。当加入十六烷后，十六烷位于培养液上层(图 5，A-2和B-2黄色箭头所示)。剧烈振荡30 s后再静置5 min，对比菌株已经可见明显的分层，十六烷位于上层(图 5，A-3红色箭头所示)，而YALI-nfm突变株原本乳清状的培养液变为浑浊的悬浮液，十六烷没有分层(图 5，B-3)。当静置10 min时，YALI-nfm突变株的培养液仍为浑浊的悬浮液(图 5，B-4)，而对比菌株的培养液较5 min时更清澈透明(图 5，A-4)。

由上述乳化试验结果可知，YALI-nfm突变株在高浓度葡萄糖的培养条件下具有消泡的特性，可能是由于其向培养液中分泌了具有乳化作用的表面活性剂产生的，该表面活性剂可能降低液面表面张力，从而具有消泡功能。进一步测定了对比菌株与YALI-nfm突变株在300 g/L葡萄糖培养条件下培养液的液面表面张力。测定结果表明，对比菌株培养液的液面表面张力为68.3 mN/m，而YALI-nfm突变株培养液的表面张力为41.6 mN/m。突变菌株的表面张力显著降低，泡沫更容易破裂，从而能产生较为显著的消泡功能。

综合上述结果可知，YALI-nfm突变株获得发酵消泡的能力可能是其产生了具有降低表面张力的表面活性剂，而且该表面活性剂的产生可能受高浓度葡萄糖的诱导。在相对较低浓度的葡萄糖培养条件下(如200 g/L)，随着培养时间的增加，其亦可能分泌降低表面张力的表面活性剂，从而达到消泡的目的。但是在更低浓度葡萄糖的培养条件下(如100 g/L)，即使随着培养时间的延长，也不能产生具有消泡作用的表面活性剂。

3 讨论与结论

发酵产泡是微生物发酵领域普遍遇到的共性问题，贯穿发酵的全部过程，如前期发酵过程、菌液分离过程和产品分离提取过程。发酵产泡降低了发酵罐的有效使用体积，增加了发酵成本。因此如何尽最大可能降低产泡是发酵领域迫切需要解决的问题。微生物发酵产泡的因素主要有以下几种^[8‒14]：(1) 发酵过程中向培养基分泌蛋白，这些蛋白由于具有两性结构可以作为表面活性剂吸附在界面上，并形成强的分子间相互作用对泡沫起到稳定作用，从而使产生泡沫不易破裂。(2) 发酵过程中产生多糖类化合物，使溶液黏度增加，增加液面表面张力，稳定气泡。(3) 通气率，随着通气率增加，产泡会更严重。(4) 发酵温度，发酵温度越高，溶液的黏度越低，表面张力越小，泡沫越容易破裂。但是解脂耶氏酵母是温度敏感性微生物，一般耐受温度为33 ℃^[15]。(5) 培养基的组成，含有机氮越多越容易起泡。通过控制上述因素能够有效地降低泡沫的产生。

由于解脂耶氏酵母具有多种蛋白分泌途径，能向胞外分泌多种蛋白^[16‒17]，同时该酵母也是严格的好氧微生物，需要维持充足的通气才能良好地合成赤藓糖醇^[18]，从而在发酵过程中产生大量的泡沫(图 2E；图 3B，3E)。虽然通过控制通气率、发酵温度以及培养基组成能降低泡沫的形成，但是这些因素并不是解脂耶氏酵母发酵产泡的关键因素。工业上利用解脂耶氏酵母发酵合成赤藓糖醇，发酵产泡一般是从对数生长期开始(约40 h)，此时细胞开始向胞外分泌多种蛋白以及其他大分子化合物^[17]。为了防止从排气管溢料，需要添加消泡剂才能抑制泡沫的形成。因此，通过改良菌株的基因组，阻断促进产泡的化合物的合成途径，或者促进具有降低表面张力作用的表面活性剂的合成，可能是抑制其产泡的关键因素。而解脂耶氏酵母分泌到胞外的大分子化合物种类仍未能全部了解，因此通过定向改组基因组消除泡沫的产生，目前较难实现，而通过外源DNA片段随机插入基因组中造成随机突变再筛选的方法仍然是一种可行的方法。

因此，本研究首先通过体外合成一段带潮霉素筛选标记的DNA，并随机插入到基因组中，以获得多种突变株，然后对其进行定向筛选，获得一株产泡性能显著降低的突变株。经过摇瓶、50 L发酵罐和75 m³生产发酵罐的试验，初步证明该突变株产泡性能显著降低，并且合成赤藓糖醇的产量并没有显著变化。由于该突变菌株基因组含有抗性潮霉素标记，通过基因编辑技术将该抗性标记去除后该菌株即具备工业规模化发酵合成赤藓糖醇的使用潜力。通过十六烷乳化试验，初步证明该突变株不产泡的原因可能为该菌株能在高浓度葡萄糖存在的条件下产生能降低表面张力的表面活性剂，表面张力由对比菌株的68.3 mN/m降低到41.6 mN/m。表面张力的降低使得泡沫不稳定，从而容易破裂，达到消泡的效果。

解脂耶氏酵母能够利用脂类化合物为唯一碳源，并分泌表面活性剂(biosurfactant)或者乳化剂(bioemulsifier)以分散油脂，便于分解吸收利用^[19]。解脂耶氏酵母能合成多种不同种类的表面活性剂或乳化剂。Cirigliano等研究了不同的碳氢化合物如十六烷、石蜡油、大豆油、橄榄油以及玉米油对解脂耶氏酵母合成生物表面活性剂的影响，认为十六烷对提高合成生物表面活性剂的产量效果最显著^[20]。随着研究的深入，还发现解脂耶氏酵母能够在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中合成多种生物乳化剂或者生物表面活性剂，其化学成分主要包含蛋白、脂类以及碳水化合物，不同种类的表面活性剂其蛋白、脂类与碳水化合物的组成比例不同^[21‒23]。虽然上述文献报道了解脂耶氏酵母能够合成多种表面活性剂或者乳化剂，但未见有将产生的表面活性剂与发酵消泡相结合的报道。本研究获得的突变株可能能够在高浓度葡萄糖的条件下产生某种表面活性剂，降低液面表面张力，抑制发酵过程中泡沫的产生。外源DNA的插入可能使某个基因失活或者表面活性剂合成基因的调控区域发生改变，从而使得合成具有消泡作用的表面活性剂的能力增强，该表面活性剂的组成成分以及合成的机制本实验室正在研究中。