近年来，随着高通量测序技术发展、美国国家微生物组计划(National Microbiome Initiative，NMI)以及人体微生物组计划(Human Microbiome Project，HMP)的开展和深入^[1]，肠道微生物相关研究成为热点领域，肠道微生物与疾病的关系也越来越明确。许多研究表明，肠道菌群在消化道疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病中发挥着重要作用，如炎症性肠病^[2–3]、结直肠癌^[4–5]、糖尿病^[6]、肥胖症^[7]、帕金森病^[8]和阿尔兹海默症^[9]等，患者的肠道菌群常出现多样性降低、稳态失调等现象^[10]。因此，对肠道菌群结构和功能进行检测，对疾病的早期诊断、治疗疗效的预估和用药的选择等具有重要意义^[11–12]。

粪便样本作为唯一能够在非侵入情况下获得的肠道微生物样本，在一定程度上代表肠道菌群的状态^[13–14]。目前针对人体肠道微生物的研究常以粪便样本作为研究对象，研究肠道菌群与健康和疾病的关系。若粪便样本收集后立即进行实验，所得的结果能最真实反映肠道微生物的状态。收集后的粪便样本若长时间暴露在室温下，由于氧气的存在以及适宜的温度，兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌均会发生不同程度的改变^[15–18]。袁军等^[19]的研究结果表明，粪便样本室温放置24 h后，与新鲜样本的相似程度下降至约80%，即使是冷冻储存在家用冰箱中，超过3 d微生物群落结构也会发生改变^[16]。目前最有效的保存方式仍然是样本采集后立即液氮冷冻或–80 ℃冷冻保存^{[17, 20–21]}。但在实际样本收集过程中，粪便样本的采集多在普通家庭中进行，不具备液氮冷冻或–80 ℃冷冻条件，冷链运输也大幅增加了运输成本。另外，有研究证明了–80 ℃储存的样本如果发生反复冻融也会导致DNA的降解^[16]，从而改变肠道菌群结构，影响研究结果。

为解决实验样本采集、运输过程中存在的问题，White等早在1991年就开始尝试对血液和组织样本中添加保存剂，以保证样本中的核酸在室温情况下不会降解^[22]，而后保存剂被广泛应用于野外粪便采样^[23–24]。其中DETs保存剂能较好地保护肠道微生物DNA^[25]，且Panasci等的研究明确了不同性质的保存剂会对粪便样本产生不同的影响，并推荐使用DETs来保存植食动物的粪便，使用95%酒精来保存杂食性动物的粪便，而不推荐使用裂解缓冲液(lysis buffer)对粪便进行保存^[26]。而后Nishimoto等的研究表明含有高浓度硫氰酸胍的裂解法GITC保存剂同样可以较好的保存粪便样本^[27–29]。随着微生物组计划的推进，肠道样本的采集、运输也成为研究的焦点，出现了一系列的商业保存剂产品，如OMNIgene·GUT OM-200 (DNA Genotek)、MGIEasy (MGI)、FTA cards (Whatman)和RNAlater (Invitrogen)等。这些商业保存剂对粪便具有很好的保存效果，但由于商业产品成分的保密性质，无法对不同保存性质的保存剂进行比较分析^[17–18]。其中商业保存剂RNAlater对样品中的RNA具有很好的保存效果，使用该保存剂保存的样品能够达到转录水平的分析要求，更真实地反映肠道菌群的活动状态。

因此在本研究中，我们探究了含有高浓度渗透剂载体的DETs法^[22]、含有高浓度蛋白质变性剂的GITC法^[30–32]和专门用于保护样本RNA的商业保存剂RNAlater对粪便样本的室温保存效果。通过分析16S rRNA基因V3−V4区的高通量测序数据，进行物种注释及多样性分析，使用新鲜样本和–80 ℃冷冻保存作为对照，阐述不同性质的保存剂在室温下保存粪便样本的效果，分析样本随保存时间的增加菌群的变化情况，为大规模人群实验提供有效的粪便保存方法。

1 材料与方法 1.1 粪便样本收集

收集5位健康志愿者的新鲜粪便，粪便样本在15 min内送至实验室，实验设计如图 1所示。每位志愿者的粪便样本平均分成5份，fresh组样本立即提取元基因组DNA，剩余3份样本按照1:4的比例加入到3种不同的保存剂中，1份样本不添加任何保存剂。4种保存方式处理后的样本再平均分成5份，将含有保存剂的粪便样本于室温下保存，无保存剂的样本保存于–80 ℃冰箱，分别在第1、3、7、14、28天后提取元基因组DNA。3种保存剂包括：(1) DETs保存剂^[22]，其含有高浓度的二甲基亚砜，具有破坏蛋白质结构的功能，作为渗透剂载体来增加细胞对高浓度EDTA和钠离子的吸收，螯合细胞内的二价金属阳离子，从而抑制核酸酶的活性，防止DNA降解；(2) GITC保存剂^[30]，其含有高浓度的硫氰酸胍，是一种常见的蛋白质变性剂，可以裂解细胞并抑制DNA降解；(3) RNAlater Stabilization Solution (Invitrogen)为商用RNA保存剂，对样本中的RNA具有较好的保存效果。

1.2 粪便DNA的提取及16S rRNA基因的扩增测序

将不同时间节点的粪便样本取出，采用DNeasy Powersoil Pro Kit (QIAGEN)按照标准操作程序提取元基因组DNA，随后使用0.8%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质量检测。随后使用16S rRNA基因V3−V4区通用引物[上游引物5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′，下游引物5′：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]对DNA样本进行第1次扩增，其反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。在第2次扩增时引入不同barcode序列，用于后续拆分样本，其反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，8个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。最后采用Illumina公司的NovaSeq 6000平台进行高通量基因测序。原始数据已全部上传至国家微生物科学数据中心，生物项目编号为NMDC10017792。

1.3 数据分析和统计学方法

测序结束后，拆分样本并去除引物，根据PE reads之间的overlap使用Flash软件^[33]进行拼接。利用Trimmomatic软件^[34]对低质量序列进行过滤，采用QIIME软件^[35]中的usearch8.0软件进行嵌合体序列的检测及过滤。根据97%的序列相似性水平，利用QIIME软件^[35]中的Uclust方法对有效数据进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)聚类分析，然后基于Silva (Release128 https://www.arb-silva.de/documentation/release-128/)参考数据库，对每个样本的OTUs进行物种分类学注释。利用QIIME软件^[35]完成样本内多样性指数分析，并基于Weighted Unifrac距离、Bray-Curtis距离进行组间相似性分析。使用Wilcoxon秩和检验对组间差异进行显著性检验。

2 结果与分析 2.1 样本分组和OTUs分布情况

本研究共纳入105例样本，经测序并对结果进行质量控制后共得到6 829 240条序列，平均每个样本65 040条序列。其中采样后立即进行DNA提取的样本为fresh组，剩余样本按保存方式的差异分为4组：DTEs组、GITC组、RNAlater组和–80组。5组样本共得到489个OTUs，其中488个OTUs为5组所共有。不同保存方式下样本的OTUs数量随时间变化信息如表 1所示，与fresh组相比，不同保存方式下样本的OTUs的数量基本不变。

2.2 物种多样性与丰富度分析

物种alpha多样性通常反映每个样本内部微生物群落的丰富度和均匀度。如稀释曲线(图 2A)所示，随着测序量的增加，样本的OTU数量达到饱和，说明实验采用的测序数据量足够，测序结果可以真实反映样本的菌群分布情况。图 2B表明，与fresh组相比，4种不同保存方式的菌群的Shannon多样性指数均无显著差异。–80 ℃保存的样本alpha多样性略高于其他保存剂保存的样本，统计学分析结果显示为不显著。

2.3 样本微生物群落结构

样本微生物群落在门水平的相对丰度如图 3A所示，主要集中在4个门，包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。其中，拟杆菌门占比最多，其平均相对丰度在fresh组、DETs组、GITC组、RNAlater组和−80组分别为53.80%、43.5%、47.8%、49.99%、55.20%；厚壁菌门次之，其平均相对丰度分别为34.36%、45.80%、41.38%、37.25%、31.27%。

选取属分类水平上优势(相对丰度排名前15)微生物，生成物种相对丰度分布图，展示不同保存方式下微生物群落的分布随保存时间的变化。如图 3B所示，样本中的微生物主要由拟杆菌属(Bacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)及罗氏菌属(Roseburia)等优势菌组成。其中，拟杆菌属占比最多，在fresh组、DETs组、GITC组、RNAlater和–80组中平均相对丰度分别为32.23%、41.89%、38.70%、34.90%、28.60%。图 3B显示，使用DTEs保存剂保存1 d、3 d和28 d后，所有志愿者样本中拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度都高于新鲜样本，保存7 d后，所有志愿者样本中粪杆菌属(Faecalibacterium)的相对丰度都显著降低，而其余OTUs均无显著变化。

不同保存方式和时间使样本微生物组成及丰度发生改变，但绝大部分的OTUs与fresh组无显著差异，后续的组间相似性分析也证实了这一现象。比较不同的保存时间，−80 ℃组中少数微生物随保存时间的变化稍有波动，但整体优势微生物群落组成与新鲜样本最为相似，而GITC组的微生物群落组成随时间变化最为稳定。

2.4 各组样本中微生物群落在属分类水平的变化

在不同保存方式下，与fresh组相比，样本间共有OTUs的相对丰度随保存时间的倍数变化结果如图 4所示。无论哪种保存方式，样本中的某些OTUs的相对丰度都会发生改变，并且这种变化程度会随着保存时间的推移而改变。使用DETs和GITC保存剂会降低Bifidobacterium和[Eubacterium] ventriosum group等OTUs的相对丰度，升高Clostridium sensu stricto 1等OTUs的相对丰度。DETs保存剂室温保存超过3 d时，部分OTUs出现了明显的改变。GITC保存剂室温保存超过7 d时，部分OTUs出现了明显的改变。RNAlater室温保存的变化幅度最大，且其随时间变化逐渐下降的OTUs多属于厚壁菌门。–80 ℃低温保存的样本OTUs相对丰度随时间变化最为稳定。

2.5 样本群落微生物随时间的变化

采用Weighted Unifrac计算每个志愿者样本在不同保存方式及时间后与fresh组中的距离，来表示样本间的相似程度，距离越小表示样本间细菌组成越相似^[36]。如图 5A所示，不同保存时间，4种保存方式样本与fresh组的相似程度均无显著差异。先前的研究表明，不同技术重复的平均Weighted Unifrac距离约为0.1^[17]，而本研究中所有样本的平均距离为0.07±0.06 (灰色水平线)，与技术重复之间的平均距离相似，说明不同保存方式和时间对样本微生物群落的改变与技术重复带来的差异相似。–80 ℃保存的样本与fresh组样本的距离中位数有小于其他保存方式的趋势，说明–80 ℃保存的样本与新鲜样本更为相似，但不同志愿者的样本与其新鲜样本之间的相似程度相差较大，并且随着时间的推移，相似程度呈下降趋势。而DTEs保存剂和GITC保存剂对于不同的志愿者的样本，具有较小的差异，且保存效果随时间变化比较稳定。图 5B展示了不同保存方式和时间下的样本与fresh组的alpha多样性差异，水平线表示平均差异值，为±0.21±0.14 (灰色水平线)，与先前研究中技术重复的平均绝对差异值0.4相似，也再次证明了样本受到不同保存方式和时间的影响较小，与技术重复带来的差异相似。

2.6 样本间聚类分析

通过非加权配对平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)对不同保存方式及不同保存时长的各样本进行聚类分析，来比较样本间微生物群落结构的相似性。如图 6所示，来自相同志愿者的样本显示为相同的颜色，5名志愿者的肠道菌群组成本身存在差异，且不同保存方式同一志愿者的样本以及fresh组内对应的样本都聚集在一起。说明不同保存方式带来的差异均小于志愿者个体间的差异。

3 讨论与结论

在肠道菌群的研究中，受限于样本采集的条件及可能长期采样的实际需求，采集的粪便样本在进行实验前通常需要保存一段时间。目前已有研究表明，粪便样本在室温下保存超过15 min或在家用无霜食品冷冻箱中保存超过3 d，细菌组成就会发生明显变化^[16]。因此，–80 ℃低温冷冻保存是目前公认效果最佳的保存方式，以粪便样本为研究对象的大规模研究，有条件的情况下在样本采集后，暂时储存在家用冰箱中，短时间内转移至实验室的–80 ℃冰箱中保存^{[4, 6, 37]}。但一般的家庭、临时的采样地点或采集环境样本及野生动物的粪便样本等，都很难满足低温保存的要求，难以满足目前肠道菌群研究中越来越多的大规模的采样需求。

在不影响菌群结构的基础上，选择合适的粪便样本室温保存方法至关重要。有效的保存试剂可以在室温条件下短期保存粪便样本，保持微生物结构，从而解决大规模采样过程中样本难以及时冷冻保存的问题，对大规模的肠道微生物调查或研究具有重要意义。目前为止，已经有多项研究工作对粪便样本的保存方法进行了比较和探究。2011年，Panasci等对比了DETs方法和裂解缓冲液方法对粪便的保存效果，他们推荐使用DETs来保存植食动物的粪便，使用95%酒精来保存杂食性动物的粪便，而不推荐使用裂解缓冲液对粪便进行保存^[26]。而后2016年，Nishimoto等的研究表明裂解法也同样可以较好地保存粪便样本^[27]。Nishimoto等使用裂解法保存剂为含有高浓度硫氰酸胍的GITC保存剂，而Panasci等使用的裂解缓冲液主要使用的是20%的SDS对细胞进行裂解^[38]。我们推测可能由于不同的裂解试剂导致样本保存上的差异，而硫氰酸胍更适用于粪便样本的保存。但是Nishimoto等没有比较裂解法与DETs对保存粪便样本的效果，因此本研究比较了这两种不同性质的保存剂，如图 4所示，DETs和GITC保存剂虽然使Clostridium sensu stricito 1和Ruminiclostridium 5的丰度随着时间的变化增加，但是在保存14 d内，GITC保存剂的变化幅度小于DETs保存剂。图 5展示了不同保存剂在不同保存时间点与新鲜样品的差异，我们发现在多样性无明显差异(图 5B)的情况下，GITC保存剂保存的样本与fresh组样本的距离小于DETs保存剂与fresh组样本的距离(图 5A)。综上说明GITC保存剂对粪便样本的保存效果优于DETs。

商用的RNAlater试剂常用于细胞和组织样本的保存，使得保存的样本可以提取到完整的RNA，同时也有报道称RNAlater对粪便中的DNA也具有较好的保存效果^{[17, 39]}。本研究的结果如前所示，表明RNAlater对粪便样本中的DNA同样有很好的保存效果(图 5)，但是RNAlater保存试剂目的是保护细胞中的RNA，因此我们也对RNAlater保存粪便样本RNA的能力进行了验证，结果表明RNAlater不仅可以获得元基因组DNA，同时也可以获得较完整的RNA样本。同时我们也对GITC和DETs保存剂保存的粪便样本提取了RNA，GITC保存的样本RNA降解严重，但是DETs对粪便样本中的RNA也具有较好的保存效果(未公开数据)。因此若实验设计中需同时保存粪便样本中的DNA和RNA，可以考虑选择DETs保存剂或RNAlater保存剂，但DETs与RNAlater对RNA保存效果的差异比较有待进一步研究。

不同保存方式与保存时间和新鲜样本菌群的差异分析表明，不同的保存方式与28 d内不同保存时间的样本菌群结构与新鲜样本菌群结构没有显著差异(图 2、3、5)，志愿者个体间的差异明显高于不同保存条件带来的差异(图 6)。说明无论什么类型的保存方式，对粪便样本中的DNA都具有很好的保护效果，但不同的保存方式下样本菌群的变化存在差异。例如使用DETs和GITC保存的样本双歧杆菌属的相对丰度有下降趋势，而梭菌属和瘤胃梭菌属随着保存时间的增加，相对丰度增加，RNAlater保存的粪便样本中的某些细菌会随着保存时间增加而减少(图 4)。被视为最优保存方式的−80 ℃冷冻保存，不同保存时间的样本与新鲜样本的菌群差异中位数均小于其他保存方式(图 5A)，OTUs的改变程度较小(图 4)，但不同志愿者与各自新鲜样本的相似程度变化较大(图 5A)。以上结果说明，不同的保存试剂虽然对粪便样本都有良好的保存效果，但是各种保存试剂或保存方式对粪便样本中微生物影响有一定差异，导致不同保存试剂及保存方式下样本菌群的变化方向不同。因此建议大规模、多中心样本采集时，尽量保证保存剂或保存方式的一致性。

综上所述，粪便样本保存剂可以在室温下对粪便样本进行保存。虽然GITC保存剂和DETs保存剂的本质不同(裂解和渗透)，但是都可以很好地保存粪便样本中的基因组DNA，且随时间变化相对稳定。因此在进行大规模取样时，若不能满足低温冷冻保存条件时可以优先选择GITC保存剂室温保存粪便样本，并在28 d内尽快转移到实验室的低温冰箱中或进行实验。RNAlater和DETs保存剂都可以保护粪便菌群的RNA，对于保存效果的差异还需要进一步的验证。