2022, Vol. 62
表1(Table 1)
山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220232
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 张传美, 李文凤, 张路宾, 刘佳卉, 单虎, 杨海燕. 2022
- ZHANG Chuanmei, LI Wenfeng, ZHANG Lubin, LIU Jiahui, SHAN Hu, YANG Haiyan.
- 山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析
- Prevalence and genotypic diversity of canine coronavirus in Shandong Province
- 微生物学报, 62(12): 4981-4991
- Acta Microbiologica Sinica, 62(12): 4981-4991
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-01
- 修回日期：2022-08-19
- 网络出版日期：2022-08-26
引用本文 |
张传美, 李文凤, 张路宾, 刘佳卉, 单虎, 杨海燕. 山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析[J]. 微生物学报, 2022, 62(12): 4981-4991.
Zhang Chuanmei, Li Wenfeng, Zhang Lubin, Liu Jiahui, Shan Hu, Yang Haiyan. Prevalence and genotypic diversity of canine coronavirus in Shandong Province[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(12): 4981-4991.
山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析
青岛农业大学动物医学院, 山东 青岛 266109
摘要：[目的] 了解分析山东地区健康犬及腹泻犬中犬冠状病毒(CCoV)的分子流行病学及其基因型。[方法] 采集2017年以来山东省宠物市场、流浪犬中心、犬舍、各地宠物医院等的健康和腹泻犬只的肛拭子样品，采用PCR方法检测CCoV及其CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ (CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb)基因分型情况，并对扩增出的M、S全基因进行测序分析。[结果] 199份样品中，共检出CCoV阳性样品79份，健康犬中的检出率为40.2% (33/82)，腹泻犬中的检出率为39.3% (46/117)。健康犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为78.8% (26/33)和51.5% (17/33)；腹泻犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为39.13% (18/46)和80.4% (37/46)。基因型阳性比率分析表明，健康犬中单独感染CCoV-I型的比率最高，为48.5% (16/33)；腹泻犬中单独感染CCoV-Ⅱa比率最高，为47.8% (22/46)。测序分析获得48株M基因序列，遗传进化分析表明，12株CCoV-Ⅰ型毒株中除1株外，其余均从健康犬中分离。36株CCoV-Ⅱ型毒株中除7株来自健康犬外，其余均为腹泻犬中获得。获得的3株S全基因均来自腹泻犬且均属于CCoV-Ⅱa亚型。[结论] 山东地区犬群中CCoV检出率较高，说明CCoV广泛流行，健康犬和腹泻犬中均存在多重感染情况，健康犬中主要流行CCoV毒株为CCoV-Ⅰ型，腹泻犬中主要流行CCoV-Ⅱa型。
关键词：犬冠状病毒 基因型 M基因 S基因 序列分析
Prevalence and genotypic diversity of canine coronavirus in Shandong Province
College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China
Abstract: [Objective] To learn the prevalence and genotypic diversity of canine coronavirus (CCoV) in healthy and diarrhea dogs in Shandong Province. [Methods] We collected 199 anal swabs from healthy and diarrhea dogs in pet markets, stray dog centers, kennels, and pet hospitals in Shandong Province since 2017. CCoV was detected and genotyped by PCR method, and then the amplified M and S genes were sequenced and analyzed. [Results] Among the 199 anal swabs, 79 were CCoV-positive. The positive rate of CCoV was 40.2% (33/82) in healthy dogs and 39.3% (46/117) in diarrhea dogs. The positive rates of CCoV-Ⅰ and CCoV-Ⅱ were 78.8% (26/33) and 51.5% (17/33) in healthy dogs, and 39.13% (18/46) and 80.4% (37/46) in diarrhea dogs, respectively. CCOV-Ⅰ had the highest single infection rate (48.5%, 16/33) in healthy dogs, while CCoV-Ⅱ had the highest single infection rate (47.8%, 22/46) in diarrhea dogs. The M gene sequences of 48 strains were determined by sequencing analysis. Phylogenetic analysis showed that 11 out of the 12 CCoV-Ⅰ strains were isolated from healthy dogs. Among the 36 CCoV-Ⅱ strains, 7 strains were isolated from healthy dogs and the rest from diarrhea dogs. The 3 strains with whole S gene and obtained from diarrhea dogs all belonged to CCoV-Ⅱ. [Conclusion] The high positive rate of CCoV in the dogs in Shandong Province indicates that the virus is widely prevalent. Multiple infections exist in both healthy and diarrhea dogs. The main prevalent CCoV type is CCoV-I in healthy dogs and CCoV-Ⅱa in diarrhea dogs.
Keywords:
canine coronavirus genotype M gene S gene sequence analysis
犬冠状病毒(canine coronavirus，CCoV)是一类有囊膜、单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae) α冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员，与猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)、猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)同属于α冠状病毒属中的α冠状病毒属-1种。临床上主要引起犬、貉和狐等犬科动物呕吐、腹泻等胃肠炎症状的犬冠状病毒病，通常只引起温和性腹泻，致死率较低[1]。
CCoV包括4种结构蛋白：纤突蛋白(spike protein，S)、膜蛋白(membrane protein，M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)和小膜蛋白(small envelope protein，E)，M蛋白是构成病毒囊膜的主要成分，是病毒颗粒中数量最多的膜蛋白，相对保守，但同样也可发生变异，该变异可能与病毒对宿主的免疫逃避有关[2]。M蛋白的基因序列在CCoV感染前、后可发生改变，感染前其基因序列与CCoV毒株类似，而感染后序列则与猫冠状病毒更相近[3]。Pratelli等[4]根据M基因的不同，基于它们与FCoV-I型的同源性，“FCoV样CCoV”被命名为CCoV-I型，经典CCoV参考株则称为CCoV-II型[5]。S蛋白是决定病毒抗原性和诱导中和抗体的重要蛋白，是病毒组织嗜性和致病性的重要决定因素，与特定的细胞受体结合，在病毒感染过程、细胞间传播和决定组织嗜性方面起重要作用，在分析流行毒株的流行趋势和遗传变异中具有重要的进化意义[6]。基于S蛋白N端结构域(N-terminal domain，NTD)的不同，CCoV-II型又被分为CCoV-IIa和CCoV-IIb 2种亚型，CCoV-Ⅱa具有CCoV样NTD，CCoV-Ⅱb具有TGEV样NTD。CCoV-I型和CCoV-Ⅱ型都可引起犬肠道冠状病毒病，且2种CCoV基因型可在同一只犬中共存，从而可能发生同源重组[7]。2005年，意大利首次发现了幼犬全身性疾病和高死亡率的致病变种泛嗜性犬冠状病毒(pantropic canine coronavirus，CB/05毒株)，到目前为止鉴定的泛嗜性犬冠状病毒都属于CCoV-IIa亚型[8–11]。因此了解CCoV感染的基因型至关重要。
本研究通过采集2017年以来山东省宠物市场、流浪犬中心、犬舍、各地宠物医院等的健康和腹泻犬只的肛拭子样品，进行CCoV检测、基因分型和M、S基因的遗传进化分析，明确本地区CCoV流行情况和主要流行的基因型，为犬冠状病毒病的防控及相关研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料DMEM培养基(Sigma)；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(杭州博日)；HiScript® II One Step RT-PCR Kit (南京Vazyme)；MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 (TaKaRa)；Prime Script™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)；Prime STAR® HS DNA Polymerase (TaKaRa)。
1.2 临床样品的采集及处理2017年以来采集山东省宠物市场、流浪犬中心、犬舍、各地宠物医院等健康犬和腹泻犬的肛拭子样品共计199份。健康犬样品共计82份(其中宠物市场24份，流浪犬中心23份，犬舍35份)，以精神良好且无腹泻症状为标准；腹泻犬样品共计117份(均来自各地宠物医院)，为有腹泻症状的患犬。采集的样品用DMEM培养基稀释混匀，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清至1.5 mL离心管中，编号，−80 ℃保存待检。
1.3 引物的合成参照文献发表的引物序列(表 1)，利用引物CCoV-CENP1F/R扩增犬冠状病毒部分N基因，用于临床样品的PCR检测；引物CCoV-ⅠF/R、CCoV-ⅡF/R、CCoV-Ⅱa F/R、CCoV-Ⅱb F/R用于犬冠状病毒分型检测；CCoV-M F/R用于扩增犬冠状病毒M全基因；分段引物CCoV-S1F/R、CCoV-S2F/R、CCoV-S3F/R用于扩增犬冠状病毒S1、S2、S3基因，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。
表 1. 引物序列
Table 1. Sequence of the primers
| Primer | Sequence (5′→3′) | Length/bp | Reference |
| CCoV-CENP1F | CTCGTGGYCGGAAGAATAAT | 280 | [12] |
| CCoV-CENP1R | GCAACCCAGAMRACTCCATC | ||
| CCoV-ⅠF | CAAGTTGACCGTCTTATTACTGGTAG | 346 | [4] |
| CCoV-ⅠR | TCATATACGTACCATTATAGCTGAAGA | ||
| CCoV-ⅡF | TGCATTTGTGTCTCAGACTT | 694 | [4] |
| CCoV-ⅡR | CCAAGGCCATTTTACATAAG | ||
| CCoV-ⅡaF | GGCTCTATCACATAACTCAGTCCTAG | 758 499 |
[13] [13] |
| CCoV-ⅡaR CCoV-ⅡbF CCoV-ⅡbR |
GCTGTAACATAKTCRTCATTCCAC GGCTCTATCACATAACTCAGTCCTAG CAACATGTAACCTTTGTCTGTGATC |
||
| CCoV-MF | CTCGTGGYCGGAAGAATAAT | 835 | [14] |
| CCoV-MR | GCAACCCAGAMRACTCCATC | ||
| CCoV-S1F | ATGATTGTGGTTACATTGTGCC | 1 640 | [15] |
| CCoV-S1R | CCTCTACGCTTCATACCAAGAT | ||
| CCoV-S2F | TCTTGGTATGAAGCGTAG | 1 581 | [15] |
| CCoV-S2R | TATCTGCTGGTTCTTGTTC | ||
| CCoV-S3F | GAACTGTTAGATCTAACACATTGGA | 2 080 | [15] |
| CCoV-S3R | CCGAATTCAGTGAACATGC |
1.4 临床样品的RT-PCR检测及分型
使用杭州博日公司的Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒提取样品中病毒RNA，以提取的样品RNA为模板，使用引物CCoV-CENP1F/R、CCoV-ⅠF/R、CCoV-ⅡF/R、CCoV-Ⅱa F/R、CCoV-Ⅱb F/R，用HiScript® II One Step RT-PCR Kit进行一步法RT-PCR扩增，扩增结束后，对PCR产物进行凝胶电泳，电压150 V，电泳20 min，凝胶成像仪观察并记录结果。
1.5 S、M全基因的扩增、测序及序列分析按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书提取样品中病毒RNA，使用Prime Script™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录后进行PCR扩增S1、S2、S3基因和M基因，PCR鉴定为阳性的产物交由青岛擎科梓熙公司测序，并进行序列拼接。将获得的S、M基因序列分别与GenBank中参考序列比较(表 2)。利用DNAStar软件对获得序列的核苷酸翻译成氨基酸后进行同源性比较。并用MEGA7软件采用邻位相邻法(neighbor-jioning)，bootstrap设置1 000次重复，绘制系统进化树。
表 2. 引用毒株序列一览表
Table 2. Isolates used in this study
| Virus | Accession No. | Country | Year | Host | Genotype |
| CCoVK378 | KC175340 | USA | 1978 | Canine | Ⅱ |
| CCoVINSAVC-1 | D13096 | UK | 1992 | Canine | Ⅱ |
| CCoVBGF10 | AY342160 | UK | 2003 | Canine | Ⅱ |
| CCoVCB/05 | KP981644 | Italy | 2005 | Canine | Ⅱ |
| CCoV1-71 | JQ404409 | Germany | 1971 | Canine | Ⅱ |
| CCoV/TN-449 | JQ404410 | USA | 1980s | Canine | Ⅱ |
| CCoV/fc1 | AB781790 | Japan | 2013 | Canine | Ⅱ |
| CCoV/NTU336 | GQ477367 | Taiwan, China | 2008 | Canine | Ⅱ |
| CCoV430/07 | EU924790 | Italy | 2007 | Canine | Ⅱ |
| CCoV174/06 | EU856362 | Italy | 2006 | Canine | Ⅱ |
| CCoV341/05 | ACJ63236 | Italy | 2008 | Canine | Ⅱ |
| CCoV68/09 | HQ450377 | Greece | 2010 | Canine | Ⅱ |
| CCoV/HCM47 | LC190907 | Viet Nam | 2015 | Canine | Ⅱ |
| CCoV/NJ17 | AY704917 | China | 2004 | Canine | Ⅱ |
| FCoVUU20 | HQ392471 | Netherlands | 2007 | Feline | Ⅰ |
| FCoVUU31 | HQ012371 | USA | 2008 | Feline | Ⅰ |
| FCoVDF-2 | JQ408981 | USA | 1981 | Feline | Ⅱ |
| CCoV23/03 | KP849472 | Italy | 2003 | Canine | Ⅰ |
| CCoV259/01 | AF502583 | Italy | 2003 | Canine | Ⅰ |
| TGE Purdue | DQ811789 | USA | 1952 | Porcine |
2 结果与分析 2.1 临床样品PCR检测结果
RT-PCR扩增后得到约280 bp的DNA片段，与目的基因大小一致且无非特异性扩增(图 1)。结果表明，199份样品中，共检出79份阳性样品，健康犬中CCoV的检出阳性样品33份，检出率为40.2% (33/82)，腹泻犬中CCoV阳性样品46份，检出率为39.3% (46/117)。
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| 图 1 CCoV RT-PCR扩增结果 Figure 1 RT-PCR result of CCoV. M: DNA marker DL2000; −: negative control; lanes 1−4: clinical samples. |
2.2 健康犬与腹泻犬中CCoV分型结果
CCoV阳性样品的RT-PCR检测，得到CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb目的片段分别为346、694、758和499 bp，条带大小均与预期一致(图 2)。CCoV分型结果表明，健康犬和腹泻犬中均存在多重感染的情况，健康犬中CCoV-Ⅰ型阳性检出率为78.8% (26/33)，CCoV-Ⅱ型阳性检出率为51.5% (17/33)，其中CCoV-Ⅱa阳性检出率为51.5% (17/33)，CCoV-Ⅱb阳性检出率为15.2% (5/33)；腹泻犬中CCoV-Ⅰ型阳性检出率为39.13% (18/46)，CCoV-Ⅱ型阳性检出率为80.4% (37/46)，其中CCoV-Ⅱa阳性检出率为80.4% (37/46)，CCoV-Ⅱb阳性检出率为19.6% (9/46) (图 3)。
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| 图 2 CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb基因型RT-PCR扩增结果 Figure 2 RT-PCR results of CCoV-Ⅰ, CCoV-Ⅱ, CCoV-Ⅱa and CCoV-Ⅱb. M: DNA marker DL2000; lanes 1−7: samples; −: negative control. |
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| 图 3 CCoV各基因型和亚型的阳性样品数及其比率 Figure 3 Number of positive samples and frequency of CCoV genotypes/subtypes. |
CCoV各基因型的阳性样品数和比率分析结果表明，健康犬中单独感染CCoV-I型的比率最高，为48.5% (16/33)；腹泻犬中单独感染CCoV-Ⅱa比率最高，为47.8% (22/46) (图 3)。本研究中，在健康犬和腹泻犬中均未发现单独感染CCoV-Ⅱb和CCoV-I/CCoV-Ⅱb混合感染的病例，但均检测到CCoV-I/CCoV-Ⅱa/CCoV-Ⅱb三重感染病例。
2.3 CCoV的S、M全基因同源性分析通过RT-PCR扩增得到CCoV的S1、S2、S3的目的片段分别为1 640、1 581和2 080 bp，M全基因扩增目的条带为835 bp，条带大小均与预期一致且无非特异性扩增(图 4)。
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| 图 4 CCoV M和S基因RT-PCR扩增结果 Figure 4 RT-PCR results of CCoV M and S gene. A: M: DNA marker DL2000; lanes 1−5: positive samples; −: negative control. B: M: DNA marker DL5000; lane 1: S1 segment 1 640 bp; lane 2: S2 segment 1 581 bp; lane 3: S3 segment 2 080 bp. |
测序后获得3条4 362 bp的S全基因序列和48条全长为798 bp的M全基因序列，根据核苷酸序列推导出其相应氨基酸序列。应用DNAStar软件对所测序列与国内外FCoV、CCoV、TGEV参考毒株进行同源性比较。结果如图 4所示，48株CCoV毒株M基因之间及与国内外参考株之间氨基酸同源性较高；3株CCoV毒株S基因氨基酸同源性与CCoV-Ⅱ型和FCoV-Ⅱ型参考株之间氨基酸同源性较高(分别为82.3%–95.8%和92.4%–93.9%)，与CCoV-Ⅰ型和FCoV-Ⅰ型参考株之间氨基酸同源性较低(47.8%–47.9%和46.2%–47.3%)，但与TGEV参考株(DQ811789)之间氨基酸同源性也较高(81.2%–82.2%) (图 5)。
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| 图 5 CCoV M、S全基因同源性分析 Figure 5 Homology analysis of M and S gene. |
2.4 CCoV的M、S全基因的遗传进化分析
根据GenBank中的参考序列，利用MEGA7软件绘制系统进化树。获得3株S全基因(MT166674、MT166675、MT166676)，进化树分析显示，3株腹泻犬CCoV阳性毒株均属于CCoV-Ⅱa亚型，形成一个相对独立的分支，与日本流行株CCoV/fc1呈现较近亲缘关系(图 6)。
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| 图 6 CCoV S基因遗传进化分析 Figure 6 Phylogenetic analysis of S gene of CCoV. ● represent the CCoV strains identified from diarrhea in this study; genetic distances were constructed using p-distance model; horizontal bar: genetic distance of 0.1. |
获得48株M基因(MT136057−MT136104)，遗传进化分析显示，其中12株CCoV-Ⅰ型毒株形成C1和C2两个独立的亚群，C1亚群形成一个独立的分支，与当前国内外流行毒株遗传关系较远；C2亚群与2株意大利参考株亲缘关系较近；12株CCoV-Ⅰ型毒株中除1株(QAUD019)外，其余均从健康犬中分离。36株CCoV-Ⅱ型毒株分为C1、C2和C3三个亚群，C1亚群中，3株QAUD093、QAUD162和QAUD075毒株位于一个相对独立的分支中，QAUD003等30株毒株与中国和越南流行毒株亲缘关系较近；QAUH056、QAUH058和QAUH062位于C3亚群，与美国流行毒株CCoV/TN-449遗传关系较近；36株CCoV-Ⅱ型毒株中除7株(QAUH059等)来自健康犬外，其余均为腹泻犬中获得(图 7)。
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图 7 CCoV M基因遗传进化分析 Figure 7 Phylogenetic analysis of M gene of CCoV.   |
3 讨论
20世纪80年代我国开始有犬冠状病毒性肠炎的报道[16]，后陆续有警犬、家犬感染CCoV的报道，但多数报道并未进行基因分型和混合感染的研究。王玉燕[15]报道2003–2004年采集的138份犬粪便样品中，CCoV-Ⅱ在健康犬和腹泻犬的检测阳性率分别为86.42% (70/81)和43.75% (21/48)，未检测到CCoV-I。王欣宇等[17]报道，2014‒2015年期间黑龙江地区腹泻犬CCoV阳性样品中同时存在CCoV-I、CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb多种基因型，CCoV-I占15.79% (9/57)，CCoV-Ⅱ占84.21% (48/57)，其中CCoV-Ⅱa型为优势亚型。孙秋艳等[18]对山东地区的腹泻犬846份粪便样品进行CCoV的分离鉴定，共鉴定出CCoV 349份，检出率为41.25%，与本研究结果基本符合。本研究中，采自山东地区的199份犬肛拭子样品中检出79份阳性样品，检出率为39.7%；检出的33份健康犬和46份腹泻犬CCoV阳性样品基因型分型结果显示，健康犬中主要流行毒株为CCoV-Ⅰ型，单独感染居多；腹泻犬中主要流行毒株为CCoV-Ⅱa型，各基因型及其亚型混合感染多。但本研究在健康犬和腹泻犬中均未发现CCoV-Ⅱb单独感染和CCoV-I/CCoV-Ⅱb混合感染病例，却在健康犬和腹泻犬中都检测到CCoV-I/CCoV-Ⅱa/CCoV-Ⅱb三重感染，这一现象有待于进一步研究。
国外多个国家研究也表明，犬中存在CCoV多种基因亚型的感染，Ntafis等[13]报道，希腊腹泻犬CCoV阳性样品中47%检测到一种以上基因型；Van Nguyen等[19]报道，在越南腹泻犬中CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb均有检测到；Moutinho Costa等[20]的研究指出，巴西腹泻犬CCoV阳性样品中有7%检测到多种基因型；Cavalli [21]研究报道，阿尔巴尼亚腹泻犬CCoV阳性样品主要流行毒株为CCoV-Ⅱa；Decaro等[22]报道，意大利腹泻犬中有21.8%混合感染。且近年来发现的泛嗜性犬冠状病毒可引起犬的高致病性和高病死率，其基因型为CCoV-Ⅱa，在意大利、法国、比利时、巴西等地区均有报道，且有全球流行趋势。以上数据显示，CCoV虽只引起温和性腹泻，较易痊愈，但随着CCoV-Ⅱa亚型的流行和混合感染的加重，CCoV的感染可能会出现越来越严重的趋势，应引起高度重视[23]。
本研究对M蛋白全基因遗传进化分析显示，健康犬主要携带CCoV-Ⅰ型病毒，腹泻犬主要为CCoV-Ⅱ型感染；S基因进一步分析显示，犬腹泻原因可能与CCoV-Ⅱa感染有密切的关系。CCoV-Ⅰ型毒株7株和CCoV-Ⅱ型毒株3株位于一个相对独立的分支中，与其他病毒株遗传关系较远，可能会形成流行毒株群，需要更多的分子流行病学数据来验证。36株M基因CCoV-Ⅱ型毒株之间氨基酸同源性为96.9%−100.0%，该结果表明CCoV-Ⅱ型毒株在山东地区具有稳定遗传性，与遗传进化分析结果一致。本研究自腹泻犬中获得的3株CCoV毒株S基因之间氨基酸同源性为97.2%−99.8%，遗传进化分析表明，与日本参考株CCoV/fc1呈现较近亲缘关系，这与王静等[24]报道的北京分离株CCoV BJ02株与日本该毒株位于一分支，有较近亲缘关系的结论一致。
4 结论山东地区犬群中CCoV检测率较高，说明CCoV广泛流行，健康犬中主要流行毒株为CCoV-Ⅰ型，腹泻犬中主要流行毒株为CCoV-Ⅱa型。健康犬和腹泻犬中均存在CCoV的多重感染情况，首次发现CCoV-I/CCoV-Ⅱa/CCoV-Ⅱb三重感染。遗传进化分析表明，CCoV-Ⅰ型和CCoV-Ⅱ型毒株均存在相对独立分支，预测可能会形成新的流行毒株。
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