
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会
文章信息
- 林晓帆, 张诺, 王辉, 王美星, 蒋思婧, 贺妮莎, 张桂敏. 2022
- LIN Xiaofan, ZHANG Nuo, WANG Hui, WANG Meixing, JIANG Sijing, HE Nisha, ZHANG Guimin.
- 一种来源于Phialophora attae的玉米赤霉烯酮内酯水解酶ZHD11F的酶学表征和结构特点
- Enzymatic and structural characterization of a zearalenone lactone hydrolase ZHD11F from Phialophora attae
- 微生物学报, 62(11): 4202-4212
- Acta Microbiologica Sinica, 62(11): 4202-4212
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文章历史
- 收稿日期:2022-03-31
- 修回日期:2022-04-22
- 网络出版日期:2022-06-19
2. 北京化工大学生命科学与技术学院, 北京 100029
2. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一种由镰刀菌产生的雌激素类真菌毒素,常见于谷物作物中,是广泛传播的霉菌毒素之一[1]。据联合国粮食及农业组织调查发现,世界上受ZEN污染的谷物占谷物总产量的25%。受ZEN感染的作物被牲畜食用后,ZEN会累积在动物的不同生殖器官或组织中[2],进而竞争性地和动物的雌激素受体结合,导致动物的生殖系统内激素紊乱,进一步影响动物的生殖发育系统[1]。
ZEN的脱毒过程包括依赖物理、化学或生物等方面的手段来削弱或消除其毒性。物理方法包括吸附剂吸附、洗涤、高温加热等方式,虽然可以去除一定量的ZEN,但是存在成本高且效果差等缺点。化学方法包括使用强酸、强碱、强氧化剂、还原剂或氯化剂等来破坏ZEN的化学结构,进而去除其毒性;然而,化学物质的使用会导致饲料营养特性的变化,且存在食品安全方面的问题。而生物降解法,通过微生物细胞吸附或者酶降解法降解ZEN,将ZEN转化为无毒产物,这种方法相对于物理化学方法来说更安全、高效、经济、环保,且不会破坏谷物中的营养物质,逐渐成为ZEN脱毒的重要研究方向[3–5]。据文献报道,ZEN内酯水解酶可以水解ZEN中的内酯键,得到无雌激素毒性的产物。因此,挖掘具有优良性质的ZEN内酯水解酶的工作在持续进行。2002年,Takahashi- Ando等从Clonostachys rosea IFO 7063中鉴定出一个ZEN降解酶的编码基因,命名为zhd101[6]。2014年,Peng等解析了ZHD第1个内酯水解酶ZHD101的结构[7]。2017年,Hui等发现并解析了ZEN内酯水解酶CbZHD的结构,并对该酶进行了表征[8]。2018年,Wang等从Rhinocladiella mackenziei中获取了一个与zhd101同源性为65%的ZEN降解酶编码基因,命名为zhd518,并对ZHD518进行了酶学表征[9]。同年,Zheng等解析了RmZHD(ZHD518)的结构[10]。2020年,Yu等从Phialophora americana中获取了一个ZEN内酯水解酶ZHD607,并在毕赤酵母中进行了异源表达[11]。同年,Zhang等从Gliocladium roseum MA918中鉴定出1个ZEN内酯水解酶ZENG,在大肠杆菌中进行异源表达[12]。2022年,Jiang等从Fonsecaea monophora获取了一个ZEN内酯水解酶ZHD11B,并在大肠杆菌中成功进行异源表达和酶学表征[13]。
目前主要鉴定并研究了6个ZEN内酯水解酶(zearalenone lactone hydrolase,ZHD):ZHD101[6]、CbZHD[8]、ZHD518 (RmZHD)[9]、ZHD607[11]、ZENG[12]、ZHD11B[13],其中前3个已经被解析出晶体结构。ZHD属于α/β-水解酶家族,在结构上具有高度相似的特点:包含一个帽子结构域和一个核心结构域。底物ZEN结合在一个位于核心和帽子结构域之间的深口袋中,毗邻催化三联体Ser-His-Glu[7]。ZHD家族可以裂解ZEN的酯键,使其在失去CO2的同时产生一个具有开放侧链的二羟基苯基衍生物。而对ZHD家族的ZEN内酯水解酶的相关报道较少,通过基因挖掘或者蛋白质定向进化等手段来获取更多ZEN降解的候选酶资源,有助于推进ZEN降解酶的研究。
真菌是一个重要的酶资源库,目前已报道的ZEN内酯水解酶均来源于真菌,本研究在调研过程中发现了1个Phialophora attae来源的基因与ZHD518具有较高同源性,且目前很少有关于这个真菌来源的酶的鉴定与表征,因此,选取这个基因进行研究。本研究从Phialophora attae筛选了1个潜在的ZEN内酯水解酶基因zhd11f,并在大肠杆菌BL21(DE3)内得到可溶性表达,对重组ZHD11F的酶学性质、耐冷机制以及热稳定性进行了探索,为研究此类酶的耐冷机制、广温度范围等提供了研究方向,同时拓展了Phialophora attae来源的酶的功能研究。
1 材料与方法 1.1 菌株和试剂Escherichia coli DH5α克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株购自Transgene公司。BamH Ⅰ/Xho Ⅰ等限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均购自TaKaRa公司(大连)。PCR产物纯化和胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和蛋白Marker购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。Bradford蛋白浓度试剂盒购自于Omega Bio-Tek公司。Ni-NTA蛋白纯化树脂、GE HiTrap Desalting柱购自GE Healthcar公司。ZEN购自于Sigma-Aldrich公司。乙腈购于弗顿生化科技有限公司。
1.2 引物ZEN内酯水解酶基因zhd11f (GenBank ID:XM_018142292.1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。同时设计并合成了用于扩增zhd11f基因的引物ZHD11F-F与ZHD11F-R(表 1)。
Primers | Sequences (5ʹ→3ʹ) |
ZHD11F-F | GAATTCATGACCCTGACCAGAATCAGAG |
ZHD11F-R | TCGAGTCACTCGAGAACGTACTTCCTAGTG |
H245A-F | GGTGCTTTCCCATACGTTACTCACCC |
H245A-R | GGGAAAGCACCACCTGGCAACAAGG |
本文中的突变体ZHD11F (H245A)被用来探究ZHD11F的活性位点(表 1)。本研究使用含有突变位点的引物通过PCR对整个环形质粒pET28a-zhd11f进行扩增。回收的线性产物经Dpn I处理后转入大肠杆菌DH5α中完成突变。最后将突变体在BL21(DE3)中诱导、表达和纯化,进行后续酶学研究。
1.3 序列分析、同源性建模和分子动力学模拟蛋白质序列相似性通过在NCBI中进行BLAST分析得到。多序列比对由Clustal X和ESPript[14]得到,信号肽使用SignalP4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行预测。ZHD11F结构通过I-TASSER Suite (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)进行模拟[15]。ZHD11F蛋白结构和重叠采用软件Discovery Studio 2021进行可视化。
ZHD11F和ZHD518的分子动力学模拟在YASARA (http://www.yasara.org)中进行。该模拟系统放置在一个pH 8.0的周期性六面体里,在AMBER 14力场下,首先进行加氢反应和能量最小化,接着系统温度逐渐从0升温到308±0.5 K,并保持稳定。最后,完成一个时长为20 ns的分子动力学模拟,且每100 ps保存一张快照。
1.4 重组表达质粒构建将扩增得到的zhd11f片段用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ进行双酶切,同时BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切线性化处理表达载体pET28a。经DNA连接酶得到的连接混合物转化进入DH5α,涂布于含有卡那霉素(终浓度为50 µg/mL)的LB固体平板上。挑取阳性转化子,分别使用菌落PCR和BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切检验重组质粒,将初步验证正确的质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序正确的重组质粒命名为pET28a-zhd11f。
1.5 重组ZHD11F的表达和纯化将重组质粒pET28a-zhd11f转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。使用含有50 µg/mL卡那霉素的LB培养基,在37 ℃、220 r/min的摇床里培养至OD600≈0.6时,添加终浓度为0.1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导ZHD11F的表达,并在18 ℃、220 r/min的摇床中培养18 h,3 800 r/min离心10 min收集菌体。将菌体重悬于20 mL破碎缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 8.0)中,经超声破碎、离心和用0.22 μm滤膜过滤上清后开始纯化。使用Ni-NTA (His•Bind Kit,Novagen)层析柱对ZHD11F进行纯化,结合在层析柱上的目的蛋白,在经10 mL洗杂缓冲液Ⅰ (50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,pH 8.0)和10 mL洗杂缓冲液Ⅱ (50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,30 mmol/L咪唑,pH 8.0)清洗非特异性结合蛋白后,经过洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,300 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脱5次后收集目的蛋白(每次洗脱1 mL)。最后,经PD-10脱盐柱(GE)除去咪唑后,使用12% SDS-PAGE分析各相蛋白大小及纯度,使用Bradford法以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作为标准品检测蛋白浓度。
1.6 ZEN内酯水解酶ZHD11F酶活测定总体积为500 µL的酶反应体系,由20 µL的底物ZEN (1 mg/mL ZEN溶在色谱级甲醇)、30 µL的稀释酶液和450 µL的缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)组成。在特定温度下反应10 min后添加500 µL的色谱级甲醇终止反应。反应后的样品经过滤以后由高效液相色谱(HPLC)测定底物ZEN的残余量。HPLC检测条件为:Agilent Carbohydrate column (5 µm,4.6×150 mm)色谱柱,流速1 mL/min,流动相为60%乙腈和40%水相等度洗脱,上样体积为20 µL,总时长6 min。
底物降解量等于底物总量减去底物剩余量。ZEN降解酶的酶活单位(U)定义为:每分钟降解1 µg底物所用的酶量为一个酶活单位。玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定标准选用湖北省地方标准DB42/T 1630–2021。
1.7 温度对酶活和稳定性的影响ZHD11F的酶活测定是在50 mmol/L的Tris-HCI (pH 8.0)缓冲液中进行,在10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃条件下分别反应10 min,来测定ZHD11F的最适反应温度。ZHD11F的热稳定性测定是将ZHD11F分别在35、37、40 ℃分别孵育不同时间:5、10、15、20 min,在35 ℃和pH 8.0条件下测定ZHD11F的残余活性。
1.8 pH对酶活和稳定性的影响pH对酶活的影响是在不同pH的50 mmol/L缓冲液中测定的:Na2HPO4-citric acid (50 mmol/L, pH 4.0–8.0), Tris-HCl (50 mmol/L, pH 7.0–9.0), glycine-NaOH (50 mmol/L, pH 9.0–10.0),pH间隔为0.5。pH稳定性的测试方法是:首先将ZHD11F置于上述缓冲液中,于4 ℃条件下孵育16 h,然后在35 ℃和pH 8.0下测试残余活性。
1.9 金属离子对酶活的影响在35 ℃、pH 8.0的条件下,测定了不同金属离子和EDTA对ZHD11F酶活的影响。各成分的添加量均为5 mmol/L。以不添加任何金属离子的酶活设定为100%。
2 结果与分析 2.1 ZHD11F的生物信息学分析本研究以已报道的zhd101 (GenBank ID:AB076037.1)、zhd518 (GenBank ID:XM_013418296.1)基因为参考基因,通过在NCBI数据库中序列比对,得到来源于Phialophora attae的未知功能蛋白(GenBank ID:XM_018142292.1)基因zhd11f进行后续研究,其中ZHD11F与ZHD518的氨基酸序列同源性为59%,与ZHD101的氨基酸序列同源性为52%。分析显示,zhd11f的基因总长为804 bp,其编码267个氨基酸且没有信号肽,其分子质量和蛋白质等电点(pI)分别为29.8 kDa和5.6。
通过多序列比对分析(图 1)预测ZHD11F的保守区域和催化三联体。结果表明ZHD11F中存在假定的催化三联体,即Ser105-Glu128- His245,进而推测ZHD11F是潜在的ZEN内酯水解酶。
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图 1 ZHD11F与ZHD518、ZHD101的序列比对 Figure 1 Sequence alignment of ZHD11F, ZHD518 and ZHD101. The predicted catalytic residues of ZHD11F (S105-E128-H245) were shown by a hollow triangle. |
2.2 ZHD11F的表达纯化
为了分析ZHD11F蛋白的功能,构建了ZHD11F的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-zhd11f表达菌株,其N端含有6个组氨酸标签。对表达菌株进行诱导表达及蛋白纯化。将破菌后的细胞提取物与Ni-NTA树脂结合,用含有不同浓度梯度咪唑的缓冲液进行洗杂与洗脱,纯化后的蛋白用GE HiTrap脱盐柱脱盐。SDS-PAGE分析显示,ZHD11F以可溶性形式表达,且纯化后的ZHD11F以单带形式迁移,分子大小为35 kDa左右(图 2)。
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图 2 重组蛋白ZHD11F纯化结果 Figure 2 Purification of recombinant ZHD11F. 12% SDS-PAGE analysis of ZHD11F purified from induced E. coli cells. Lane M: molecular weight maker, from top to bottom in turn are 180, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 kDa; lane 1: supernatant of induced ZHD11F; lane 2: eluent ZHD11F with 300 mmol/L imidazole; lane 3: imidazole free ZHD11F after desalinization. |
2.3 ZHD11F酶学性质的表征 2.3.1 温度对ZHD11F酶活及稳定性的影响
在10–55 ℃范围内,按照方法1.7测定ZHD11F对ZEN的活性,研究结果发现,在35–40 ℃之间ZHD11F对ZEN的降解效率最高(图 3A),在20–45 ℃之间能保持最高活性的40%以上,且ZHD11F在10 ℃仍能保持20%的相对活性,但当反应温度高于40 ℃时活性迅速下降。ZHD11F的热稳定性分析表明,ZHD11F在35 ℃孵育20 min可以保持原有活性不变,37 ℃孵育20 min可以保持最高活性的40%以上,但在40 ℃孵育20 min失去了75%以上的活性(图 3B)。结果说明ZHD11F是一种低温酶,在35 ℃以下具有较好的热稳定性。
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图 3 温度对ZHD11F酶活及稳定性的影响 Figure 3 Effects of temperature on the activity and stability of ZHD11F. A: effects of temperature on the activity of ZHD11F. To determine the optimum temperature of ZHD11F, the reactions were conducted from 10 ℃ to 50 ℃ in 50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 8.0). Maximum activity was set as 100%. B: effects of temperature on the stability of ZHD11F. The ZHD11F in 50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 8.0) was preincubated at 35 ℃, 37 ℃ and 40 ℃ for 20 min, respectively, sampling every 5 min, followed by residual activity determination at pH 8.0 and 35 ℃. The original activity was set as 100%. Each value of the assay was the arithmetic mean of triplicate measurements. |
2.3.2 pH对ZHD11F酶活及稳定性的影响
经检测发现,ZHD11F的最适pH为8.0,并且ZHD11F在pH 6.0–9.5的范围内具有超过60%的酶活性(图 4A)。pH稳定性结果显示,ZHD11F在pH 5.5–8.5之间保留了超过50%的残余活性(图 4B)。因此,ZHD11F是一种中性偏碱的ZEN降解酶,能够在广泛pH的范围内保持相对较高的活性。ZHD11F的最适反应温度和pH值分别为35 ℃和8.0,在此条件下对ZEN的比酶活为40.04 U/mg。
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图 4 pH对ZHD11F酶活及稳定性的影响 Figure 4 Effects of pH values on the activity and stability of ZHD11F. A: effects of pH value on the activity of ZHD11F. The reactions were conducted at 35 ℃ with ZEN as substrate in different buffers. B: effects of pH value on the stability of ZHD11F. The stability of ZHD11F was determined from pH 5.0 to pH 9.0 at 4 ℃ for 16 h. After preincubation, the residual activity was measured at 35 ℃ and pH 8.0. Each value of the assay was the arithmetic mean of triplicate measurements. |
2.4 金属离子对ZHD11F活性的影响
测试了不同金属离子对ZHD11F催化活性的影响,结果显示添加K+或Ca2+等并不会影响酶的活性,添加Mg2+在一定程度上能够抑制酶活性,而添加Cu2+之后使得酶只保留10%的活性,添加5 mmol/L的EDTA对酶的活性几乎没有影响(表 2)。
Metal ions (5 mmol/L) | Relative enzyme activity/% |
No addition | 100.00 |
Li+ (LiCl) | 94.88±6.86 |
Na+ (NaCl) | 96.07±6.38 |
Ca2+ (CaCl2) | 87.38±4.49 |
Mg2+ (MgCl2) | 66.64±8.83 |
K+ (KCl) | 91.86±2.96 |
Co2+ (CoCl2) | 100.26±1.88 |
Mn2+ (MnCl2) | 110.37±3.52 |
Cu2+ (CuCl2) | 10.44±1.75 |
EDTA (5 mmol/L) | 81.54±10.88 |
All the reactions were performed at the optimum conditions (35 ℃ and pH 8.0) with ZEN as substrate. The activity of enzyme without any additions was set as 100%. |
2.5 ZHD11F的结构建模及活性位点的测定
本研究以ZEN内酯水解酶ZHD518 (RmZHD,PDB ID:5XO8)的结构为模板,通过网站I-TASSER对ZHD11F的结构进行了模拟。使用Discovery Studio进行三级结构的可视化。ZHD11F的催化三联体Ser105-Glu128- His245与ZHD518 (Ser105-Glu129-His243)是对应的,都位于底物结合口袋中。对2个蛋白中的催化三联体进行标注,明显看到催化三联体之间摆动的角度以及距离均不同(图 5)。将ZHD11F的His245突变为Ala,突变体ZHD11F (H245A) 未检测到酶活性,这一结果表明,His245是ZHD11F的一个重要催化活性位点。
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图 5 ZHD11F与ZHD518催化位点的比较 Figure 5 Comparison between ZHD11F and ZHD518 catalytic sites. Grey stick residues and numbers represented the positions and distances between catalytic residues of ZHD11F (Ser105-Glu128-His245). Black stick residues and numbers represented the positions and distances between catalytic residues of ZHD518 (Ser105-Glu129-His243). |
2.6 ZHD11F耐低温性质及热稳定性分析
Tang等的研究表明,蛋白柔性结构与loop区的增加可能是低温下具有高催化活性的原因之一[16]。将ZHD11F与ZHD518[9]进行结构比对。图 6中显示出,ZHD11F和ZHD518的整体结构上相差不大,但是ZHD11F的loop区明显增加,表明loop区可能是影响ZHD11F耐冷性的因素之一。
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图 6 ZHD11F与ZHD518结构比较 Figure 6 Structure comparison between ZHD11F and ZHD518. The three-dimensional structure of ZHD11F was grey colored, and that of ZHD518 was black colored. The increased loop region in ZHD11F was marked with black circle. |
ZHD11F相比ZHD518[9]的热稳定性显著降低,为了分析热稳定性降低的可能原因,通过分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟比较ZHD11F与ZHD518之间的差异。根据主干原子的均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD),所有酶在10 ns内达到平衡。文献显示整体的RMSD值越低,蛋白质灵活性越低,热稳定性越高[17]。图 7A中显示,ZHD11F的RMSD值低于ZHD518,表明ZHD518的结构更加稳定。接着将轨迹文件转换为RMSF随时间的波动数据以分析ZHD11F的灵活区域(图 7B),RMSF代表每个残基的柔韧性,柔韧性强的氨基酸残基在MD模拟中就会出现较大幅度的波动,相对应的RMSF的值就会很高。图 7B中显示,ZHD11F中的Ala73-Val77与Asp162-Glu167区域比ZHD518的相应位置更灵活,推测Ala73-Val77与Asp162-Glu167区域可能是ZHD11F灵活性增加的因素之一,从而降低了ZHD11F整体的热稳定性。
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图 7 ZHD11F与ZHD518的RMSD值以及RMSF值用于热稳定性分析 Figure 7 The RMSD and RMSF values of ZHD11F and ZHD518 are used for thermal stability analysis. A: RMSD value of ZHD11F and ZHD518 during the 20 ns MD simulation; B: RMSF value of ZHD11F and ZHD518 during the 20 ns MD simulation. |
3 讨论与结论
玉米赤霉烯酮在世界范围内十分常见,是由镰刀菌产生的一种F2霉菌毒素,具有很强的雌激素毒性,广泛存在于谷类食物中[18]。利用生物酶法降解ZEN,将ZEN转化为无毒产物,相对于理化方法来说安全且高效。本研究结合生物信息学与酶学性质分析鉴定了一个Phialophora attae来源ZEN内酯水解酶ZHD11F,ZHD11F是一个全新的ZEN内酯水解酶。
对ZHD11F与其他已报道的ZEN内酯水解酶的酶学性质进行比较分析。第一,ZHD11F的最适反应温度为35 ℃,这与大多数ZEN内酯水解酶相似(35–40 ℃)。有趣的是,ZHD11F在20 ℃时保留了40%的酶活活性,10 ℃保留了20%以上的活性,这是目前尚未报道过的具有耐低温性质的ZEN内酯水解酶。热稳定性分析表明,ZHD11F在35 ℃以下具有较好的热稳定性,明显低于大多数的ZEN内酯水解酶(< 45 ℃)。第二,ZHD11F的最适pH值为8.0,除Clonostachys rosea IFO 7063来源的ZHD101[6]的最适pH为9.0以及Gliocladium roseum MA918来源的ZENG[12]的最适pH值为7.0,其余ZEN内酯水解酶最适pH值均为8.0。ZHD11F相比大多数ZEN内酯水解酶拥有更广泛的pH值范围,ZHD11F在pH 6.0–9.5的范围内保留了超过60%的残余活性,而ZHD518[9]、CbZHD[8]、ZHD607[11]、ZENG[12]和ZHD11B[13]分别在pH 6.0–9.0、pH 6.5–9.0、pH 6.0–8.5、pH 7.0–10.0和pH 6.0–9.5的范围内保留了60%以上的活性。第三,ZHD11F与其他ZEN内酯水解酶一样为非金属依赖酶。
ZHD11F和大部分已经报道过的ZHD家族ZEN内酯水解酶一样,具有较宽的反应温度、pH范围,且在中性条件下对ZEN的降解能力最强。但和其他已报道的ZEN降解酶不同,其具备低温下的活性优势。ZHD11F与已报道的ZEN内酯水解酶同源性最高的是ZHD518,结构分析显示,ZHD11F的loop区相较于ZHD518明显增加。Loop区的增多导致酶结构柔韧性的增加,使得酶的构象更容易发生改变,从而减少低温催化时的活化能,维持低温状态下酶的高活性。因此loop区增多导致蛋白柔性结构的增加可能是影响ZHD11F冷活性的重要因素。当然,不同的低温酶使用不同的策略维持低温下的柔韧性[19]。ZHD11F的热稳定性明显低于ZHD518,分子动力学模拟推测Ala73-Val77与Asp162-Glu167可能是影响ZHD11F的柔性结构的相关氨基酸残基,从而影响ZHD11F的热稳定性。关于ZHD11F冷活性的性质,值得在后续工作中进一步深入探讨和验证。在未来的研究中,可以对ZHD11F结构中的loop区以及整体结构中的柔性结构进行合理改造以用于工业应用。
本研究通过基因挖掘鉴定了1个Phialophora attae来源的低温ZEN内酯水解酶ZHD11F,对ZEN的催化活性为40.04 U/mg,在pH 6.0–9.5的范围内具有超过60%的酶活力。ZHD11F在35 ℃以下具有较好的稳定性,其活性在10 ℃和20 ℃时分别能保持20%和40%。更多的loop区增加结构柔韧性是ZHD11F稳定性较差、在低温活性比较高的主要原因。因此,ZHD11F的低温特性和宽广pH范围使得其可以作为ZEN降解酶机制研究的优秀候选者,同时拓展了Phialophora attae来源酶的功能研究。
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