2022, Vol. 62中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 瞿欢, 胡靖飞, 李施倩, 肖黛, 张路文, 付嘉钰, 赵玉佳, 陈汭, 文翼平, 伍锐, 赵勤, 颜其贵, 文心田, 曹三杰, 黄小波. 2022
- QU Huan, HU Jingfei, LI Shiqian, XIAO Dai, ZHANG Luwen, FU Jiayu, ZHAO Yujia, CHEN Rui, WEN Yiping, WU Rui, ZHAO Qin, YAN Qigui, WEN Xintian, CAO Sanjie, HUANG Xiaobo.
- 不同动物源性细胞系对猪丁型冠状病毒的易感性
- Susceptibility of cell lines from different animal species to porcine deltacoronavirus
- 微生物学报, 62(2): 672-685
- Acta Microbiologica Sinica, 62(2): 672-685
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文章历史
- 收稿日期：2021-05-26
- 修回日期：2021-08-30
- 网络出版日期：2021-11-08
引用本文 |
2. 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站, 四川 成都 611130;
3. 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心, 四川 成都 611130
2. Sichuan Science-Observation Experimental Station of Veterinary Drugs and Veterinary Diagnostic Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chengdu 611130, Sichuan, China;
3. National Teaching and Experiment Center of Animal, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China
冠状病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目、冠状病毒科。正冠状病毒亚科下分为α、β、γ和δ 4个属，是动物和人类的重要病原体，可引起各种呼吸系统、肠道和神经系统疾病[1]。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV)属于α冠状病毒属，可引起仔猪严重腹泻和死亡[2–3]。β属的成员引发人类呼吸道感染，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等[4–5]。δ属主要存在于各种鸟类和猪中[6]。蝙蝠是α和β冠状病毒的重要宿主，禽类被认为是γ和δ冠状病毒的重要宿主[6]。SARS-CoV和MERS-CoV都起源于蝙蝠，并能跨物种传播感染其他动物甚至人类引起新的流行病，提示了冠状病毒在种间传播事件中的潜在风险[7]。
猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)可引起哺乳仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和死亡，于2012年首次在香港的猪的样品中发现[6]。PDCoV的暴发首先在美国报道，并在2014年迅速蔓延到20多个州，随后多个国家也发生该病的流行，给养猪业造成了严重的经济损失[8–10]。PDCoV 3′端1/3的基因组主要编码4种结构蛋白，即纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)和3种辅助蛋白NS6、NS7和NS7a[11]。S蛋白是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，除了介导病毒进入外，是决定宿主范围和组织嗜性的关键因素，也是宿主免疫应答的主要诱导因子[12]。冠状病毒的跨种传播一直是关注的热点。近年研究表明，PDCoV也具有感染多种动物和细胞的潜力。Li等研究表明，PDCoV可使用哺乳动物和禽类的氨肽酶N (aminopeptidase N，APN)分子作为进入受体，并且可以在体外感染包括人、猪和鸡在内的多种细胞系[13]。PDCoV还可以感染鸡胚并连续传代，接种PDCoV的鸡表现出轻度腹泻并在粪便检测到少量病毒核酸[14]。此外，3–7日龄的小牛也可以感染PDCoV，并且可以持续检测到粪便中的PDCoV核酸和特异性血清IgG抗体，但是没有明显的肠损伤或病理变化[15]。Lednicky等首次报道，PDCoV感染人类，在369名急性无名高热的儿童血样中，检测出了3份变异的PDCoV[16]。这些研究提示，PDCoV存在跨物种传播的潜力，可能具有公共卫生安全风险。
我们前期已分离获得西南地区第1株PDCoV毒株并进行了系统鉴定[17]，为了进一步评估PDCoV分离株CHN-SC2015是否也具有跨种感染的风险和潜力，本研究将该毒株在来自仓鼠、家禽、猴子、人和猪的12种细胞系中进行感染和传代，拟筛选高效培养PDCoV的细胞系和为评价其跨种传播风险提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒与细胞系PDCoV CHN-SC2015株(GenBank登录号：MK355396.1)由本实验室从四川发生腹泻的仔猪中分离[17]，并在LLC-PK1细胞中连续传代，取第15代(P15)开展本研究。不同种属的12种细胞系(表 1)，包括仓鼠(BHK-21)、猴(Vero、Marc-145)、人(HEK-293、HeLa)、猪(ZYM-SIEC02、PAM、PK15、LLC-PK1、ST)和家禽的2种原代细胞系(CEF、DEF)。猪肠上皮细胞系(ZYM-SIEC02)由西北农林科技大学兽医学院张彦明教授惠赠[18]。CEF和DEF用9日龄SPF鸡胚和鸭胚制备。
| Species | Origin | Cell name | ATCC® number |
| Hamster | Baby hamster kidney | BHK-21 | CCL-10 |
| Poultry | Chicken embryo fibroblasts | CEF | N/A |
| Duck embryo fibroblasts | DEF | N/A | |
| Monkey | African green monkey kidney | Vero | CRL-1586 |
| African green monkey kidney | Marc-145 | CRL-12231 | |
| Human | Human embryonic kidney | HEK-293 | CRL-1573 |
| Human cervical carcinoma epithelium | HeLa | CCL-2 | |
| Swine | Small intestinal epithelium | ZYM-SIEC02 | N/A |
| Porcine alveolar macrophages | PAM | N/A | |
| Porcine kidney | PK15 | CCL-33 | |
| Porcine kidney | LLC-PK1 | CL-101 | |
| Swine testis | ST | CRL-1746 | |
| N/A: not available. | |||
1.1.2 主要试剂
DMEM、小牛血清购自Gibco公司；胎牛血清购自PAN公司；总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBR® Premix Ex TaqTM II、PrimeSTAR Max Premix购自宝生物(大连)有限公司；兔抗PDCoV N蛋白多克隆抗体由本实验室制备；FITC标记的羊抗兔IgG购自博奥森生物技术有限公司。
1.2 PDCoV在不同细胞上的增殖情况将12种细胞分别铺于T75细胞瓶，待细胞长至90%以上时，PBS洗涤3次，在含有0.5 μg/mL (BHK-21、CEF、DEF和HeLa)、1.25 μg/mL (HEK-293、ZYM-SIE C02)或5 μg/mL (Vero、Marc-145、ST、PK15、PAM和LLC-PK1)胰酶的新鲜DMEM中按感染复数(MOI)为0.1接种PDCoV，孵育1.5 h，弃液，加入含胰酶或2%血清(HeLa细胞)的维持液继续培养。在感染后12、24、36、48、60、72 h分别收集500 μL上清进行RT-qPCR分析，并观察CPE。
1.3 PDCoV在不同细胞上的传代培养细胞长至90%以上时，接种PDCoV孵育1.5 h，弃液后加入含胰酶或2%血清(HeLa细胞)的维持液于37 ℃培养4 d，将细胞反复冻融3次，在4 ℃下以8 000 r/min离心10 min收集上清液。所收病毒液继续传代，病毒在每个细胞系中盲传至少5代，进行RT-PCR及RT-qPCR检测。
1.4 RT-PCR及RT-qPCR鉴定提取不同代次病毒液的总RNA，反转录获得cDNA，针对NS7基因的上、下游引物：5′-AT GGCTACTGGCTGCGTTAC-3′和5′-GCGTTTC CTGGGCTGATT-3′进行RT-PCR鉴定。制备含有PDCoV M基因序列的pMD18-T质粒建立标准曲线，使用M基因的上、下游引物：5′-CCA ATGGGTACATGGAGGT-3′和5′-GTGGCGGAT TTCTAACTGA-3′进行RT-qPCR检测，测定PDCoV RNA的含量，反应条件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
1.5 易感细胞TCID50测定分别取PDCoV在LLC-PK1、PK15和ST细胞上P1、P3与P9的病毒液，在LLC-PK1细胞上测定病毒滴度。取100 μL病毒液，按照10倍梯度进行系列稀释(10–1–10–10)，同时设置两列空白对照，待LLC-PK1长满96孔细胞板，PBS洗2次后加入稀释好的病毒液，每个稀释度8个重复，37 ℃孵育1.5 h，弃病毒液，加入150 μL含5 μg/mL胰酶的维持液，37 ℃继续培养。每日观察LLC-PK1细胞病变情况，连续观察4–7 d，最后按照Reed和Muench氏法计算TCID50[19]。
1.6 不同代次IFA鉴定细胞铺于含细胞爬片的12孔板中，按MOI=0.04接种PDCoV，感染36 h后，弃去培养基，用PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定30 min；用PBS洗涤3次，0.5% Triton X-100通透30 min；用PBS洗涤3次后，用2% BSA 37 ℃封闭1 h。然后在4 ℃孵育兔抗PDCoV N蛋白抗体(1:200稀释)过夜；用PBST (PBS+0.1% Tween-20)洗涤后，避光孵育FITC标记的羊抗兔IgG (1:500稀释) 1 h。最后一次洗涤后取出爬片，DAPI进行核染。
1.7 不同细胞传代后S基因测序分析参照CHN-SC2015株的S基因序列设计上、下游引物：5′-CACCAGGACGCCTTCTTGTGA GG-3′和5′-CTACCATTCCTTAAACTTAAAGGA CG-3′，从不同细胞系传代样品中扩增S基因并与LLC-PK1-P15相比用MEGA-X软件进行测序比对，分析核苷酸及氨基酸突变情况。程序如下：98 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，34个循环。
1.8 不同物种源APN的进化树分析为分析不同物种源APN的序列差异及其在不同种属细胞感染中的潜在相关性，从GenBank中下载25个不同物种的APN序列，利用MEGA 7软件，采用邻接法，基于APN的氨基酸序列构建系统发育树。
1.9 数据分析本研究所有代表性结果都进行3次重复实验，结果用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。显著性分析采用Student's t检验。统计显著性记为*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001；ns：P > 0.05。
2 结果与分析 2.1 PDCoV在不同物种来源细胞系上的CPEPDCoV CHN-SC2015株以MOI=0.1感染来自不同物种的12种细胞系，并观察细胞在不同时间点的生长状态。HeLa细胞对胰酶敏感，因此用不含胰酶，含2%胎牛血清的DMEM作为维持液。结果显示，PDCoV在Vero、PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞中的P1表现出明显的CPE (图 1)，但在Vero和PAM细胞的后续传代中CPE逐渐消失。本研究PDCoV在Vero细胞P1中有大量的细胞融合，并且在48 h可以显著观察到合胞体的形成(图 2A)，但从P3起未观察到明显的合胞体。
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| 图 1 接种PDCoV CHN-SC2015株后72 h的不同细胞系中的CPE Figure 1 CPEs in different cell lines inoculated with PDCoV CHN-SC2015 at 72 hpi. Original magnification, ×100. |
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| 图 2 PDCoV在不同物种来源细胞系上的增殖情况 Figure 2 Proliferation of PDCoV in cell lines from different animal species. A: cell fusion and syncytium formation were observed on Vero cells inoculated with PDCoV at 48 hpi; B: proliferation of PDCoV in hamster (BHK-21) cells; C: proliferation of PDCoV in poultry (CEF and DEF) cells; D: proliferation of PDCoV in monkey (Vero and Marc-145) cells; E: proliferation of PDCoV in human (HEK-293 and HeLa) cells; F: proliferation of PDCoV in swine (ZYM-SIEC02, PAM, PK15, ST, and LLC-PK1) cells. The viral loads of PDCoV was determined by the standard curve and is expressed as the mean (log10 copies/μL)±standard deviation (SD). The P-value < 0.05 was considered statistically significant compared with those at 12 hpi. |
2.2 PDCoV在不同种属细胞系上的增殖鉴定
为了确定PDCoV是否在这些细胞系上增殖，在不同的时间点收集PDCoV感染细胞P1的上清液，用RT-qPCR检测病毒的M基因RNA水平。结果表明：(1) 病毒拷贝数在BHK-21细胞中几乎没有变化(图 2B)；在禽源(CEF和DEF)和ZYM-SIEC02细胞中随时间逐渐下降(图 2C、F)；(2) 在猴源(Vero和Marc-145)和人源(HEK-293和HeLa)细胞中，病毒拷贝数略有增加，但之后逐渐减少(图 2D、E)；(3) 病毒在猪源PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞上有明显的增殖。除此之外，PDCoV在ST细胞中的病毒拷贝数最高(图 2F)。
2.3 PDCoV在不同种细胞上的连续传代为了确定PDCoV CHN-SC2015株能否在12种细胞系中稳定传代，将病毒在每种细胞系中盲传至少5代，结果显示，3种细胞易感，9种相对不易感。收集在9种非易感细胞中传不同代次的病毒液进行RT-qPCR和RT-PCR检测，而通过在LLC-PK1细胞上测定TCID50确定PDCoV在3种易感细胞(PK15、LLC-PK1和ST)上P1、P3和P9的病毒滴度(表 2)。结果显示，(1) 接种PDCoV的非易感细胞系中的8个(除CEF外)，病毒RNA载量随着代次的增加而逐渐降低，其中，在DEF、Marc-145、HEK-293、ZYM-SIEC02和PAM细胞的P4或P5中不能检测到PDCoV (图 3)。然而，CEF细胞P2中的病毒RNA载量出现短暂下降，然后P3恢复到与P1相似的水平(图 3B)。PCR结果显示，只有在CEF和Vero细胞的P5中还能检测到PDCoV (图 4)。(2) 随着PDCoV在3个易感细胞系上的连续传代，感染滴度逐渐增加，并且P9比P1增加约10–100倍(表 2)。
| Parameter | Cell lines | Results of different generations | ||
| P1 | P3 | P9 | ||
| Infectious titer/(TCID50/mL) | PK15 | 106.00 | 106.12 | 107.11 |
| LLC-PK1 | 105.26 | 105.12 | 107.00 | |
| ST | 106.32 | 105.55 | 107.37 | |
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| 图 3 连续传代期间细胞系中PDCoV的病毒含量变化 Figure 3 Viral loads of PDCoV in different cell lines during serial passages. A: viral load of PDCoV in BHK-21 cells; B: viral load of PDCoV in CEF cells; C: viral load of PDCoV in DEF cells; D: viral load of PDCoV in Vero cells; E: viral load of PDCoV in Marc-145 cells; F: viral load of PDCoV in HEK-293 cells; G: viral load of PDCoV in HeLa cells; H: viral load of PDCoV in ZYM-SIEC02 cells; I: viral load of PDCoV in PAM cells. The viral load of PDCoV was determined by the standard curve and is expressed as the mean (log10 copies/μL)±standard deviation (SD). N/D: not detected. |
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| 图 4 不同代次的RT-PCR检测 Figure 4 RT-PCR detection of different generations. M: DL2000 marker; N: negative control; P: positive control. |
2.4 PDCoV在细胞系中不同代次的IFA鉴定
接种PDCoV后，部分细胞没有出现明显的CPE，因此用抗N蛋白的多克隆抗体进行IFA鉴定是否存在病毒感染。将PDCoV感染的12种细胞系的不同代次(易感细胞PK15、LLC-PK1和ST的P1、P3和P9；其他细胞中的P1、P3和P5)于36 h固定。结果表明：(1) 在BHK-21和ZYM-SIEC02细胞上未观察到PDCoV N蛋白特异性免疫荧光(图 5D、E)；(2) 病毒N蛋白仅在家禽(CEF、DEF)、猴(Vero、Marc-145)、人(HEK-293、HeLa)和PAM细胞的P1中表达(图 5)，而且在HeLa细胞中感染有限，抗原的表达低于其他细胞系(图 5C)；(3) 在PK15、LLC-PK1和ST细胞的P1、P3和P9均可以观察到特异性免疫荧光，并且在LLC-PK1细胞中表现出明显的合胞体形成(图 5D)，同样，接种PDCoV的ST细胞N蛋白表达水平最高。这些结果表明，大多数细胞不支持PDCoV CHN-SC2015株的稳定传代，只有3种细胞系(PK15、LLC-PK1和ST)适合病毒的稳定增殖。
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| 图 5 PDCoV感染细胞的不同代次的IFA鉴定 Figure 5 Identification of PDCoV-infected cells at different generations by IFA. A: poultry (CEFs and DEFs); B: monkey (Vero and Marc-145); C: human (HEK-293 and HeLa); D: swine (ZYM-SIEC02, PAM, PK15, LLC-PK1 and ST); E: hamster (BHK-21) cells. FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG was used as secondary antibody (green). DAPI was used to detect nuclei (blue). Original magnification, ×400. |
2.5 PDCoV感染不同细胞后S基因的序列分析
在易感细胞(LLC-PK1、ST和PK15)中，PDCoV连续传代至P15。为了确定不同细胞系传代中PDCoV的S基因是否发生变异，根据PCR结果(图 4)对LLC-PK1、ST、PK15的P15；PAM、DEF、BHK-21的P2；Vero、CEF的P5；HEK-293、HeLa、Marc-145和ZYM-SIEC02的P3扩增完整S基因并测序，与LLC-PK1上P15 (NMDCN0000NN9)比较S基因序列的变化。结果表明，S基因全长3 480个核苷酸，编码1 159个氨基酸，病毒在BHK-21细胞上传代2次，在HeLa、Marc-145和ZYM-SIEC02细胞传代3次后，S基因序列无突变。其他细胞上(NMDCN0000NNA-G)共产生14个核苷酸和相应12个氨基酸的突变，其中1 443和2 277位是同义突变，在突变的氨基酸中，162位氨基酸是位于S1表面的糖基化位点(表 3、表 4)。
| Passage | Nucleotide position | |||||||||||||
| 484 | 500 | 578 | 787 | 1 188 | 1 443 | 1 450 | 1 769 | 2 277 | 2 389 | 2 636 | 2 767 | 2 813 | 3 092 | |
| LLC-PK1-P15 | G | A | A | G | T | A | C | A | C | G | C | A | A | C |
| ST-P15 | G | A | A | G | T | A | C | A | C | G | C | A | A | C |
| PK15-P15 | T | C | A | T | A | A | G | A | C | T | T | A | A | C |
| PAM-P2 | G | A | A | G | T | A | G | T | C | G | C | A | A | C |
| Vero-P5 | T | C | C | T | A | G | C | A | T | G | C | A | A | T |
| HEK-293-P3 | G | A | A | G | T | A | C | A | C | G | C | A | A | T |
| CEF-P5 | T | C | A | T | T | A | G | T | C | G | T | A | A | C |
| DEF-P2 | T | C | C | T | A | G | C | A | C | G | C | G | G | T |
| The colors red, yellow, blue, orange represent the nucleotide A, T, C, G after mutation, respectively. | ||||||||||||||
| Passage | Amino acid position | |||||||||||
| 162 | 167 | 193 | 263 | 396 | 484 | 590 | 797 | 879 | 923 | 938 | 1 031 | |
| LLC-PK1-P15 | D | H | D | V | N | Q | E | D | S | T | N | T |
| ST-P15 | D | H | D | V | N | Q | E | D | S | T | N | T |
| PK15-P15 | Y | P | D | L | K | E | E | Y | L | T | N | T |
| PAM-P2 | D | H | D | V | N | E | V | D | S | T | N | T |
| Vero-P5 | Y | P | A | L | K | Q | E | D | S | T | N | I |
| HEK-293-P3 | D | H | D | V | N | Q | E | D | S | T | N | I |
| CEF-P5 | Y | P | D | L | N | E | V | D | L | T | N | T |
| DEF-P2 | Y | P | A | L | K | Q | E | D | S | A | S | I |
| The colors red, yellow, blue, orange represent the the amino acids corresponding to mutated nucleotide A, T, C, G, respectively. | ||||||||||||
2.6 不同种属动物APN的系统发育分析
从GenBank获得的25个不同物种的APN序列进行了系统发育分析，结果表明，APN广泛分布于动物物种之间，并形成4个不同的簇和许多小分支，表明APN物种的多样性和特异性(图 6)。其中，仓鼠、鸡与鸭、猴与人和猪的APN序列分布在不同的分支中，与猪的氨基酸序列同源性分别为53.26%、64.02%、65.70%、78.45%和78.64%，而人与猴的APN序列同源性达98.55%，鸡与鸭的APN序列同源性达91.21%。
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| 图 6 不同物种APN氨基酸序列的系统发育分析 Figure 6 Phylogenetic analysis of APN amino acid sequence from different species. The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method with bootstrap values calculated from 1 000 trees in MEGA 7 software. Only bootstrap values > 70% are shown at the branch points. Reference sequences obtained from GenBank are indicated by GenBank accession numbers and species names. |
3 讨论与结论
多数新发感染人类的病原体来自动物，特别是近年来反复出现并导致流行的冠状病毒。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2均能跨物种传播感染人类引起疾病流行，提示了冠状病毒在种间传播事件中的潜在风险[7]。包括人、猴、猪、鸡、蝙蝠等在内的21种细胞系对SARS-CoV显著易感，表明这种蝙蝠来源冠状病毒跨物种传播的可能性[20]。检测猪群中PDCoV时发现，PDCoV与SpCoV HKU17密切相关，表明PDCoV可能从鸟类传播到哺乳动物[6]。PDCoV还可在体外感染鸡肝癌和DF-1细胞以及人的Huh7细胞[13]。但这些研究均只是在细胞上接种1次后检测病毒感染的结果，并不能确定病毒能否在这些细胞上稳定传代。本研究为了掌握CHN-SC2015毒株的适应性，通过连续传代检测分析，证明PDCoV CHN- SC2015株可以感染来自鸡、鸭、猴、人和猪的10个细胞系，但只有3种细胞系(PK15、LLC-PK1和ST)适合PDCoV的连续增殖。Liang等证实，PDCoV可感染鸡胚并继代，且可在P5中检测到病毒核酸，而且接种PDCoV的鸡表现出轻微的腹泻症状[14]，本研究CHN-SC2015株可感染鸡胚原代CEF细胞，再次证明PDCoV对鸡的感染潜力。
在细胞培养中，外源蛋白酶通过促进细胞膜融合增强PDCoV的复制，即使没有胰酶，PDCoV也能在LLC-PK1细胞中复制，但无可见的CPE，其病毒滴度相对胰酶处理组更低[21]。本研究通过胰酶耐受试验选择各细胞接毒的最适胰酶浓度，发现HeLa细胞对胰酶敏感，因此用含2%血清的DMEM作为维持液，HeLa细胞感染PDCoV后N蛋白表达水平低于其他细胞系，表明胰酶可能在PDCoV感染过程中发挥重要作用。PDCoV具有广泛的组织嗜性，除了肠道和粪便外，还可以在心、肝、脾、肺、肾和胃等内脏器官中检测到[17]。据报道，来自PDCoV感染主要部位的IPI-2I和IPEC-J2细胞对PDCoV易感，尽管CPE只能在IPEC-J2细胞中传代3次后才能被观察到[22–23]。然而，在本研究中，PDCoV CHN-SC2015株不能感染ZYM-SIEC02细胞(一种猪小肠上皮细胞系)[18]，可能是不同分离毒株存在不同的细胞易感性。Woo等证实，PDCoV不仅可以感染猪肺组织，在鼻咽样本中也检测到该病毒，表明除了粪-口传播外，呼吸道也可能是PDCoV感染的途径[24]。本研究发现，PDCoV可在体外感染PAM细胞且存在一定水平的增殖，这再次证实，PDCoV具有感染呼吸道的潜力，但PDCoV在PAM细胞上连续传代至P5后用RT-qPCR检测不到病毒，可能与毒株的细胞适应性差异相关，因而CHN-SC2015毒株不完全适应该细胞。
在病毒感染过程中，N端S1与细胞受体结合，C端S2介导膜融合，我们前期研究发现，PDCoV S蛋白的S1-CTD (aa 278–616)区域可能是主要的中和表位[25]，本研究结果显示，该区域发生了3个氨基酸突变(表 4)。然而，一些研究表明，冠状病毒的宿主范围在其融合亚基突变后也发生了变化，表明S2区域在宿主范围扩大中也具有显著意义[26]，但仍需要进一步的研究来阐明其潜在机制。本研究根据PDCoV在不同细胞系传代后的PCR结果，选择能检测到的最高代次扩增S基因，共发生14个核苷酸和相应的12个氨基酸突变。第162位氨基酸是S蛋白表面的糖基化位点，与S1表位的屏蔽和宿主免疫监测的逃避有关[27]。Lednicky等研究显示，一个在NSP15与S1发生氨基酸点突变的PDCoV毒株引起3例临床案例[16]，提示PDCoV可能对人类的致病性。因此，S基因的突变可能也是导致PDCoV扩大宿主范围产生跨物种传播的重要原因之一。
APN广泛存在于各种组织和细胞中，尤其在小肠绒毛上皮细胞中高效表达，且已被证明是人冠状病毒229E、犬冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和TGEV的特异性受体[28–29]，而它是否是PEDV和PDCoV的受体仍存在争议[30–31]。Wang等证实，与LLC-PK1和ST细胞中pAPN的内源性表达不同，Vero和BHK-21细胞缺乏APN表达[32]，但本研究显示，PDCoV也可感染Vero细胞，且在P9仍可检测到病毒，因此提示存在PDCoV的某种未知受体。同时，本研究比较了不同种属源的APN序列，结果显示，本研究中涉及的仓鼠、鸡、鸭、猴、人与猪源APN氨基酸序列同源性分别为53.26%、64.02%、65.70%、78.45%和78.64%，说明其间差异较大，但PDCoV可同时感染这些细胞，提示确实存在APN之外的某种受体。Li等发现，APN在猪、猫、人和鸡中的表达可以显著增强PDCoV对非易感HeLa细胞的感染，且在APN敲除后PDCoV感染未被完全阻断[13]，表明该病毒具有APN非依赖性进入途径，可能具有某种共同受体。总的来说，鸡胚、雏鸡、火鸡和小牛对PDCoV易感，再次提示病毒跨物种传播的潜在风险[13–15, 33]。2021年Lednicky等在369名急性无名高热的儿童血样中检测出了PDCoV，首次报道PDCoV感染人类[16]。本研究也证实，PDCoV可以感染人类来源的HEK-293和HeLa细胞，在P1有轻微的增殖，但在体外不能完全适应，表明PDCoV有跨物种屏障感染人类的风险。在人类历史上，冠状病毒跨种传播造成了动物或人类疫情，因此，关注猪源冠状病毒PDCoV的跨种传播潜力，在防控猪病发生和公共卫生安全方面具有重要意义。
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