2022, Vol. 62
表1(Table 1)
辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220193
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 李志远, 韩胜男, 王进, 赵丹, 韩超, 刘爱新. 2022
- LI Zhiyuan, HAN Shengnan, WANG Jin, ZHAO Dan, HAN Chao, LIU Aixin.
- 辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析
- Function analysis of LC_Clp transcription factor in Lysobacter capsici X2-3
- 微生物学报, 62(11): 4529-4540
- Acta Microbiologica Sinica, 62(11): 4529-4540
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文章历史
- 收稿日期：2022-03-24
- 修回日期：2022-04-23
- 网络出版日期：2022-05-11
引用本文 |
李志远, 韩胜男, 王进, 赵丹, 韩超, 刘爱新. 辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析[J]. 微生物学报, 2022, 62(11): 4529-4540.
Li Zhiyuan, Han Shengnan, Wang Jin, Zhao Dan, Han Chao, Liu Aixin. Function analysis of LC_Clp transcription factor in Lysobacter capsici X2-3[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(11): 4529-4540.
辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析
山东农业大学植物保护学院, 山东 泰安 271018
摘要：辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici) X2-3是从小麦根际分离的一株对多种病原真菌和卵菌有抑菌活性的菌株，目前对该菌株产生的抗菌物质及其产生调控机制尚不明确。[目的] 明确转录因子LC_Clp对该菌株抗菌物质产生的调节作用，为深入了解L. capsici X2-3的生防机制提供依据。[方法] 从转座子EZ-Tn5随机插入突变体库中筛选获得X2-3的LC_clp基因突变体M356，通过恢复性克隆获得功能互补菌株，分析LC_clp基因在拮抗活性、胞外酶分泌以及调控基因表达方面的差异。[结果] 与X2-3相比，M356对测试病原真菌、卵菌的抑菌活性和产生体外抗菌物质的能力完全丧失，蛋白酶和纤维素酶产生量明显减少，几乎不产几丁质酶；所检测的转录调节因子、次生代谢及胞外酶等相关基因的表达量均显著低于野生株X2-3，而互补菌株MCS28和X2-3水平相当。[结论] LC_Clp不仅与菌株的抗菌物质合成及抑菌活性有关，还影响胞外酶的产生，并调控多种基因的表达，具有广泛的调节作用。
关键词：辣椒溶杆菌 Clp转录因子 抑菌活性 抗菌物质合成 胞外酶
Function analysis of LC_Clp transcription factor in Lysobacter capsici X2-3
College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, Shandong, China
Abstract:
Lysobacter capsici X2-3, a plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) strain isolated from the wheat rhizosphere, shows strong antimicrobial activity against many plant pathogenic fungi and oomycetes. However, little is known about the antibiotics produced by X2-3 as well as their regulation mechanism. [Objective] Our study aimed to clarify the regulation effect of LC_Clp transcription factor on the antibiotic production of L. capsici X2-3 and to provide reference for deep understanding of its biocontrol mechanism. [Methods] We selected a LC_clp mutant M356 from the mutant bank that was generated by the random insertion of the EZ-Tn5 transposon and certified by plasmid rescue. Additionally, we analyzed the differences of LC_clp gene in antimicrobial activity, secretion of extracellular enzymes, and regulation of gene expression among X2-3, mutant M356 and the complementary strain MCS28. [Results] Antimicrobial activity of mutant M356 against pathogenic fungi and oomycetes was completely lost as compared with that of X2-3 and the antibiotics produced by M356 was undetected by HPLC method. Extracellular enzymes such as protease, cellulose and chitinase that was secreted by mutant M356 decreased significantly. Expression of genes relating transcriptional regulators, secondary metabolism and extracellular enzymes were lowered dramatically in M356 as compared with that of wild-type strain X2-3. However, all the items tested in complementary strain MCS28 were similar with those of wild-type strain X2-3. [Conclusion] As a global regulator, LC_Clp regulates the synthesis of antibiotics, the production of extracellular enzymes and the expression of multiple genes in L. capsici X2-3.
Keywords:
Lysobacter capsici Clp transcription factor antimicrobial activity antibiotic production extracellular enzymes
溶杆菌属(Lysobacter)包括70多个种，常见的有产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、抗生素溶杆菌(L. antibiotics)、胶状溶杆菌(L. gummosus)和辣椒溶杆菌(L. capsici)等，广泛存在于植物根围、水体等环境，是常见的植物根际促生菌(PGPR)[1–2]。辣椒溶杆菌X2-3是本实验室从小麦根际分离得到的一株PGPR菌株，可分泌多种胞外酶，对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)等真菌，群结腐霉(Pythium myriotylum)和寄生疫霉(Phytophthora parasitica)等卵菌，具有明显的抑菌作用[3]。目前大多数关于溶杆菌的研究来自于产酶溶杆菌OH11，包括其抗菌物质的成分、分泌和调控机制等[4–5]，对辣椒溶杆菌的研究相对较少。
Clp (cAMP receptor-like protein)是一类重要的转录因子，属于CRP (cyclic AMP receptor protein)家族蛋白。该蛋白含有2个结构域，分别为N-端cNMP结构域和C-末端HTH/DNA结合域。对大肠杆菌的研究发现，CRP蛋白的cNMP结构域通过与cAMP结合改变自身构象，形成cAMP-CRP复合体，识别并结合临近基因的启动子调控基因表达[6–8]。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)和稻生黄单胞菌稻生致病变种(X. oryzae pv. oryzae)中，clp基因的突变不仅影响病菌的胞外酶和胞外多糖的分泌和合成，而且对菌株的运动性、抗氧化能力及致病性都有不同的影响[9–10]。在产酶溶杆菌OH11中，clp基因的突变不仅改变菌落的形态、胞外酶的产生和生物膜的形成，还对抗菌物质的合成以及IV型菌毛依赖性的表面运动有调控作用[11]，表明Clp是一种广泛的调控因子。
为了解辣椒溶杆菌抗真菌物质产生及其调节，本研究以假禾谷镰孢菌(F. pseudograminearum，Fps)为指示菌，从X2-3的EZ-Tn5随机插入突变体库中筛选到抑菌活性完全丧失的突变体M356，并对Tn5所插入基因、突变体胞外酶、抗菌物质产生及基因表达等进行了分析，研究结果为深入了解LC_clp在L. capsici X2-3中的调控作用提供了依据。
1 材料与方法 1.1 供试菌株、质粒、培养条件和培养基本研究所用菌株、质粒见表 1。表中病原真菌和卵菌用于抑菌活性测定。
表 1. 本研究所用菌株和质粒
Table 1. Strains and plasmids used in this study
| Strain and plasmid | Relevant characteristics | Resource |
| Lysobacter capsici X2-3 | Nutrient broth; 28 ℃ | This lab |
| Escherichia coli DH5α | Luria broth; 37 ℃ | Vazyme |
| Escherichia coli Transfor Max EC100D pir+ | Luria broth; 37 ℃ | Epicentre |
| Fusarium pseudograminearum (Fps) | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| Fusarium graminearum | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| Rhizoctonia solani | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| Rhizotonia cerealis | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| Fusarium oxysporum | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| Phytophthora nicotianae | Potato dextrose agar; 25 ℃ | This lab |
| pEASY-Blunt Simple Cloning Vector | Kanamycin or Ampicillin, 50 µg/mL | TransGen |
| pBBR1MCS-5 | Gentamycin, 50 µg/mL | Vazyme |
所用培养基：PDA培养基用于对真菌和卵菌抑菌活性分析；蛋白酶、纤维素酶及几丁质酶检测培养基用于胞外酶分泌能力分析；培养基配方参考文献[5]。
1.2 基因分析、引物设计本研究所用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各基因所用引物及其详细信息见表 2。
表 2. 本研究所用引物及对应基因
Table 2. Primers used in this study
| Primers | Primer sequences (5′→3′) | Use | Length/bp | Genes |
| clp-F | CGGAATTCTGTAGGAAGATTCCAGTCGGA | PCR | 840 | LC_clp gene |
| clp-R | CCCAAGCTTTTAGCGGGTCCCGTAGAGGA | |||
| R6kF1 | GGGTAGCCAGCAGCATCCT | PCR | 1 044 | EZ-Tn5 |
| KanR | TAACATCATTGGCAAGGCTACC | |||
| 16S rRNA-F | GCTCGTGTCGTGAGATGTT | qPCR | 16S rRNA gene | |
| 16S rRNA-R | TGTAGCCCAGGTCATAAGG | |||
| RT-4356F | GCTGATGAATCTGCCCGAAGG | qPCR | 111 | GntR |
| RT-4356R | TAAGCGTCGCCACGGTAGAAG | |||
| RT-4649F | CCGACCTGGAATCCAAGAT | qPCR | 75 | MerR |
| RT-4649R | CCGACCTGGAATCCAAGAT | |||
| RT-4969F | CGCACGCATGAAGATATTGCC | qPCR | 93 | TfoX family |
| RT-4969R | GTAAAGCAGGTTCAAGGTCGG | |||
| RT-1572F | GTTCACCCATCACCACATCCT | qPCR | 80 | Peptide synthase waps1 |
| RT-1572R | GCGAGTGATACAGGTTGAACAATT | |||
| RT-1573F | AATTGAAGACATCCTGCCGCTGAC | qPCR | 80 | Peptide synthase waps2 |
| RT-1573R | TGTCCTGCACCTTGTCGTCGTA | |||
| RT-0895F | GCTACCGCCTGGAATACATCG | qPCR | 85 | NRPS/PKS gene |
| RT-0895R | TGGTCGGCTTCGTCTTCATAC | |||
| RT-0893F | GCACCTACTTCAGCGACTTCA | qPCR | 80 | FAD-dependent oxidoreductase |
| RT-0893R | CTGCTTCTTCTCCGCCCAATA | |||
| RT-5068F | GCCAATCTTTCCTTCGACTCC | qPCR | 89 | threonine dehydratase |
| RT-5068R | AGTTCCTCTGTTGCGTCTGAA | |||
| RT-0231F | AAGCCAAGACGAATCACCACT | qPCR | 92 | Chitinase A |
| RT-0231R | GATGGCGTCGTTGGAGTTGTA | |||
| RT-3538F | CGTCATCATCGAAGGCAACTG | qPCR | 88 | Cellulase |
| RT-3538R | GAAACTCAGCACCAGGTTGTC | |||
| RT-4408F | CGGTTTCATCGTCGCCTACAA | qPCR | 108 | Extracellular protease |
| RT-4408R | TGCTTGATGCTCAGGTCCTTC |
1.3 DNA的提取、连接、转化及感受态的制备
DNA的提取、酶切、连接、转化及感受态的制备等操作参考文献[3]。
1.4 菌株突变体的筛选及质粒拯救法鉴定侧翼序列采用转座子随机插入法结合平板抑菌测定，筛选抑菌活性缺失或减弱突变体。根据转座子使用说明书操作步骤将EZ-Tn5转入辣椒溶杆菌X2-3感受态细胞，在含卡那霉素(50 mg/mL)的NA平板筛选获得突变体，纯化后保存备用；将Fps孢子悬浮液涂布于PDA平板，挑取纯化的突变株点接在平板上与Fps进行共培养；挑选对Fps抑菌活性明显减弱或缺失的突变体，提取基因组DNA，以Tn5转座子序列为目标，用引物对R6KF1/KanR进行PCR验证，以野生菌株X2-3基因组DNA为对照。
将验证正确的突变体用质粒拯救法鉴定EZ-Tn5在突变体中的插入位点。提取突变体基因组DNA，根据EZ-Tn5说明书提供的多克隆酶切位点，选择EcoR Ⅰ对突变体的gDNA进行酶切。酶切产物用T4连接酶自连接，将连接产物转入E. coli Transfor Max EC100D pir+感受态细胞，在含卡那霉素(50 mg/mL)的LA平板上筛选获得单菌落；提取单菌落中的质粒，对Tn5的两端侧翼进行序列测定，所得序列与已知基因组DNA全序列比对，并在NCBI上进行BLAST分析，确定Tn5所插入的基因及插入的位点。
1.5 互补载体构建和互补突变体鉴定以辣椒溶杆菌X2-3基因组DNA为模板，clp-F/clp-R为引物扩增LC_clp基因完整序列，再连接pEASY-Blunt-Simple，经PCR验证得到重组质粒pEASY-clp；用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ从重组质粒中将-clp-切下，连接到表达载体pBBR1-MCS5，经酶切验证获得质粒pBBR1-clp。将质粒pBBR1-clp电转入M356感受态细胞，经含庆大霉素(500 μg/mL)的NA平板筛选、从抑菌活性明显恢复的突变体中提取质粒进行酶切验证，同时利用引物clp-F/clp-R对抑菌活性明显恢复的突变体进行菌落PCR验证，获得互补突变体。
1.6 野生株、突变株和互补菌株的抑菌活性测定采用平板对峙法测定突变体及野生株的抑菌活性。将活化的X2-3及突变体M356和MCS28在NA培养基培养，分别调节菌体浓度至OD600为1.0，分别取2 μL菌液滴于PDA平板，28 ℃静置培养2 d；将待测病原菌的菌饼接种于平板中央，28 ℃继续培养5 d，观察并记录各菌株对病原菌的抑菌圈直径。以抑菌圈直径大小评价不同菌株的抑菌能力，试验重复3次。
1.7 抗菌物质的提取及活性测定参考文献[12]的方法提取X2-3和突变株的胞外抗菌物质。挑取X2-3和M356的单菌落，分别接种至50 mL NB培养液，28 ℃、220 r/min振荡培养24 h作为种子液；按0.5%的接种量将种子液分别转接到融化后冷却的1/10 TBS培养基、混匀，然后倒平板；待培养基凝固后，放入28 ℃倒置培养4 d；将培养好的培养基切成小块分装于玻璃瓶中，用乙酸乙酯-甲醇-冰乙酸(80:15:5)浸提，每次12–14 h；合并3次的浸提液，用滤纸过滤去除培养基残渣，滤液经38 ℃减压浓缩后，用乙酸乙酯和水按照1:1的体积比进行萃取，直至水相无色；合并萃取液，38 ℃减压浓缩得到黄褐色粉状物，即为抑菌物质的粗提物。
粗提物用甲醇溶解，并用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)对抑菌物质进行分析：使用注射器将20 μL的粗提物缓缓注入Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×250 mm) 5 μm的色谱柱进行洗脱，流动相A为三氟乙酸(TFA)水溶液(浓度0.005 mol/L)，流动相B为乙腈(含0.005 mol/L TFA)，柱温为25 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为318 nm。检测程序见表 3。
表 3. HPLC的检测程序
Table 3. The testing procedures of HPLC
| t/min | Mobile phase A/% | Mobile phase B/% |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 75 | 25 |
| 25 | 20 | 80 |
| 26 | 0 | 100 |
| 28 | 0 | 100 |
| 29 | 95 | 5 |
| 30 | 95 | 5 |
收集各菌株在洗脱时间19.6–24.0 min的洗脱液，经旋转蒸发浓缩后，用灭菌水溶解浓缩液，并对浓缩液进行0、10、50和100倍稀释。然后在12孔板中加入1 mL融化的PDA培养基和500 μL梯度洗脱稀释液，混匀，待培养基凝固后，将相同直径大小的Fps接种于平板中央，28 ℃培养2 d。以无菌水同样处理作对照。观察并记录Fps的直径大小作为衡量洗脱液对Fps的抑菌活性。
1.8 野生株、突变株和互补菌株的胞外酶测定平板法测定各菌株的蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶产生能力。将活化的X2-3、M356和MCS28调节菌体浓度至OD600为1.0，分别取2.5 μL菌液滴于检测培养基平板中央，28 ℃静置培养3 d，观察并记录各菌落周围透明圈直径，以透明圈直径大小评估胞外酶产生能力。试验重复3次。
1.9 荧光定量PCRTrizol法提取菌株X2-3和M356的RNA，参考PrimeScriptTM RT Regent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)说明反转录合成cDNA用于Real-time PCR分析。待测基因包括GntR、MerR和TfoX family等转录调控因子或调节蛋白基因(LC4356、LC4969和LC-4649)、与次生代谢相关的基因(LC1573、LC1572、LC0893、LC0895和LC5068)和胞外酶相关基因(LC0231、LC3538和LC4408)，以16S rRNA为内参基因。各基因的详细信息见表 2。荧光定量PCR用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNase H Plus) RR820A (TaKaRa)进行分析。反应体系为2×SYBR Green pro Taq/10 μL，Primer F/R各0.4 μL，cDNA/2 μL，RNase-free H2O补足总体积为20 μL。试验重复3次。
1.10 数据统计与分析试验数据用Excel和SPSS软件进行统计与分析。每种处理的条形图上的不同字母表示通过Duncan的多重范围检验在P < 0.05处存在显著差异，试验重复3次。
2 结果与分析 2.1 突变体的筛选和验证 2.1.1 插入突变体的筛选和验证首先将EZ-Tn5转座子转入辣椒溶杆菌X2-3感受态细胞中，共获得5 000多个具有卡那霉素抗性的阳性单克隆，以Fps为指示菌，筛选得到5株对Fps抑菌活性完全消失的突变株(图 1A)。
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| 图 1 突变体筛选及PCR验证 Figure 1 Mutant selection and certification using PCR method. A: antimicrobial activity of wide-type X2-3 and mutant M356 against F. pseudograminearum. a: wide-type X2-3; b: F. pseudograminearum; c: mutant M356. B: PCR certification of mutants. 1: X2-3; 2–4: mutants. |
分别提取菌株X2-3和突变株的基因组DNA，利用引物R6kF1/KanR进行PCR扩增，验证EZ-Tn5的特定序列，发现在突变体中均能扩增到与特定序列长度一致的1 044 bp大小的条带(图 1B)，而在X2-3中未能扩增相应大小的条带，说明突变体的基因组DNA中成功插入了EZ-Tn5转座子。
2.1.2 突变体插入基因分析利用质粒拯救技术，对5株突变株中Tn5的插入位点及其所在基因进行分析，发现其中的2个突变株(编号分别为M356和M1528)中Tn5的插入位点都位于X2-3全基因组(GenBank登录号：LBMI00000000.1)中编号为LC3106的基因上。BLAST分析发现，该基因全长840 bp，编码Clp转录因子，预测的该基因编码蛋白与功能明确的产酶溶杆菌C3 (ID：CP013140.1)和产酶溶杆菌OH11 (ID：MG851700.1)中Clp氨基酸测序相似性均为98.92%。结构功能域分析发现，该预测蛋白有2个重要的结构域，即Clp蛋白保守的HTH/DNA结合域和cNMP结合域(图S1)。本研究选择M356进行进一步分析。
2.1.3 互补突变体的筛选和验证重组载体pBBR1-clp转化突变体M356感受态细胞后，经PCR验证，发现互补菌株MCS28中扩增到大小分别为2 841 bp和840 bp的条带，分别与突变体M356中的EZ-Tn5-clp和互补载体pBBR1-clp中clp基因片段的大小一致，而在野生株X2-3中只能扩增到840 bp左右的条带，在突变体M356中只能扩增到与EZ-Tn5-clp大小一致的2 841 bp左右的条带(图 2)。表明互补突变体正确，命名为MCS28。
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| 图 2 互补菌株MCS28菌落PCR验证 Figure 2 PCR products of complementary strain MCS28. M: 2K plus marker; 1–2: wild-type; 3–4: mutant M356 X2-3; 5: complementary strain MCS28. |
2.2 突变体抑菌活性及抑菌物质测定 2.2.1 突变体抑菌活性测定
利用平板对峙法分析了野生株X2-3、突变株M356和互补菌株MCS28对禾谷镰孢菌、禾谷丝核菌、立枯丝核菌、尖孢镰孢菌、假禾谷镰孢菌和烟草疫霉等菌株的抑菌活性，结果如图 3。突变体M356对病原真菌和卵菌的抑菌活性完全丧失，而MCS28的抑菌活性基本恢复到了野生株水平，表明LC_clp基因的突变使X2-3丧失了对病原真菌和卵菌的抑菌活性。
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| 图 3 菌株对不同病原菌的抑菌活性测定 Figure 3 Antimicrobial activity of strains against different pathogens. a: wild-type X2-3; b: mutant M356; c: complementary strain MCS28. |
2.2.2 突变体抗菌物质分析
为了解突变株M356抑菌活性的丧失是否与其抗菌物质合成减少有关，采用液相色谱法比较分析了粗提物中的成分变化，结果表明，与X2-3相比，M356萃取物中明显缺少保留时间为19.61–24.00 min之间的吸收峰(图 4A)。
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| 图 4 反向液相色谱分析及抑菌活性检测 Figure 4 Antimicrobial activitys and analysis of RP-HPLC. A: results of liquid chromatography; B: results of antibacterial activity of eluent fractions. Dilution factor: a: 0; b: 10; c: 50; d: 100. |
为明确该时段的洗脱液是否有抗菌活性，收集了19.61–24.00 min的洗脱液，梯度稀释后，用12孔板检测了不同稀释液对Fps的抑菌活性，发现X2-3中该吸收峰对应的洗脱液具有明显的抑菌活性，而M356中的该组分完全丧失了对病原菌的抑菌活性(图 4B)，这些结果表明clp基因的突变使X2-3失去抗菌物质的产生能力，因而使菌株丧失了对病原菌的抑菌活性。
2.2.3 菌株胞外酶产生能力测定对突变体和野生株的胞外酶检测发现，与X2-3相比，突变体M356在蛋白酶和纤维素酶检测平板上产生的水解圈明显减小(图 5A，5B)，在几丁质酶检测平板上，突变体M356几乎不产生透明水解圈(图 5C)，说明LC_clp基因的突变使M356产蛋白酶和纤维素酶的能力明显减弱，产几丁质酶的能力几乎完全丧失，而互补菌株MCS28产生蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶的能力基本恢复到野生株水平。这些结果表明，LC_clp基因的突变，不仅影响抗菌物质的产生，而且对X2-3的胞外酶产生有调节作用。
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| 图 5 各菌株的胞外酶活性 Figure 5 Extracellular enzyme activity of each strains. A: protease; B: cellulase; C: chitinase. a: wild-type X2-3; b: mutant M356; c: complementary strain MCS28. |
2.3 荧光定量PCR分析
荧光定量PCR法分析了突变体与野生株中转录调控因子、次生代谢相关基因及胞外酶基因的表达情况，结果发现，突变体M356中，转录因子GntR、MerR和调节蛋白TfoX (对应基因LC4356、LC4969和LC-4649)的基因表达量均显著下降，次生代谢相关基因及胞外酶基因的表达量均也显著低于野生株，尤其是与抗真菌物质合成相关的基因(基因号：LC0895)几乎不表达(图 6B)，这一结果进一步表明，LC_clp基因明显抑制了抗真菌物质的合成，从而使M356完全丧失对病原菌的拮抗活性。
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| 图 6 荧光定量PCR分析 Figure 6 Fluorescence quantitative PCR analysis. A: transcriptional regulator gene; B: secondary metabolism; C: extracellular enzymes. Different lowercase letters indicate significant difference between treatments, respectively (P < 0.05). |
3 讨论与结论
本研究分析了LC_clp基因突变体与野生株在拮抗活性、胞外酶分泌以及调控基因表达方面的差异，发现与野生株X2-3相比，M356的抑菌活性和抗菌物质的产生能力完全丧失，胞外酶产生能力显著降低；在M356中，编码转录调控因子、次生代谢和胞外酶相关基因的表达量都显著低于野生株X2-3，尤其与抗真菌物质合成相关的基因LC0895几乎不表达。表明LC_Clp是一个全局调控因子，在辣椒溶杆菌X2-3中具有多种生物学功能。
研究发现，产酶溶杆菌OH11可分泌一种大环内酰胺类抗真菌物质HSAF[13–15]，该物质对丝状真菌和卵菌具有明显的拮抗活性。HSAF能够引起细胞壁合成物质的过度积累导致菌丝形态发生卷曲、顶端肿胀和去极化生长，从而抑制病原菌的生长[16]。HSAF能够破坏链格孢菌[Alternaria alternata (Fries) Keissler]多种细胞代谢网络，诱导细胞壁厚度增加和细胞凋亡[17]。在对果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)的研究中，HSAF可以使菌丝过度分枝、肿胀和去极化生长，诱导分生孢子产生活性氧，破坏分生孢子细胞壁的完整性，抑制分生孢子萌发，干扰胞质分裂与生长[18]。我们前期对X2-3全基因组分析发现，在X2-3中存在6个PKS/NRPS基因簇，这些基因簇都与抗菌物质合成相关[3]，其中抗真菌物质合成基因簇LC0895的氨基酸序列与L. enzymogenes OH11中HSAF合成基因簇的氨基酸序列相似性为83%，预测该基因簇的合成产物可能与HSAF相似。本研究发现，LC_clp基因的突变使M356完全失去对病原真菌及卵菌的拮抗活性；利用液相色谱法分析了X2-3与M356的抗菌物质差异，发现M356中明显缺少X2-3中保留时间为19.61–24.00 min的吸收峰，活性检测发现该吸收峰所含的物质对病原菌具有明显的抑制活性。荧光定量PCR测定也发现，突变体M356中抗真菌物质合成基因LC0895几乎不表达，进一步说明LC_clp基因对抗真菌物质的合成有调控作用，但对该抗菌物质的具体成分还需进一步研究。
clp基因编码CRP家族的Clp转录因子，在细菌中调控多种生物学过程。在L. enzymogenes C3中，clp基因的突变使菌株的蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性完全丧失，几丁质酶的活性显著降低，滑动性减弱，并且失去了对终极腐霉(Pythium ultimum)的拮抗活性[19]。在L. enzymogenes OH11中，Clp可调控3种生防因子(HSAF、WAP-8294A2和胞外几丁质酶)的生物合成[20]；Clp还可作为LeDSF信号的下游调控因子控制抗菌物质的生成，同时通过LeDSF来调控几丁质酶和蛋白酶的产生以及抽搐运动[21]。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X. campestris pv. campestris)中，Clp作为一种全局调控因子，对胞外酶、胞外多糖(EPS)合成、鞭毛运动和生物膜的合成都有调节作用[22]。本研究中我们发现，LC_clp基因的插入突变，使X2-3蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶的产生能力明显减弱；荧光定量PCR结果显示，LC_clp基因能够调控多种基因的表达，包括与转录调控因子或调节蛋白基因、次生代谢和胞外酶相关的基因。此外，我们还发现LC_clp突变后，突变株运动能力显著降低，但菌株在生长和抗逆能力方面没有明显变化(图S2–S4)。这些结果表明，LC_clp基因对X2-3的多种生物学功能具有广泛的调节作用，是一个全局性的调控因子，但其具体的调控机制还需要进一步的研究。
补充材料附图 1 蛋白序列分析及功能预测
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附图 2 突变体生长能力分析
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附图 3 突变体运动能力分析
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附图 4 突变体对不同环境条件的耐受性分析
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附图 5 LC_Clp基因相对表达量测定
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