2022, Vol. 62中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 赵丽君, 谢珂, 杨江科, 雷磊. 2022
- ZHAO Lijun, XIE Ke, YANG Jiangke, LEI Lei.
- 海洋细菌粪产碱菌J481中DMS趋化受体的鉴定
- Identification of DMS receptors in the marine Alcaligenes faecalis J481
- 微生物学报, 62(12): 5029-5042
- Acta Microbiologica Sinica, 62(12): 5029-5042
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-06
- 修回日期：2022-05-19
- 网络出版日期：2022-07-26
引用本文 |
二甲基硫醚(dimethylsulfide, DMS)及其前体β-二甲基巯基丙酸(β-dimethylsufoniopropionate, DMSP)是海洋中最重要的硫化合物[1]。DMSP由海洋中的浮游植物合成，每年产生约109t[2]。在DMSP裂解酶的催化作用下，DMSP形成挥发性气体二甲基硫醚，DMS的大气氧化产物可形成气溶胶，增加大气云凝结核数量，提高云层对太阳光的反射率，使全球热量收入减少。此外，DMS及其硫化合物在高空中的浓度会影响降水量，使得地表气候和温度发生变化。该反应是全球硫元素循环以及气候观测模型中的重要组成部分[3]。DMSP裂解酶广泛存在于细菌、藻类、甚至珊瑚虫等不同海洋生物中。同时，海洋生物裂解DMSP并且释放DMS这一生物化学反应在地球化学循环以及全球气候监测模型中起着重要的作用，但是对于该反应对于海洋生物的生物学功能，目前尚不明朗。Curson等[4]在海洋细菌中发现，DMSP合成途径的关键基因dsyB以及DMSP裂解酶dddL基因的表达水平，在一些胁迫条件下有着显著提高，但是2个基因的缺失突变株与野生型菌株相比较，并未表现出明显的表型差异。这些研究表明，DMSP及其裂解产物DMS的生物学功能目前并不明朗，仍然需要进一步的探索。
De Souza等分离出一株来自海洋环境的粪产碱菌J481，能够以DMSP为唯一碳源生长[5]，且含有一个DMSP裂解酶基因dddY。dddY基因编码的产物定位于细胞周质空间中，是目前为止已知活性最高的DMSP裂解酶[6]。然而，其缺失突变株仍然可以利用DMSP为唯一碳源生长[5]，这预示着该裂解酶不是DMSP代谢途径的组成部分。Zimmer-Faust等在另一篇工作中指出，粪产碱菌J481能够表现出对DMSP的趋化反应，且该反应依赖DMSP裂解酶基因的表达[7]。细菌利用趋化作用感应环境中的化学浓度梯度，从而朝有利于自身生长的环境方向运动。趋化受体与信号化合物结合后，会引发MCP发生结构变化，从而引起胞内结构域被甲基化[8]，随后影响下游一系列的变化，最终引起鞭毛挥动。细菌以趋化作用这种方式使得自身沿着趋化因子的浓度梯度来移动[8]。
综上所述，粪产碱菌对DMSP的趋化作用依赖于DMSP裂解酶的诱导表达，这意味着DMSP裂解酶及其催化产物DMS在趋化作用中有重要作用[9]。本文探究了ΔdddY在软琼脂趋化平板上的趋化作用表型；何种趋化效应物引发了粪产碱菌J481对DMSP趋化作用；并对粪产碱菌J481进行了全基因组测序以及深度挖掘，从中找出8个候选趋化作用受体基因，从这8个基因中鉴定出识别DMS的趋化受体基因。这为解释海洋细菌对DMSP趋化作用过程中，DMS作为信号分子与受体相互作用奠定了基础，并对以后阐明其分子水平机制提供了理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒本研究所用供试菌株和质粒见表 1。
| Strains/Plasmids | Characteristic | Source |
| Alcaligenes faecalis J481 | Wild type, Rifr | Gift from Andy Johnstone (UEA) |
| pJQ200SK | Mutant strains construction vector, Gmr | This lab |
| E. coli DH5α | Host of recombinant plasmids | This lab |
| ΔdddY* mut | DddY deletion mutant | Gift from Andy Johnstone (UEA) |
| ΔcheY* mut | CheY deletion mutant | Gift from Dan Tawfik Lab (WIS) |
| Rif: rifampicin; Gm: gentamicin; *: ΔdddY* mut is DMSP lyase gene deletion mutant. ΔcheY* mut is a chemotaxis regulatory protein deletion mutant. | ||
1.1.2 主要试剂、试剂盒和感受态
限制性内切酶购自江苏愚公生命公司，PCR反应相关试剂购自诺唯赞公司，PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Omega，无缝克隆试剂盒(Seamless Assembly Cloning Kit)购自中美泰和生物，抗生素培养基相关组分等分子生物学常规药品购自中国国药集团，使用浓度为庆大霉素25 μg/mL，利福平25 μg/mL。研究所用PCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。pJQ200SK使用BamH I和Not I进行双酶切；琼脂购于赛国生物科技(用于软琼脂平板)。
1.1.3 引物本研究所用引物见表 2。
| ID of primers | Sequences of primers (5′→3′) | Characteristic |
| 01015L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTATTCGTAGTGGCGGATGT | The forward primer of L-01015 exchange fragment |
| 01015L-anti | TGAGCCTGTTTTTAGTCCTGGCGGCCAATACGTGCCATAG | The reverse primer of L-01015 exchange fragment |
| 01015R-sense | CTATGGCACGTATTGGCCGCCAGGACTAAAAACAGGCTCA | The forward primer of R-01015 exchange fragment |
| 01015R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTTAGCTTTTACGTGACGATA | The reverse primer of R-01015 exchange fragment |
| 05705 L-sense | ATCGAATTCCTGCAGGATCCTTAATTACCAAATTGCTTTA | The forward primer of L-05705 exchange fragment |
| 05705L-anti | CCCAAAGCCTGGGGTTCTAATATAGAGCCCTTCCCTTTATCGTTTT | The reverse primer of L-05705 exchange fragment |
| 05705R-sense | AAAACGATAAAGGGAAGGGCTCTATATTAGAACCCCAGGCTTTGGG | The forward primer of R-05705 exchange fragment |
| 05705R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTTAACCGTCGTGGCCTGCAG | The reverse primer of R-05705 exchange fragment |
| 12910 L-sense | ATCGAATTCCTGCAGGATCCATGGAACATGCACGATGCGT | The forward primer of L-12910 exchange fragment |
| 12910 L-anti | ACGCGAGGTGGCACCATTTAATTCCCCGAACAACACTGAA | The reverse primer of L-12910 exchange fragment |
| 12910 R-sense | TTCAGTGTTGTTCGGGGAATTAAATGGTGCCACCTCGCGT | The forward primer of R-12910 exchange fragment |
| 12910 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCCTACTTCTTGTCCTCGACCG | The reverse primer of R-12910 exchange fragment |
| 17300 L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCATGAGCTCCGGCGTAGATCT | The forward primer of L-17300 exchange fragment |
| 17300 L-anti | CCACAGATGTGCTCATATAGTCCTTCAAGGACCCGGTAAA | The reverse primer of L-17300 exchange fragment |
| 17300 R-sense | TTTACCGGGTCCTTGAAGGACTATATGAGCACATCTGTGG | The forward primer of R-17300 exchange fragment |
| 17300 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCATACACGGTGCCCAAAAG | The reverse primer of R-17300 exchange fragment |
| 17410 L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCATGCGTATTAGTTCTTCTCT | The forward primer of L-17410 exchange fragment |
| 17410 L-anti | GGTTAGTGGGGAACATGACAAGAAGATTCCCGCATGTGGT | The reverse primer of L-17410 exchange fragment |
| 17410 R-sense | ACCACATGCGGGAATCTTCTTGTCATGTTCCCCACTAACC | The forward primer of R-17410 exchange fragment |
| 17410 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTTAACGCAAACGATCGTAAT | The reverse primer of R-17410 exchange fragment |
| 17420 L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCATGCTTTTTAAGAATTTGAG | The forward primer of L-17420 exchange fragment |
| 17420 L-anti | GTTTTTTCCCCGCAAAACGCTTGCTAAATCCAAAGAAAAC | The reverse primer of L-17420 exchange fragment |
| 17420 R-sense | GTTTTCTTTGGATTTAGCAAGCGTTTTGCGGGGAAAAAAC | The forward primer of R-17420 exchange fragment |
| 17420 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCATAAGCGATACCGGAAAG | The reverse primer of R-17420 exchange fragment |
| 17565 L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCATGTCTCCCTCCCCCTCTCG | The forward primer of L-17565 exchange fragment |
| 17565 L-anti | GTCTTTAACAGGGCCAGATCTAAAAAATAGTGGGGGCAAA | The reverse primer of L-17565 exchange fragment |
| 17565 R-sense | TTTGCCCCCACTATTTTTTAGATCTGGCCCTGTTAAAGAC | The forward primer of R-17565 exchange fragment |
| 17565 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCATGCGTAAGAATTTCCCCAT | The reverse primer of R-17565 exchange fragment |
| 17570 L-sense | TCCTGCAGCCCGGGGGATCCTCAGGCCGCTTTCAGCAGGG | The forward primer of L-17570 exchange fragment |
| 17570 L-anti | GTTCTCCTCCAGGATGATGAACCATAAAATCAGGCTCGGTGGCCC | The reverse primer of L-17570 exchange fragment |
| 17570 R-sense | GGGCCACCGAGCCTGATTTTATGGTTCATCATCCTGGAGGAGAAC | The forward primer of R-17570 exchange fragment |
| 17570 R-anti | TCCACCGCGGTGGCGGCCGCTTAGCGCGCTTGTTTGGCCA | The reverse primer of R-17570 exchange fragment |
| dddY F | TTACGGCTTCCAGTCGCGCA | The verification primer of J481 |
| dddY R | ATGCAAAAACGAATGTTGGGGG | The verification primer of J481 |
| cheY F | AGCCCAGATTGGCCAGCAAATCG | The verification primer of J481 |
| cheY R | TCTTTGGCATGCCCCGTGAA | The verification primer of J481 |
| 01015 F | AGCACATGCACCACGTTTTC | The verification primer of D6I95_01015 mut |
| 01015 R | CACCGAAATCCTGCCTGACT | The verification primer of D6I95_01015 mut |
| 05705 F | GTGGATCTGAACCTGCCCAA | The verification primer of D6I95_05705 mut |
| 05705R | GACGATGCCGAGACTACAGG | The verification primer of D6I95_05705 mut |
| 12910 F | ATGGAACATGCACGATGCGT | The verification primer of D6I95_12910 mut |
| 12910 R | GGCGTCGATAATCTGGAGCA | The verification primer of D6I95_12910 mut |
| 17300 F | TTTTGAATTTGCGCGACCGT | The verification primer of D6I95_17300 mut |
| 17300 R | ACGAAATCCTGCCACTCCTG | The verification primer of D6I95_17300 mut |
| 17410 F | TCTTCCTTATCGGGGGCAGA | The verification primer of D6I95_17410 mut |
| 17410 R | GCCATCGAGCTGTCGATACA | The verification primer of D6I95_17410 mut |
| 17420 F | TCGACAGGAACTGTGGCTTC | The verification primer of D6I95_17420 mut |
| 17420 R | TTTGCCCTTGGCGAACAATG | The verification primer of D6I95_17420 mut |
| 17565 F | CATACGCTTTAACGGCACGG | The verification primer of D6I95_17565 mut |
| 17565 R | CAACTGAGCAAGGCAACCAC | The verification primer of D6I95_17565 mut |
| 17570 F | CGTACCGAGGCATAGCCATT | The verification primer of D6I95_17570 mut |
| 17570 R | CTGACAGCCACCAAAACAGC | The verification primer of D6I95_17570 mut |
1.2 培养基和培养条件
大肠杆菌采用LB培养基，在37 ℃培养。筛选J481相关缺失突变株时采用含有5%蔗糖的LB+Rif培养基，于28 ℃培养。
基础软琼脂趋化平板培养基制备：1 mol/L液体M9培养基，灭菌后于超净台加入以下化合物模拟海水(30 mmol/L Na2SO4，1 mmol/L CaCl2，100 mmol/L KH2SO4，1 mmol/L MgSO4，pH 8)，最后加入0.08%琼脂，于微波炉加热至琼脂完全溶解后取15–18 mL于平板静置至凝固。M9 Minimal Salts购自北京酷来博科技有限公司。
1.3 软琼脂平板检测 1.3.1 趋化性检测将相关菌株接种于LB培养基中，于28 ℃、200 r/min振荡培养10 h。随后2 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清，收集菌体。用新鲜的趋化培养基重悬，2 000 r/min、4 ℃离心10 min重复3次。在超净台取5 μL重悬的菌液接种至软琼脂趋化平板中央。平板于28 ℃培养24 h后观察表型。
1.3.2 趋化平板分析将菌液接种于添加不同碳源的软琼脂趋化平板中央，于28 ℃静置培养24 h，观察趋化表型并扫描拍照。
1.4 毛细管定量分析法分析将待测菌株菌液吸取200 μL分装在聚苯乙烯96孔板中，使用酒精灯火焰将毛细管一端热封后，将开口端插入DMS溶液中。然后将开口端浸入聚苯乙烯96孔板细菌悬液中，静置30 min，取出毛细管，用无菌水清洗毛细管外壁残留液体，然后将毛细管内部细胞吹入趋化培养基中，梯度稀释，取100 μL涂布于LB平板，于28 ℃恒温培养24 h后，进行计数，重复实验3次。
1.5 MCP编码基因的全基因组挖掘通过HMMer包[10]的HMMsearch使用基于隐马尔可夫模型搜索MCP。简而言之，MCP的HMM模型PF16867[11]用于搜索粪产碱菌J481基因组(accession No.: CP032521)。
1.6 质粒的构建基于同源重组的方法，将粪产碱菌J481基因组中的D6I95_01015、D6I95_05705、D6I95_12910、D6I95_17300、D6I95_17410、D6I95_17420、D6I95_17565和D6I95_17570基因序列，从其开放阅读框(open reading frame，ORF)中选取目标基因的上下游交换臂片段作为交换片段。PCR反应体系(50 μL)：ddH2O 18 μL，2× Phanta Max Buffer 25 μL，dNTPs 1 μL，Phanta polymerase (1 U/μL) 1 μL，上游引物(10 μmol) 2 μL，下游引物(10 μmol) 2 μL，J481总DNA 1 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 6 min，34个循环；72 ℃ 5 min。
将目标基因的上下游扩增产物(上述产物)与载体pJQ200SK使用无缝克隆连接。无缝克隆体系(10 μL)：DNA片段和线性载体4 μL，2× Seamless Master Mix 5 μL，ddH2O 1 μL。50 ℃反应30 min后置于冰上。
粪产碱菌J481总DNA的抽提和质粒提取、酶切、热激转化等实验方法参照《分子克隆实验指南》进行。
1.7 缺失突变株的筛选及纯化单交换突变株筛选：以含有质粒pJQ200SK-目的基因片段的大肠杆菌DH-5α为供体菌，野生型J481粪产碱菌为受体菌进行电穿孔转化。将重组质粒pJQ200SK-目的基因导入菌株J481，基因通过同源交换重组将质粒整合到染色体上，使目标基因被敲除，质粒随染色体的复制使细菌产生Gm抗性，用含Gm+Rif的LB选择性平板筛选单交换突变体。
双交换突变株筛选：将单交换突变株稀释涂布接种至含有蔗糖和Rif的LB选择培养基上筛选出双交换突变株并消除质粒。最后，甘油管保存于–80 ℃。
1.8 DMSP裂解酶的诱导及酶活检测菌株培养及诱导：待测菌株于4 mL LB+Rif培养基中培养，28 ℃，摇床150 r/min。6 h后将细胞悬液离心、重悬于M9液体培养基中，重复3次，洗净LB，后将菌体于含有5 mmol/L的丙烯酸溶液(pH 8)的M9培养基中28 ℃诱导12–18 h[9]。该过程中，丙烯酸诱导裂解酶的表达。
酶活检测：将菌液重悬于500 μL的Tris-HCl (pH 8)的缓冲液中。置于冰上进行超声波破碎，400 W、4 s，重复2次。最后加入10 mmol/L的DMSP，静置0.5 h，检测DMSP裂解酶活性。
2 结果与分析 2.1 鉴定引发趋化作用的信号分子根据前人的报道，DMSP依赖DMSP裂解酶DddY才能引发趋化作用。DMSP会通过DMSP裂解酶生成DMS、丙烯酸和氢离子。为了验证是何种物质引发该趋化作用过程，本研究进行了一系列的软琼脂趋化平板实验。软琼脂趋化平板初步筛选了DMSP、DMS、丙烯酸这3种信号分子。
在软琼脂趋化平板实验中，观察了以下3种菌株：DMSP裂解酶缺失突变株ΔdddY、作为负对照的趋化作用调节蛋白缺失突变株ΔcheY和野生型WT。
结果显示，野生型WT对DMS和丙烯酸都无趋化响应，而对作为趋化效应物正对照的天冬氨酸和DMSP都有趋化响应(图 1，表 3)；ΔdddY仍然拥有对天冬氨酸的趋化作用响应，而对DMSP和丙烯酸都不响应(图 1，表 3)；作为负对照的趋化作用调节蛋白缺失突变株ΔcheY对3种信号分子都无响应。
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| 图 1 WT、ΔdddY突变株和ΔcheY突变株对不同信号分子的趋化表型 Figure 1 Chemotaxis phenotype of WT, ΔdddY, ΔcheY tested on soft agar chemotaxis plates to different signaling molecules. Top to bottom: WT, ΔdddY, ΔcheY. From left to right are chemotactic effector with Asp, DMSP, acrylate, blank. |
| Strains | Asp* | DMSP* | Acrylate* | Blank control |
| J481(WT) | + | + | − | − |
| ΔdddY | + | − | − | – |
| ΔcheY | − | – | – | – |
| Asp*: positive control (1 mmol/L); DMSP*: 1 mmol/L; Acrylate*: 1 mmol/L. | ||||
以上结果表明，ΔdddY并没有失去响应趋化作用的基本能力(对天冬氨酸仍有响应)，只是不再响应DMSP。值得注意的是，在软琼脂趋化平板上并未观测到野生型或ΔdddY缺失突变株对DMS的趋化作用，造成这一现象的可能原因是DMS这一挥发性物质的挥发速率太快。为此，使用毛细管定量分析实验进一步验证WT和ΔdddY的趋化作用(图 2)。野生型菌株对于DMSP以及DMS都显示出了明确的趋化作用响应；ΔdddY对于DMSP没有任何响应，而对DMS表现出了和野生型菌株同样的趋化作用响应。该结果证实了在海洋细菌粪产碱菌J481对DMSP的趋化作用过程中，DMSP裂解酶将DMSP裂解并释放DMS，而DMS作为信号分子和细菌的趋化作用受体相结合并引发细菌的趋化作用。
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| 图 2 毛细管定量分析实验检测粪产碱菌和ΔdddY对DMSP及DMS的趋化作用响应 Figure 2 Quantitative capillary assay to detect the chemotactic responses of Alcaligenes faecalis and ΔdddY to DMSP and DMS. The error bars represent the standard deviations of three independent experiments. |
2.2 MCP编码基因的全基因组挖掘
目前为止，所有已报道的细菌趋化作用，均依赖MCP信号转导结构域的受体蛋白[12]。因此，本研究通过HMMer软件[13](基于隐马尔科夫模型的方案)，对已经完成测序粪产碱菌J481完整基因组进行深度挖掘，找到基因组中含有MCP结构域的全部基因，最终得到了8个候选为编码趋化作用受体的基因(表 4)。根据这8个基因的蛋白保守结构域分析，发现这8个蛋白都属于识别趋化效应物的受体蛋白，其功能是识别趋化信号分子导致蛋白结构变化，影响下游组氨酸激酶CheA的磷酸化水平，因此推断这8个基因与粪产碱菌的趋化响应有关。
| ID of gene | Target name | Full sequence | ||
| E-value | score | Description of target | ||
| D6I95_17410 | WP_123051509.1 | 1.5e-56 | 188.6 | HAMP domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_17300 | WP_123051492.1 | 2.2e-53 | 178.2 | Tar ligand binding domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_12910 | WP_123051511.1 | 1.6e-52 | 175.5 | Tar ligand binding domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_17565 | WP_123051535.1 | 7.2e-51 | 170.1 | PAS domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_17570 | WP_123051536.1 | 1.6e-50 | 169.0 | PAS domain-containing methyl-accepting chemotaxis protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_17420 | WP_123050843.1 | 1.9e-45 | 152.4 | Methyl-accepting chemotaxis protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_05705 | WP_123049767.1 | 3.2e-42 | 141.9 | PAS domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
| D6I95_01015 | WP_123051578.1 | 2.7e-36 | 122.6 | HAMP domain-containing protein [Alcaligenes faecalis] |
通过InterPro Scan检索得到这8个受体蛋白的不同配体结合结构域(LBD)，预示着其识别的信号各有不同：CHASE3是一种细胞外的感觉结构域(图 3)，它存在于各种类型的跨膜受体中，组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基接受趋化蛋白和预测二甘氨酸环化酶/磷酸二酯酶[14]，但是它所能识别的刺激尚不清楚[15]；DUF948是一种功能未知的结构域蛋白，由细菌序列组成，部分被认为是应激蛋白，可能与多种细菌的代谢活动有关；Tar H和4HB是最为常见的信号识别结构域。Tar H常作为信号结构域模型被研究，在二聚体界面有2个位点可以结合配体，具有很强的负协同性[16]。4HB结构域由4个螺旋束组成[17]，是自然界中最广泛的LBD之一，占所有化学感受器的三分之一；而PAS结构域常被认为是感知光、氧气、氧化还原电位和小配体的结构域[18]。PAS结构域是蛋白质-蛋白质相互作用的位点，会在涉及转录激活的几种信号转导途径中形成同源和异源二聚体[19]。
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| 图 3 8个趋化受体蛋白的结构域展示 Figure 3 Domain display of 8 chemotactic receptor proteins. SP*: signal peptide |
总之，这8个基因编码的受体蛋白都有可能介导了细菌对特定信号的趋化作用。
2.3 基因的突变体构建与鉴定重组质粒的构建如图 4所示。重组质粒电转后使用含Rif+Gm的LB平板筛选单交换的克隆。由于pJQ200SK质粒上含有蔗糖敏感基因SacB，在含有蔗糖的平板中不会生长。将单交换重组子稀释涂布于含Rif的蔗糖平板消除质粒，筛选出双交换突变株。
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| 图 4 粪产碱菌J481的8个趋化蛋白受体候选基因的敲除策略 Figure 4 The diagram of strategy for D6I95 knockout, DNA flanks upstream and downstream of the target gene are amplified by PCR using primer pair L-sense/L-anti and R-sense/R-anti, and then the PCR product was connected into the pJQ200SK vector using seamless cloning. The recombination was mobilized into the host strain J481 (wide type). |
将筛选获得的缺失突变株采用菌落PCR的方法，以检测引物进行PCR扩增验证，同时用野生型粪产碱菌J481总DNA作为负对照以及构建的重组质粒作为正对照。对扩增产物进行DNA凝胶电泳检测，从电泳凝胶图可以看出01015 F和R引物扩增的D6I95_01015 mut产物约为749 bp，05705 F和R引物扩增的D6I95_05705mut产物约为749 bp，12910 F和R引物扩增的D6I95_12910 mut产物约为901 bp，17300 F和R引物扩增的D6I95_17300 mut产物约为534 bp，17410 F和R引物扩增的D6I95_17410 mut产物约为860 bp，17420 F和R引物扩增的D6I95_01015 mut产物约为540 bp，17565 F和R引物扩增的D6I95_17565mut产物约为637 bp，17570 F和R引物扩增的D6I95_17570 mut产物约为1 091 bp (图 5)，扩增片段大小与预期一致，负对照野生型J481对照组比缺失突变株片段大，且正对照质粒扩增片段与缺失突变株扩增片段大小一致。这个结果说明，8个基因对应的缺失突变株已正确构建。
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| 图 5 8个缺失突变体的菌落PCR验证 Figure 5 Identification of the mutants by colony PCR. M: DL5000 DNA marker; –: PCR products of wild-type J481 genomic DNA; +: PCR products of recombinant plasmid E.coli genomic DNA; Lane 1–16: PCR product of mutant genomic DNA. |
2.4 DMS趋化受体蛋白的趋化平板表型验证
通过软琼脂趋化平板实验，检测各个候选趋化基因的缺失突变株表型，并使用ΔcheY菌株作为负对照菌株，野生型菌株作为正对照，筛选发现ΔD6195_17420 mut仍然能够对天冬氨酸这一正对照趋化因子有趋化作用响应，但是对DMSP失去趋化作用(图 6)，而其他7个缺失突变株对DMSP及天冬氨酸都有趋化响应。以上，我们初步判定D6I95_17420为编码识别DMS趋化受体蛋白的基因。
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| 图 6 D6195_17420基因缺失对于粪产碱菌J481趋化作用的影响 Figure 6 Effects of D6195_17420 mut on the chemotaxis of Alcaligenes faecalis J481. |
与此同时，结果观察到ΔdddY与ΔD6I95_17420的平板表型一致，为确认该突变体是否失去了对DMSP的裂解能力。本研究通过在培养基中加入丙烯酸诱导DddY裂解酶的产生，检测出ΔD6195_17420 mut以及其他缺失突变株和WT(J481)的DMS释放能力(表 5)，发现ΔD6195_17420 mut并未失去裂解DMSP的能力。说明敲除的D6195_17420基因即为编码DMS受体蛋白的基因。
| Strains | Asp* | DMSP* | Glucose* | Blank | The ability of lysis DMSP |
| J481(WT) | + | + | – | – | + |
| Δ01015 | + | + | – | – | + |
| Δ05705 | + | + | – | – | + |
| Δ12910 | + | + | – | – | + |
| Δ17300 | + | + | – | – | + |
| Δ17410 | + | + | – | – | + |
| Δ17420 | + | – | – | – | + |
| Δ17565 | + | + | – | – | + |
| Δ17570 | + | + | – | – | + |
| Asp*: positive control (1 mmol/L); DMSP*: 1 mmol/L; Gluose*: negative control (1 mmol/L). | |||||
除该结论外，我们并没有发现对天冬氨酸失去趋化响应的缺失突变株，因此天冬氨酸的趋化受体可能不止一个基因参与。
2.5 基因D6I95_17420的生物信息学分析为了研究D6I95_17420基因的可能相关的生物学途径，本研究对该基因进行了更加深入的生物信息学分析。通过对该基因所在的基因簇进行分析发现，其所在的基因组附近，包含了大量与细菌鞭毛合成以及组装相关的基因(图 7)。该图中一共列举了D6I95_17420基因上下游的共31个基因。其中包括D6I95_17420基因在内，一共有2个趋化受体基因，其余的共26个基因均显示出和细菌鞭毛相关。其中FliA会代替sigma因子与FlgM直接相互作用影响鞭毛的合成，调控细菌运动[20]。FliG等基因为鞭毛马达开关。该结果，明确显示了D6I95_17420基因的功能与细菌鞭毛有一定相关性，很可能和细菌的游动相关。
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| 图 7 D6195_17420基因上下游显示其功能与细菌鞭毛合成相关 Figure 7 The genomic context of D6195_17420 indicates a function related to flagellar biosynthesis. D6195_17420 is highlight with a black star. |
经BLASTp检索，发现D6I95_17420的同源蛋白几乎只存在于产碱菌属(Alcaligenes)，且相似度较高(> 90%)。同时，该基因的同源蛋白在非产碱菌中也有存在，但相似性 < 68%，如：Pusillimonas soli和Achromobacter ruhlandii等。这些同源蛋白都含有甲基趋化受体蛋白结构域。系统进化树结果显示(图 8)，D6I95_17420在产碱菌中保守性较高，且与Alcaligenes faecalis (AYR21958.1)亲缘关系最近。
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| 图 8 D6195_17420基因系统发育树 Figure 8 Neighbour-joining phylogenetic tree of D6I95_17420 gene homologue proteins. Numbers in bracket represent the sequences accession number in GenBank. The number at each branch points is the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.05 sequence divergence. |
3 讨论与结论
细菌以趋化作用这种方式使得自身沿着趋化因子浓度梯度来移动。细菌的趋化作用和细菌的生物膜形成[21]、病原菌的致病性以及和植物的共生关系建立都有着密切的联系[22]。由于海洋中的DMSP主要是由藻类这些自养生物合成，因此海洋中异养微生物通过裂解DMSP产生DMS而引发的趋化作用，在帮助细菌寻找到适合生长的环境起着非常重要的作用。
粪产碱菌中dddY基因是活性最高的DMSP裂解酶基因，然而在此之前，并未检测到其缺失突变株的表型[9]。本研究通过趋化平板以及毛细管实验，确定了DddY是粪产碱菌J481对DMSP趋化作用过程中的重要组成部分，且其催化产物DMS是真正的效应因子。在此基础上，本研究进一步通过全基因组挖掘，找出了粪产碱菌J481全基因组中的全部趋化受体基因，共8个。分别分析了这8个蛋白结构域的功能，通过同源重组的手段，构建了8个缺失突变株，进行软琼脂趋化平板实验验证。最终鉴定D6195_17420是编码DMS趋化受体蛋白的基因，且该蛋白是海洋细菌对DMSP趋化作用中的关键受体。而该基因所在的基因簇，则大量含有和细菌鞭毛相关的基因，则更进一步的暗示了该基因可能和细菌的游动有关，且对于粪产碱菌J481在海洋环境中寻找合适的生活环境方面，有着重要的作用。
本研究首次明确报道了DMSP裂解酶是DMSP趋化作用中的重要组成部分，并且成功克隆到识别信号分子DMS的趋化受体基因。但该受体蛋白与DMS之间相互作用的分子机制尚待进一步研究。后续将使用体外重组表达蛋白、蛋白结构的测定、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)等方法检测DMS与其受体蛋白的相互作用的分子水平机制。本研究为人们对DMS/DMSP在海洋生态环境中与藻类微生物之间相互作用方式的分子生物学机制提供了新的理解，也为未来阐述DMS/DMSP在生物体内所行使功能提供了基础。
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