口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种高度传染性的疾病，主要感染偶蹄动物，如牛、猪、绵羊、山羊等。该病能够导致动物生产力严重下降和新生动物高死亡率，经济损失巨大^[1‒2]。消灭和控制口蹄疫是各国政府共同关注的世界性问题^[3‒4]。

目前，多数国家通过检测针对FMDV结构蛋白的抗体水平评价FMD疫苗的免疫效力、指导免疫接种计划、流行病学调查和地区疫情监测，并依此实行FMD免疫清除计划^[5]。然而在临床中，常发生注射FMDV疫苗，ELISA试剂盒也能检出较高阳性率，但接种动物的保护力却与预期效果不符的现象^[6]。因此，能够准确地检测出动物体内具有中和能力的抗体水平就显得尤为重要。

国际动物卫生组织(Office International des Epizooties，OIE)推荐体外评估FMD疫苗免疫效果的方法包括病毒中和试验(VNT)、固相竞争ELISA (SPCE)和液相阻断ELISA (LPBE)^[1]。VNT是以病毒与血清中和后的感染力为依据，从而判断血清中抗体消长情况及对病毒的中和能力^[7]，具有敏感性高、特异性好等特点，是检测FMDV中和抗体的金标准方法^[8]。但该方法对实验条件要求较高，需操作活毒，须在高级别生物安全实验室中进行，且细胞状态对实验结果影响较大，不同批次实验结果存在一定差异性。LPBE具有敏感性高、重复性好、操作便捷等优点。但基于豚鼠和兔子多抗血清的传统LPBE在不同动物群体会产生不同比例的假阳性^[9‒10]。SPCE在特异性和高通量检测的能力方面优于LPBE，但使用的多抗血清与LPBE相同^[11‒12]。

与多克隆抗血清相比，使用单克隆抗体可提升ELISA特异性、准确性、批间稳定性，且易于标准化。单克隆抗体传统上是从小鼠杂交瘤细胞中制备的。然而，使用小鼠单克隆抗体作为检测试剂并不是最理想的，因为小鼠对FMDV的抗体反应可能在表位结构和偏好上与自然宿主(如牛、羊和猪)不同^[13]。此外，由于杂交瘤的不稳定性，长期使用单克隆抗体可能会丢失^[14‒17]。近年来，荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)和单细胞分离技术的结合，可从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分离出单个分泌IgG的B细胞，并通过单细胞DNA测序获得编码成对轻链和重链可变区的cDNA序列^[18‒21]，随后在哺乳动物细胞系统(如CHO-S或HEK 293T)中表达获得基因工程抗体。应用该技术，本团队已成功获得牛源FMDV广谱反应性单克隆抗体E32和FMDV O型型内广谱中和单克隆抗体C4^[22]。本研究以E32为捕获抗体，以生物素标记的C4为检测抗体，建立检测FMDV O型中和抗体的固相阻断ELISA方法(neutralizing antibodies solid-phase blocking ELISA，NA-SPBE)。利用自然宿主牛源单克隆抗体有望提高ELISA检测自然宿主中和抗体的准确性。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和设备

碳酸盐缓冲液(Sigma)；TMB底物溶液(SURMODICS)；辣根过氧化物酶标记亲和素(金斯瑞生物科技有限公司)；生物素(Thermo)；FMDV O型灭活抗原(中农威特生物科技股份有限公司)；口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)。96孔酶标板(Costar)；酶标仪(BIO-RAD)。

1.2 抗体及血清样本

抗体E32和C4均由本实验室制备与保存^[22]。

健康非免疫动物血清共86份，其中包括牛血清20份、猪血清44份、羊血清22份，经LPB-ELISA检测O、A、Asia 1型结构蛋白抗体均为阴性。感染动物血清样品共140份，其中包括牛血清89份、羊血清26份、猪血清25份，经VNT检测为FMDV O型阳性。FMDV A型阳性牛血清共20份，经VNT检测为FMDV A型阳性。FMDV Asia1型阳性猪血清共20份，经VNT检测为FMDV Asia1型阳性。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)标准阳性血清各10份。待检临床样本200份，包括牛血清90份、羊血清40份、猪血清70份。FMDV O型灭活疫苗免疫动物血清160份，其中包括牛血清90份、羊血清39份、猪血清31份。FMDV O型灭活疫苗多次免疫牛血清共95份，为19头牛每间隔1个月免疫1次，每次免疫剂量为12 μg/头份，连续免疫3次，免疫前和每次免疫后1个月采血，并在第3次免疫后间隔2个月采血1次。阳性对照血清采自FMDV O型感染后1‒3个月的牛，阴性对照血清采自非免疫健康牛。以上血清均由本实验室采集与保存。

1.3 抗体C4的生物素标记

取1 mg生物素加入到180 μL无酶水中，吹打使其溶解混匀；取50 μL完全溶解后的生物素，加入到总量不超过1 mg的C4抗体中，摇匀，冰浴4 h；50倍体积PBS溶液在4 ℃条件下透析3次，每次4 h，使多余的生物素完全被置换，标记好的抗体命名为C4-Bio。

1.4 固相阻断ELISA反应条件确定 1.4.1 抗体E32最适工作浓度及血清最佳稀释度的确定

以牛源单克隆抗体E32为捕获抗体，以FMDV O型146S作为抗原(1 μg/mL)，以生物素标记抗体C4-Bio为检测抗体，不加血清，反应后加入酶标亲合素，采用TMB显色液进行显色。采用方阵滴定方法，确定各反应最适工作浓度：抗体E32按2.00、1.00、0.50、0.25 μg/mL作梯度稀释，阴性和阳性对照血清按1:8‒1:1 024作梯度稀释。读取OD₄₅₀值，并计算N/P值(N：阴性对照OD₄₅₀值，P：阳性对照OD₄₅₀值)，当N/P值最大时最佳。

1.4.2 C4-Bio最适工作浓度及酶标亲和素最适稀释比例的确定

生物素标记抗体C4-Bio按2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.060、0.030、0.015 μg/mL作梯度稀释，酶标亲和素按1:20 000、1:40 000、1:80 000作梯度稀释。读取OD₄₅₀值，并计算N/P值，当N/P值最大时最佳。

1.4.3 最适阻断条件及抗原最适捕获浓度的确定

阻断反应条件选取室温振荡1 h、2 h和过夜，室温静置过夜以及4 ℃静置过夜，FMDV O型灭活抗原，抗原浓度选择1.00、0.50、0.25 μg/mL，读取OD₄₅₀值，并计算N/P值，当N/P值最大时最佳。

1.4.4 最适血清稀释液

实验准备有血清稀释液(2% BSA+2%山羊血清)与1×PBST洗液2种，读取OD₄₅₀值，并计算N/P值，当N/P值最大时最佳。

1.4.5 操作步骤及抗体效价判定

操作步骤：配制碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)，稀释抗体E32至最适工作浓度，加入酶标板，100 μL/孔，4 ℃静置过夜；捕获A型FMDV灭活抗原，100 μL/孔，室温静置2 h；配制1% BSA+5%蔗糖溶液，100 μL/孔，37 ℃封闭1 h，吹干，抽真空保存；加入待检血清样本，100 μL/孔；加入生物素标记抗体C4-bio，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min；加入酶标亲和素，100 μL/孔，37 ℃孵育15 min；TMB显色，100 μL/孔，37 ℃避光反应15 min；终止并读取OD₄₅₀值。

计算血清样品抗体效价：146S抗原对照4孔，弃去最高和最低OD₄₅₀值，计算剩余2孔的平均OD₄₅₀值，再除以2，即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD₄₅₀值。检测孔OD₄₅₀值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

1.5 敏感性、特异性与临界值的确定

选取非免疫健康动物血清86份和VNT检测结果为FMDV O型阳性的动物血清140份，用NA-SPBE方法检测上述血清样本，统计血清样本的抗体效价，通过对数据分析，以确定NA-SPBE方法的临界值、特异性和敏感性。

1.6 重复性试验

使用同一批次制备的146S反应板，在不同时间段检测相同的12份血清样本抗体效价3次，评价该方法的批内变异系数；使用不同批次制备的146S反应板，在相同时间段检测相同的12份血清样本抗体效价3次，评价该方法的批间变异系数。一般行业标准为批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15%。

1.7 交叉反应性试验

使用NA-SPBE方法检测FMDV Asia1型阳性血清和FMDV A型阳性血清各20份，BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV阳性血清各10份。统计检测结果，确定该方法是否存在交叉反应。

1.8 NA-SPBE与VNT相关性

使用NA-SPBE与VNT 2种方法，检测160份FMDV O型灭活疫苗免疫血清抗体效价。统计检测结果，通过Pearson系数检验来确定两者之间的相关系数，当P < 0.05时具有统计学意义，分析过程使用GraphPad Prism 8软件。VNT的具体操作方法及结果判定参考文献[23]。

1.9 NA-SPBE、LPBE与VNT临床样本检测结果比较

使用NA-SPBE、VNT以及LPBE方法检测待检临床样本200份，其中包括牛血清90份、羊血清40份、猪血清70份。比较NA-SPBE、LPBE与VNT检测结果，并计算NA-SPBE、LPBE与VNT的符合率。

1.10 抗体消长规律

使用NA-SPBE方法检测O型灭活疫苗多次免疫牛血清。通过对血清样本的检测，从而观察动物体内中和抗体水平消长变化，为评价相关疫苗免疫效力提供依据。

2 结果与分析 2.1 抗体E32最适工作浓度及血清最佳稀释度的确定

方阵滴定所测OD₄₅₀值及N/P值如表 1所示，当捕获抗体E32浓度为0.5 μg/mL、血清稀释比例为1:32时，N/P值最高。因此，抗体E32最适工作浓度为0.5 μg/mL，血清最佳稀释度为1:32。

2.2 C4-Bio最适工作浓度及酶标亲和素最适稀释比例的确定

使用方阵滴定来确定C4-Bio及酶标亲和素最适工作浓度，所测得OD₄₅₀值及N/P值见表 2。结果显示，当C4-Bio浓度为0.06 μg/mL、酶标亲和素稀释比例为1:40 000时，N/P值最大。因此，可以确定C4-Bio最适浓度为0.06 μg/mL，酶标亲和素最适稀释比例为1:40 000。

2.3 最适阻断条件及抗原最适捕获浓度的确定

使用方阵滴定来确定最适阻断条件及抗原最适捕获浓度，所测得OD₄₅₀值及N/P值见表 3。结果显示，当阻断条件为室温振荡过夜、抗原捕获浓度为0.25 μg/mL时，N/P值最大。因此，可以确定最适阻断条件为室温振荡过夜，抗原最适捕获浓度为0.25 μg/mL。

2.4 最适血清稀释液

实验测得OD₄₅₀值以及N/P值见表 4。结果显示，当选择实验室自制血清稀释液时，N/P值最高。因此选择实验室自制血清稀释液作为最适血清稀释液。

2.5 敏感性、特异性与临界值的确定

使用NA-SPBE方法，检测非免疫健康动物血清86份和经VNT检测确认为FMDV O型阳性的动物血清140份。其中非免疫健康猪血清中，3份抗体效价为0.9 log₁₀，4份抗体效价为1.2 log₁₀，1份抗体效价为1.5 log₁₀，其余抗体效价 < 0.9 log₁₀。阳性血清有4份血清抗体效价为1.2 log₁₀，其余抗体效价均≥1.5 log₁₀ (图 1A)。经过ROC曲线分析，当Cut-off值为1.35 log₁₀时，AUC具有最大面积0.998，此时敏感性为97.14%，特异性为98.84% (图 1B)。因此确定临界值为1.35 log₁₀。

然而，在对上述血清实际检测过程中发现，阴阳性血清在抗体效价1.2 log₁₀与1.5 log₁₀之间出现了交叉现象(图 1A)，故在结果判定时需设置可疑区间。当血清抗体效价≤1.2 log₁₀时，结果判定为阴性，当血清抗体效价 > 1.5 log₁₀时，结果判定为阳性，而当血清抗体效价处在1.2 log₁₀与1.5 log₁₀之间，则结果判定为可疑，需重新测定，若第二次检测仍为可疑，则结果判定为阳性。

2.6 重复性试验

使用同一批次制备的146S反应板，在不同时间段检测相同的12份血清样本3次，结果显示批内变异系数均低于10%，使用不同批次制备的146S反应板，在相同时间段检测相同的12份血清样本3次，结果显示批间变异系数均低于10% (表 5)。表明该方法的重复性良好。

2.7 交叉反应性试验

使用NA-SPBE方法检测FMDV Asia1型阳性血清和FMDV A型阳性血清各20份，BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV阳性血清各10份。检测结果如图 2所示，FMDV Asia1型、FMDV A型、BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV阳性血清的抗体效价均≤1.2 log₁₀，因而判定检测结果均为阴性，未出现交叉反应。

2.8 NA-SPBE与VNT相关性

使用NA-SPBE与VNT方法检测160份FMDV O型免疫血清抗体效价，NA-SPBE检测出15份血清抗体效价 < 1.35 log₁₀，其余血清均 > 1.35 log₁₀，VNT检测出20份血清抗体效价 < 1.65 log₁₀ (VNT临界值)，其余血清均≥1.65 log₁₀ (图 3A)。使用GraphPad Prism 8软件分析2种方法的相关性。结果显示，两者的相关系数r为0.807 5，P < 0.000 1，2种方法呈显著相关(图 3B)。表明NA-SPBE代替VNT进行大量血清样本的检测是可行的。

2.9 NA-SPBE、LPBE与VNT临床样本检测结果比较

使用NA-SPBE、VNT以及LPBE方法分别检测待检临床样本200份。结果显示，VNT检测出阳性血清112份、阴性血清88份，LPBE检测出阳性血清122份、阴性血清78份，NA-SPBE检测出阳性血清116份、阴性血清84份。NA-SPBE与VNT阳性符合率为96.49%，阴性符合率为95.35%，总符合率为96%。LPBE与VNT阳性符合率为92.31%，阴性符合率为89.16%，总符合率为91%。具体数据见表 6。以上结果表明，LPBE和NA-SPBE 2种方法与VNT的符合率都很高，而NA-SPBE相较于LPBE，检测结果更接近于VNT。

2.10 抗体消长规律

使用NA-SPBE方法检测O型灭活疫苗免疫前至第3次免疫血清以及第3次免疫后间隔2月血清。结果显示，动物体内中和抗体水平，随免疫次数增加而升高，一般在第2次免疫或第3次免疫达到最高，而在免疫结束后第2月，中和抗体水平又开始下降(图 4)。从而可以看出，NA-SPBE方法能够很好地检测出免疫动物体内中和抗体水平变化，为评价疫苗的免疫效力提供数据支撑。

3 讨论

FMDV O型是目前危害最为严重的血清型，具有高度抗原变异，可分为11个拓扑型^[24]，目前在我国流行的有东南亚拓扑型(SEA)、中东-南亚(ME-SA)拓扑型与嗜猪的O/Cathay拓扑型，ME-SA拓扑型中又有PanAsia和IND2001这2个谱系^[25]。病毒变异导致疫苗毒株很难与流行毒株相匹配。因此，为了提高疫苗保护效果，需要经常更新疫苗毒株^[26‒27]。为解决FMDV抗原多样性问题，本研究选用了FMDV广谱反应性单克隆抗体E32为捕获抗体，其可与FMDV O型、Asia1型及A型的所有代表流行毒株发生反应。选用FMDV O型型内广谱中和抗体C4为检测抗体，该抗体识别抗原表位位于FMDV O型衣壳蛋白VP3上，VP3变异比较大，仅有39%的氨基酸保守，其大多数氨基酸集中在55‒88位氨基酸、130‒140位氨基酸、176‒186位氨基酸、196‒208位氨基酸这4个区域^[28]。而抗体C4关键氨基酸为βB上T65、B‒C环上T68、E‒F环上E131和K134、H‒I环上G196^[13]，处在VP3保守区域，且可中和我国流行的3个拓扑型4个谱系的代表毒株。因此，当用NA-SPBE检测血清中FMDV的中和抗体时，只需更新146S抗原以匹配新的流行株，不需要更新单克隆抗体。另外，E32和C4都是通过单个B细胞抗体技术制备，此方法避免了复杂的杂交瘤融合和筛选过程，抗体制备较简单、快速，可以为检测方法提供充足且稳定的抗体试剂。而且，检测抗体C4为中和抗体，这也保证了本研究建立的NA-SPBE检测到的抗体也是中和抗体。

目前，使用灭活疫苗进行预防性或紧急疫苗接种是流行地区控制口蹄疫的主要措施，因而准确对疫苗免疫效力的评价也至关重要。已有研究表明，动物接种疫苗后体内的中和抗体滴度与它们抵抗病毒攻击的能力之间有很好的相关性^[29‒31]。动物在接种FMD疫苗后能产生针对FMDV的中和抗体，该抗体能与细胞外游离的病毒粒子结合，从而消除病毒的感染能力，在阻止病毒感染和传播中起到重要作用^[32]。其作用机制主要有封闭病毒表面抗原、改变病毒表面结构、与病毒形成能被巨噬细胞清除的免疫复合物和激活补体裂解病毒等^[33]。

在检测动物体内中和抗体效价时，VNT是检测FMDV中和抗体的标准方法，但该方法操作繁琐、工作量大、耗时长，不适合高通量的检测。而NA-SPBE操作方便、耗时短，具有良好特异性和敏感性，当临界值为1.35 log₁₀时，敏感性为97.14%，特异性为98.84%，批间变异系数和批内变异系数均低于10%，具有良好的重复性，且与FMDV A型、FMDV Asia1型、BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV不存在交叉反应。在检测中和抗体效价时，NA-SPBE与VNT检测的抗体效价相关系数r为0.807 5，P < 0.000 1，具有显著相关性，且两者符合率为96%，表明NA-SPBE代替VNT进行大量血清样本的检测是可行的。

传统LPBE虽具有敏感性高、重复性好、操作便捷等优点，但结果易出现假阳性，且抗原需单独冷冻保存，运输过程容易降解，影响实验结果。NA-SPBE除具备LPBE优点外，其所检测抗体为中和抗体，特异性更强，抗原已捕获至酶标板上，更加稳定，便于运输。在NA-SPBE与LPBE结果比较中可以看出，NA-SPBE与VNT的符合率为96%，高于LPBE的91%。

除上述外，NA-SPBE在检测连续免疫动物血清时，可以清晰准确地反映出动物体内中和抗体水平的消长变化。为评价FMD疫苗的免疫效力，指导免疫接种提供有力的数据支撑。