2022, Vol. 62
表1(Table 1)
一株有色金属矿山1-亚硝基-2-萘酚降解菌的筛选、鉴定和降解特性
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220148
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 李欣媛, 孟行, 姚俊, 李浩, 朱潇哲, 赵陈晨, 刘建丽. 2022
- LI Xinyuan, MENG Hang, YAO Jun, LI Hao, ZHU Xiaozhe, ZHAO Chenchen, Liu Jianli.
- 一株有色金属矿山1-亚硝基-2-萘酚降解菌的筛选、鉴定和降解特性
- Isolation, identification, and degradation characteristics of a 1-nitroso-2-naphthol-degrading strain derived from nonferrous metal (loid) tailings
- 微生物学报, 62(11): 4385-4396
- Acta Microbiologica Sinica, 62(11): 4385-4396
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文章历史
- 收稿日期：2022-03-10
- 修回日期：2022-06-28
- 网络出版日期：2022-07-15
引用本文 |
李欣媛, 孟行, 姚俊, 李浩, 朱潇哲, 赵陈晨, 刘建丽. 一株有色金属矿山1-亚硝基-2-萘酚降解菌的筛选、鉴定和降解特性[J]. 微生物学报, 2022, 62(11): 4385-4396.
Li Xinyuan, Meng Hang, Yao Jun, Li Hao, Zhu Xiaozhe, Zhao Chenchen, Liu Jianli. Isolation, identification, and degradation characteristics of a 1-nitroso-2-naphthol-degrading strain derived from nonferrous metal (loid) tailings[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(11): 4385-4396.
一株有色金属矿山1-亚硝基-2-萘酚降解菌的筛选、鉴定和降解特性
中国地质大学(北京) 水资源与环境学院, 北京 100083
摘要：[目的] 本研究从我国广西河池市周边的典型有色金属尾矿环境中分离出1株高效降解1-亚硝基-2-萘酚的菌株，并分析其降解特性及其潜在的代谢途径，从而探究矿山复合污染生态系统中稠环芳烃类污染物的微生物修复技术的应用前景。[方法] 从有色金属尾矿样本中筛选到以1-亚硝基-2-萘酚为唯一碳源的菌株，经16S rRNA基因序列鉴定，结合气相色谱-质谱联合(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)检测分析菌株对1-亚硝基-2-萘酚的降解特性及中间代谢产物，并推测可能的代谢途径。[结果] 筛选获得1株高效降解1-亚硝基-2-萘酚的Pseudomonas putida CUGB-JL11菌株，经鉴定为革兰氏阴性杆的恶臭假单胞菌。该菌株最适温度为30 ℃左右，最适pH值范围为6−8条件下，菌株5 d内对40 mg/L 1-亚硝基-2-萘酚的降解率高达81%。降解中间代谢产物主要为苯环类物质：苯甲羟肟酸甲酯和苯丙胺，但其母体及大部分中间产物都降解为小分子物质或者被完全降解。[结论] 恶臭假单胞菌P. putida CUGB-JL11具有良好的1-亚硝基-2-萘酚降解能力和较强的环境适应性，有进一步被开发为微生物菌剂以用于稠环芳烃类污染修复的巨大潜力，为有色金属矿山生态系统中重金属和有机选冶药剂复合污染的微生物修复研究提供了理论依据和可利用的微生物资源。
关键词：有色金属选冶渣场 1-亚硝基-2-萘酚降解菌 分子鉴定 气相色谱-质谱(GC-MS)
Isolation, identification, and degradation characteristics of a 1-nitroso-2-naphthol-degrading strain derived from nonferrous metal (loid) tailings
School of Water Resource and Environment Engineering, China University of Geosciences (Beijing), Beijing 100083, China
Abstract: [Objective] To screen an efficient 1-nitroso-2-naphthol-degrading strain from the typical non-ferrous metal tailings in the periphery of Hechi city, Guangxi Zhuang autonomous region in China, analyze the degradation characteristics and potential metabolic pathways, and thereby examine the conditions for the microbial remediation of the mine polluted by compound pollutants including PAHs. [Methods] The strain which used 1-nitroso-2-naphthol as the only carbon source was screened and identified by 16S rRNA gene sequencing. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was employed to analyze degradation characteristics of 1-nitroso-2-naphthol and the intermediate metabolites, and the metabolic pathways were predicted. [Results] An efficient strain was screened out and identified as the Gram-negative Pseudomonas putida CUGB-JL11. Under the optimal conditions of 30 ℃ and pH 6−8, the 5-day degradation rate of 40 mg/L 1-nitroso-2-naphthol by the strain was up to 81%. The main intermediate metabolites were the benzodiazepines methyl N-hydroxybenzenecarboximidoate and amphetamine, but the organic substances and most of the intermediates were degraded into small molecules or completely degraded. [Conclusion] CUGB-JL11 boasts high 1-nitroso-2-naphthol-degrading efficiency and strong environmental adaptability. It has a huge potential for the treatment of PAHs. This study lays a theoretical basis and provides microbial resources for bioremediation of nonferrous metal mine polluted by both heavy metals and flotation reagents.
Keywords:
nonferrous metal(loid) tailings 1-nitroso-2-naphthol-degrading bacterium molecular identification gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)
随着矿山资源的枯竭，贫、杂和细的难选矿的选冶过程主要依赖于大量选矿药剂的投入使用，同时其品种也越来越多。全世界有机选冶药剂的年规模已达千万吨级[1]，这也导致矿山环境中选冶药剂的含量是土壤环境中农药含量的3倍之多[2]。据统计，我国仅赣南地区，每天进入选冶渣场及尾矿库环境中的选矿药剂就达3 380 t[3]。有机选冶药剂的中间代谢产物高达800多种，矿山环境中小环芳烃和大环芳烃的污染问题越来越引起人们的关注[4]。而1-亚硝基-2-萘酚(1-nitroso-2-naphthol)作为有色选矿药剂代表性的新型浮选药剂被大量使用，是一类多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)萘的衍生物，具有致癌、致畸和致突变效应[5–6]。已有研究证实，1-亚硝基-2-萘酚在热活化和光解等过程中，生成了一些不易降解的芳香腈类化合物，如邻萘二酮和邻羟基萘醌等[7]。但该药剂的生物降解和演化是否会形成二次污染物以及二次污染物是否会对环境产生深层次的污染问题，有待于进一步的探究。
稠环芳烃污染物的微生物修复，是利用细菌、真菌等进行降解和转化为低毒性或无毒性化合物，具有安全、经济、高效、无二次污染和不需大型设备等优点[8–10]。随着稠环芳烃微生物修复研究的深入，研究人员从水和土壤等环境中筛选出大量的稠环芳烃高效降解菌，如微黄分支杆菌(Mycobacterium gilvum CP13)和白腐真菌(Phanerochaetc chrysosporium)[10−12]。然而，近年来矿山生态系统中稠环芳烃污染的生物修复研究甚少，多数关注于油砂尾砂[13]。1-亚硝基-2-萘酚作为稠环芳烃类的矿山浮选药剂之一，其微生物修复研究具有广阔的探索前景。
本研究从我国广西河池市周边的典型有色金属尾矿环境中分离出1株高效降解1-亚硝基- 2-萘酚的菌株CUGB-JL11，通过形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列比对等多相分类分析，鉴定该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，并在实验条件下探究了该菌株对1-亚硝基-2-萘酚的降解特性及其中间代谢产物，为污染地提供经济、高效且不产生二次污染的原位修复菌种资源。
1 材料与方法 1.1 材料与培养基 1.1.1 样本采集与处理典型有色金属尾矿样本于2017年6月采集于我国广西壮族自治区河池市南丹县的A尾矿库(24°50′01′′N，107°37′36′′E)表层0−10 cm处。该尾矿库面积为1.4 hm2，根据中国土壤环境监测技术规范(HJ/T 166—2004)采用“十字交叉”布点的方式，布设6个采样点，每个采样点的样品均由3个平行样均匀混合为一个，对应样本标记为T1、T2、T3、T4、T5和T6。每个样品约采集1 000 g左右，且分装为非生物样品(500 g)和生物样品(500 g)。本研究所有采集的生物样品直接装进塑封袋并放置于4 ℃医用保温箱中，于2 d之内运送回中国地质大学(北京)，之后保存于−20 ℃的环境内，用于1-亚硝基-2-萘酚降解菌的富集培养。而非生物样品运回后保存于4 ℃环境内，经24 h风干，过100目(US标准，0.149 mol/L)和200目(US标准，0.075 mol/L)筛，用于环境因子分析，环境因子数据见表 1。
表 1. 样本的基本理化性质
Table 1. Physico-chemical properties of samples
| Physico-chemical properties | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 |
| pH | 5.61±0.03 | 6.90±0.03 | 6.38±0.03 | 6.58±0.03 | 7.33±0.04 | 5.14±0.02 |
| TN | 177.00±0.88 | 287.00±1.44 | 327.00±1.64 | 743.00±3.71 | 357.00±1.79 | 329.00±1.65 |
| TOC | 26 000.00±130.00 | 21 400.00±107.00 | 14 200.00±71.00 | 25 400.00±127.00 | 18 100.00±90.40 | 12 000.00±59.80 |
| TP | 3 650.00±18.30 | 4 650.00±23.30 | 2 340.00±11.70 | 4 720.00±23.60 | 6 880.00±34.40 | 4 290.00±21.40 |
| As | 16 300.00±81.60 | 16 400.00±82.20 | 5 090.00±25.40 | 7 690.00±38.40 | 2 960.00±14.80 | 2 510.00±12.50 |
| Cd | 361.00±1.80 | 201.00±1.01 | 50.40±0.25 | 104.00±0.52 | 51.70±0.26 | 39.70±0.20 |
| Cu | 1 440.00±7.21 | 681.00±3.41 | 140.00±0.70 | 551.00±2.75 | 210.00±1.05 | 114.00±0.57 |
| Cr | 57.00±0.28 | 80.40±0.41 | 57.90±0.29 | 81.50±0.41 | 56.10±0.28 | 56.40±0.28 |
| Fe | 84 600±423 | 83 200±416 | 29 000.00±145.30 | 48 000±240 | 5.00±0.03 | 17 200.00±85.90 |
| Mn | 5 800.00±29.00 | 7 980.00±39.90 | 5 010.00±25.10 | 8 570.00±42.90 | 1 120.00±5.58 | 4 370.00±21.80 |
| Pb | 583.00±2.91 | 545.00±2.72 | 330.00±1.65 | 928.00±4.64 | 622.00±3.11 | 646.00±3.23 |
| Sb | 74.20±0.37 | 131.00±0.66 | 94.40±0.66 | 61.60±0.31 | 179.00±0.90 | 123.00±0.62 |
| Zn | 19 600.00±98.00 | 6 220.00±31.10 | 1 850.00±31.10 | 4 640.00±23.20 | 4 070.00±23.20 | 2 050.00±10.20 |
| Unit for TN, TOC, TP, and concentration of metal(loid)s is mg/kg, except for pH. | ||||||
1.1.2 主要试剂、仪器和培养基
1-亚硝基-2-萘酚(C10H7NO2)，阿法埃莎化学有限公司；胰蛋白胨(tryptone)，安琪酵母股份有限公司；酵母提取物(yeast extract)和氯化钠(NaCl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊二醛固定液(C5H8O2，电镜专用，2.5% H2O，pH 7.2−7.4，麦克林Macklin)；细菌DNA提取试剂盒，Omega Bio-Tek公司；双人垂直净化工作台(SW-CJ-2FD)，苏州智净净化公司；翻转式振荡器，BRE-48常州市国旺仪器制造有限公司；高效液相色谱仪，Agilent Technologies公司。
LB培养基用来预培养富集菌种。筛选培养基为无机盐培养基，培养基配方为：4.0 g Na2HPO4、1.5 g KH2PO4、1.0 g NH4Cl、0.2 g MgSO4‧7H2O、0.02 g CaCl2、0.03 g FeSO4‧7H2O、1.0 g NaNO3、1.0 mL微量元素/L培养基(AML291 1 000×SL-10微量元素溶液，北京酷来搏科技有限公司)。富集过程中，1-亚硝基-2-萘酚浓度由10 mg/L逐渐增加到40 mg/L。固体培养基中再加入15.0 g/L的琼脂。用1.0 mol/L NaOH溶液调节培养基pH至7.50。各培养基均在1×105 Pa下高温湿热灭菌20 min后使用。
1.2 1-亚硝基-2-萘酚降解菌种的分离筛选研究发现，1-亚硝基-2-萘酚作为捕收剂的适宜用量为1 200 mg/kg[6]，其中48.6%的药剂在使用过程中无法回收，随着尾砂排入环境[14]。而我国将近80%的矿山废弃物以尾砂的形式堆存在尾矿库中，残余的浮选药剂主要通过水解、光解、高级氧化降解及生物降解等消减[1, 15]。因此，本研究取100 g尾矿砂放入装有200 mL超纯水的塑料三角瓶中，于翻转振荡器以60 r/min的速度振荡30 min，之后静置30 min。取1 mL上清液于LB液体培养基中用来预培养富集菌种。之后取1 mL预富集菌种于无机盐富集培养基中[其中，加入1-亚硝基-2-萘酚(终浓度为40 mg/L)]，恒温培养箱中28 ℃培养10 d。取1 mL培养液，将上清液按照10−3、10−4、10−5、10−6、10−7、10−8浓度梯度进行稀释，之后涂布于LB固体培养基(1-亚硝基-2-萘酚终浓度为40 mg/L)上，置于恒温培养箱中28 ℃培养5 d。待菌落生长后，将得到的单菌落经3次纯化后，分别接种于以40 mg/L 1-亚硝基-2-萘酚为唯一碳源的LB培养基中，再置于28 ℃、180 r/min摇床中培养5 d。所有纯化的菌株保存于−80 ℃冰箱。共得到纯化的菌株13株。
培养5 d后使用高效液相色谱法测定各菌株对1-亚硝基-2-萘酚的降解率，最终获得1-亚硝基-2-萘酚的高效降解菌株并命名为CUGB-JL11。
样品制备流程如下：实验样品在石英瓶中按V乙酸乙酯: V实验样品=1:2的体积比添加乙酸乙酯，随即进行振荡。一段时间后，转移适量的上层(有机层)溶液于气相小瓶中，通过GC-MS检测分析。
仪器设置如下：GC部分：进样量为1 μL，不分流模式，进样口温度为280 ℃。色谱柱升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至150 ℃，然后以5 ℃/min升至200 ℃，最后以10 ℃/min的速度升至290 ℃。整个过程需要31 min。
MS部分：离子源和四极杆的温度分别为230 ℃和150 ℃。Scan模式，m/z记录范围是50−500。使用质谱搜索程序(NIST 14)分析数据，并将实测谱图与NIST库中的标准谱图进行比较。
1.3 菌株鉴定 1.3.1 菌株形态特征在LB培养基中将菌株CUGB-JL11活化并扩培至OD600=0.6时，于LB固体培养基上轻轻反复划线，并对生化培养箱中28 ℃培养24 h后的菌落进行观察，记录其菌落形状、颜色、透明度和边缘是否光滑等特征。
取OD600=0.6的细菌悬浮液800 μL于1.5 mL的EP管内，将离心管里的细菌轻轻吹散后转移至新管内，转速800−1 000 r/min离心5 min成团(细胞团大小约绿豆大小)，垂直静置自然沉降1 h后弃上清液(留1 mL左右)。再沿管壁缓慢加入1 mL预冷的2.5%戊二醛，将所得重悬菌液吸取7−10 μL，滴加于玻片表面，烘箱烘干后样品喷金，进行扫描电子显微镜观察。
1.3.2 16S rRNA基因分子生物学鉴定按照细菌DNA提取试剂盒的使用说明书提取菌株SCSIO 43702的基因组DNA，并以其为模板，使用细菌16S rRNA基因通用引物对27F (5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增基因。
PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer (20 mmol/L Mg2+ plus) 2.0 μL，Ex Taq (5 U/μL) 0.2 μL，2.5 mol/L dNTPs Mix 1.6 μL，5p 27F Primer (10.0 μmol/L) 1.0 μL，5p 1492R Primer (10.0 μmol/L) 1.0 μL，模板DNA (25.0 ng/μL) 0.5 μL，用ddH2O补至20 μL。
PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25个循环；72 ℃ 10 min[1]。
PCR产物于上海美吉生物测序公司的Illumina MiSeq平台进行测序。测序结果通过NCBI数据库进行相似性比对，并使用MEGA 11的邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树。NCBI登录号为：SUB10505279。
1.4 1-亚硝基-2-萘酚菌株降解特性研究 1.4.1 菌株生长曲线菌液培养：在LB液体培养基中将菌株CUGB-JL11活化并扩培至OD600=0.6。
实验组：在250 mL锥形瓶中，加入1-亚硝基-2-萘酚终浓度为40 mg/L的100 mL的无机盐培养基，再加入5 mL上述制备好的菌液。
对照组：用等量的无机盐液体培养基替代，不添加菌液。
实验组和对照组各设置3个重复，封口后放入摇床中于28 ℃、180 r/min条件下培养，每12 h测量培养液的OD600值。
1.4.2 温度对1-亚硝基-2-萘酚降解的影响按照1.4.1实验组和对照组的配制和设置方法，将实验组和对照组的温度分别设定为：15、20、25、30和40 ℃。于28 ℃、180 r/min条件下培养，每12 h测量培养液的OD600值。
1.4.3 pH对1-亚硝基-2-萘酚降解的影响按照1.4.1实验组和对照组的配制和设置方法，将实验组和对照组的pH分别设定为：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。于28 ℃、180 r/min条件下培养，每12 h测量培养液的OD600值。
1.4.4 样品处理1-亚硝基-2-萘酚降解实验进行到第5天时，将培养菌液于12 000×g离心5 min，收集菌体和上清液。将收集的菌体用超声波破碎后的混合液重新离心，收集上清液，并将其与第1次的上清液混合。
按V乙酸乙酯: V上清液=1:2的体积比添加色谱纯乙酸乙酯，以萃取中间代谢产物，共萃取3次。萃取后的产物通过氮吹法在旋转蒸发仪上浓缩至0.8 mL，取1 μL上样，进行气相色谱-质谱联合(GC-MS)检测分析，并与NIST质谱数据库(National Institute of Standards and Technology: http://chemdata.nist.gov/)比对，鉴定代谢产物。
1.4.5 数据分析1-亚硝基-2-萘酚的降解率按照公式(1)计算。
使用数据处理软件SPSS 25.0对实验所得数据进行显著性分析。
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公式(1) |
采样区矿山样本偏弱酸性，pH值介于5.14−7.33之间。TOC、TN、TP和TS值分别介于14 900−23 100、232−535、2 020−2 790和605−1 065 mg/kg之间(表 1)。较之于广西河池市土壤环境硫元素的背景值(278 mg/kg)，总硫含量属于超标，但远低于酸化的铅/锌矿尾矿环境(均值为12 600 mg/kg)[16]。重金属总量可以将采样区域划分为轻度[(9 260±46.3) mg/kg]、中度[(41 700±208) mg/kg]和重度[(129 000±644) mg/kg]污染区。因此，本研究选取重金属浓度均值最高的重度污染区[(129 000±644) mg/kg]为微生物菌种库，开展菌种筛选工作(标记为T1和T2)。
2.2 菌株的鉴定菌株CUGB-JL11的初步形态观察结果显示，该菌株为革兰氏阴性杆的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，呈杆状，乳白色不透明，有鞭毛，中间凸起，长0.59 μm左右。菌落形态及电镜观图见图 1。
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| 图 1 恶臭假单胞菌菌株P. putida CUGB-JL11的菌落形态(A)及扫描电子显微镜图(B) Figure 1 Colony morphology (A) and scanning electron microscope (SEM) graph (B) of P. putida CUGB-JL11. |
基于菌株16S rRNA基因序列与NCBI数据库中相似菌株序列比对结果可知：菌株CUGB-JL11序列与Pseudomonas putida (OL314839.1)相似度为100%，该菌株属于Pseudomonas sp.。已有研究报道假单胞菌菌属Pseudomonas putida具有苯系物等有机物的降解能力[17–18]。本研究选取了已报道的Pseudomonas属微生物与CUGB-JL11构建了系统发育进化树(图 2)，命名其为Pseudomonas putida CUGB-JL11，简称P. putida CUGB-JL11。
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| 图 2 菌株Pseudomonas putida CUGB-JL11的16S rRNA基因系统进化发育树 Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of Pseudomonas putida CUGB-JL11. Numbers in parentheses are accession numbers of related strains. Numbers in each branch points are percentage supported by bootstrap. The bar=0.16 is nucleotide divergence. |
2.3 菌株生长特性研究
菌株P. putida CUGB-JL11在以1-亚硝基-2-萘酚为唯一碳源的培养基中的生长曲线(图 3A)。可以看出：在营养充足的培养基中，菌株经20 h的适应期后大量生长繁殖，并在约90 h后达到生长繁殖的峰值，此后菌株进入平台期，生长繁殖相对趋于稳定。
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| 图 3 菌株Pseudomonas putida CUGB-JL11的生长曲线(A)及温度(B)和pH (C)对菌株生长的影响 Figure 3 The growth curve (A) and effects of temperature (B) and pH (C) on the growth of Pseudomonas putida CUGB-JL11. Relative standard deviation in present study is below 5%. |
本实验在最佳培养时间(36 h内)，以温度为变量的培养实验结果表明，该菌株在20−30 ℃温度范围内具有很好的适应性。广西河池市的年均温度为20.5 ℃[2]，该菌株较为广泛的温度适应性为菌株后期的修复应用提供了有利的条件。同时P. putida CUGB-JL11的最适生长温度为30 ℃左右(图 3B)。已有研究发现，菌株Pseudomonas sp. LY1在30−37 ℃的温度范围内对吲哚乙酸具有较高的适应性[19]。相对地，不同于嗜热菌，如Pseudomonas mendocina NR802 (28−37 ℃)，或者嗜冷菌，如：Pseudomonas sp. BZD-33 (8−15 ℃)，对菲(100 mg/L)和邻苯二甲酸二乙酯(400 mg/L)的降解率分别高达82.9%和90.0%[20−21]。本研究的恶臭假单胞菌P. putida CUGB-JL11作为嗜温菌，其在培养温度高于30 ℃或低于20 ℃生长速度均显著降低，但仍具有一定的生存能力，体现了该菌株对温度变化具有一定的适应能力。
Salunke等[22]报道中提出，温度和pH与P. baetica SUHU25纤维蛋白分解酶的活性具有一定的相关性。因此，本研究同时测定了不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)对菌株生长的影响(图 3C)。pH值对培养2 d的菌株P. putida CUGB-JL11的生长有显著影响，菌株最适pH值为7.0。在pH 5.0、9.0、10.0时，菌株的生长情况存在显著差异性，表明该菌株的pH适应范围为6.0−8.0。同样地，Duca等[19]研究发现，Pseudomonas aeruginosa NR1在pH低于5.0或者高于10.0的培养条件下，菌株的生长速率明显低于中性培养条件下的生长速率。这可能与1-亚硝基-2-萘酚的中间代谢产物(如：邻氰基苯甲酸、邻苯二甲酸、2-羟基甲基苯甲酸和(2E)-3-(2-羟基苯基)-2-丙烯酸)有关[23]。本研究的恶臭假单胞菌P. putida CUGB-JL11能在pH值为6−8这一范围内具有良好的适应能力。
2.4 1-亚硝基-2-萘酚降解产物质谱鉴定为了探究菌株对1-亚硝基-2-萘酚的降解特性，在pH为7.0，温度为28 ℃的环境下将纯化后的P. putida CUGB-JL11菌株接种到初始浓度为40 mg/L 1-亚硝基-2-萘酚为唯一碳源的培养基中培养，同时设置不接种菌液的对照组(图 4)。培养5 d时，1-亚硝基-2-萘酚的降解率为81%，明显高于对照组，说明P. putida CUGB-JL11菌株最适生长条件下具有高效降解1-亚硝基-2-萘酚的潜力。同时培养过程中，发现起初培养液颜色呈绿色，在培养过程中逐渐变为棕黄色(图 4)，这一现象可能是由于1-亚硝基-2-萘酚开环过程中积累了一些有颜色的有机化合物积累所致。
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| 图 4 1-亚硝基-2-萘酚微生物降解特性 Figure 4 Bio-degradation characteristics of 1-nitroso-2-naphthol. Relative standard deviation in present study (B) is below 5%. |
为了明确菌株P. putida CUGB-JL11对1-亚硝基-2-萘酚的生物降解路径，本研究利用GC-MS分析了该菌株的代谢产物，对实验组体系中第5天的样品进行检测鉴定。通过质谱搜索程序(NIST 14)分析数据，并将实测谱图与NIST库中的标准谱图进行比较，基于全扫描模式下获得质谱图(图 5)。菌株P. putida CUGB-JL11降解1-亚硝基-2-萘酚的中间代谢产物，共鉴定到6种主要的转化产物，各代谢产物结构式及具体的保留时间(tR)见表 2，并推测出1-亚硝基-2-萘酚可能的代谢途径。
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| 图 5 1-亚硝基-2-萘酚降解产物全一级质谱图 Figure 5 The GC-MS spectrum of 1-nitroso-2-naphthol products. |
表 2. 1-亚硝基-2-萘酚在微生物降解过程中潜在的转化产物鉴定
Table 2. The identified 1-nitroso-2-naphthol and its proposed intermediates products during the microbial-degradation processes
| The proposed intermediates products | tR | Molecular formula | CAS number | Chemical structure |
| 1-nitroso-2-naphthol | C10H7NO2 | 131-91-9 |  |
|
| Valeric acid | 4.389–4.472 | C5H10O2 | 109-52-4 |  |
| Isovaleric acid | 5.131–5.251 | C5H10O2 | 503-74-2 |  |
| Methyl N-hydroxybenzenecarboximidoate | 5.952–5.998 | C8H9NO2 | Not available |  |
| Amphetamine | 8.411–8.483 | C9H13N | 300-62-9 |  |
| 7-hydroxy-6-methyl-oct-3-enoic acid | 9.080–9.308 | C9H16O3 | Not available |  |
| Heptanedioic acid, 2, 6-diamino- | 17.984–18.264 | C7H14N2O4 | 583-93-7 |  |
Lu等研究表明，1-亚硝基-2-萘酚的降解起始于−NO (亚硝基)基团被氧化成−NO2 (硝基)，形成1-亚硝基-2-萘酚[7]。目前尚未有关微生物降解的报道。菌株P. putida CUGB-JL11在1-亚硝基-2-萘酚的好氧生物降解过程中，在135 min的降解时间内，通过一系列的氧化还原反应形成中间体：苯甲羟肟酸甲酯和苯丙胺，其保留时间依次为：5.952–5.998 min和8.411–8.483 min (表 2)。之后通过苯环开环代谢路径进一步降解生成无毒或者低毒性的小分子物质，如丙酸乙酯、戊酸、异戊酸等(表 2)，最终通过生成碳氧化物(COX)、氮氧化物(NOX)和H2O。表明生物降解过程中，P. putida CUGB- JL11菌株可以将1-亚硝基-2-萘酚母体及时降解。有研究表明，在有机物降解过程中即使产生难降解性的中间代谢产物，其母体及中间代谢产物也可作为二级基质通过共代谢作用被微生物降解[24]。Lu等研究发现，1-亚硝基-2-萘酚在光降解过程中，会形成难降解的芳香腈类物质：邻氰基苯甲醛和邻氰基苯甲酸等[7]。一般来说，细菌在有氧降解多环芳烃时，在双加氧酶的作用下可将2个氧原子直接加到苯环上[25]。由此得出，1-亚硝基-2-萘酚的光降解路径不同于微生物降解路径，在好氧微生物作用下，苯甲羟肟酸甲酯和苯丙胺代谢路径参与了菌株P. putida CUGB-JL11对1-亚硝基-2-萘酚的降解过程。本研究为进一步探究1-亚硝基-2-萘酚在微生物作用下的降解机理奠定了理论基础。
3 结论本研究从广西河池市的某尾矿环境中筛选得到1株1-亚硝基-2-萘酚的高效降解菌CUGB-JL11，经形态特征及16S rRNA基因分析鉴定，该菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，命名为P. putida CUGB-JL11。菌株P. putida CUGB-JL11对1-亚硝基-2-萘酚在5 d内降解率高达81.0%，说明该菌株具有潜在的矿山修复应用能力。GC-MS检测到6种中间代谢产物，并生成了一些有毒的苯环类物质：苯甲羟肟酸甲酯和苯丙胺，但是1-亚硝基-2-萘酚母体及其大部分中间产物都降解为小分子物质(如丙酸乙酯、戊酸、异戊酸等)或者被完全降解。
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