益生菌是指“给予一定数量后能够对机体产生有益作用的活的微生物”^[1]。益生菌可发挥多种益生功能，如抑制致病菌、增强肠道屏障、调节肠道菌群、促进消化吸收、合成活性代谢产物和调节机体免疫等^[2]。目前使用的益生菌主要为乳酸菌(如乳杆菌和双歧杆菌)、非致病性大肠杆菌、芽孢杆菌、肠球菌和酵母等，它们大多来源于肠道或发酵食品。近年来，随着对肠道微生物的深入研究，“下一代益生菌”开始作为新的预防和治疗工具出现，它们主要有拟杆菌、梭菌、阿克曼菌和栖粪杆菌等^[3–4]。益生菌可产生多种活性代谢产物，如短链脂肪酸、过氧化氢、共轭亚油酸、低聚果糖和细菌素等以发挥其益生作用^[5]。其中细菌素(bacteriocin)是细菌在代谢过程中，通过核糖体合成的有抑菌活性的小肽，其抑菌活性强，安全无毒，是益生菌产生的重要活性代谢产物^[6]。细菌素对益生菌发挥益生作用的贡献主要表现在抑制肠道致病菌生长、帮助益生菌在肠道中存活并定殖、调节肠道菌群平衡等^[7]。而细菌素本身也具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性^[8]，同时它们具有独特的抑菌机制，不易引起耐药性，是人们用来改造成为新型药物的理想材料。本文基于目前已有的报道和作者所在课题组的研究成果，综述和讨论了益生菌产生细菌素的种类、生物合成、益生功能和作用方式等，为深入解析益生菌通过活性代谢产物发挥益生功能的作用及其机制提供参考。

1 细菌素的发现及其分类

1928年，Rogers等首次发现乳酸乳球菌的肽类代谢产物——乳酸链球菌素(nisin)可抑制一部分乳酸菌的生长，这就是最早发现的细菌素^[9]。1953年，Jacob等提出细菌素的定义，即细菌素是一类由细菌核糖体合成的具有抑菌活性的小肽^[10]。据报道，自然界中很多细菌都能产生细菌素，有的细菌甚至能产生几种、几十种到几百种不同的细菌素。细菌素大多含有20–60个氨基酸残基，其结构多样，经核糖体合成后，有的还要经过翻译后修饰，形成特殊结构，以提高其稳定性或发挥特殊的生物活性。根据细菌素结构和生物合成方式的多样性，参照Kuipers and Fliss的分类方法^[11–12]，细菌素主要可分为3大类。简单来说，Ⅰ类细菌素属于热稳定的，分子量小于10 kDa的小肽，其分子结构中含有经翻译后修饰形成的特殊氨基酸；Ⅱ类细菌素也是热稳定的，小于10 kDa的小肽，但其分子中无翻译后修饰结构；Ⅲ类细菌素分子量多大于10 kDa，热不稳定，分子中也无翻译后修饰结构。每一大类细菌素也分为不同的亚类，具体如下。

1.1 Ⅰ类细菌素

Ⅰ类细菌素基本都属于翻译后修饰多肽(ribosomally produced and post-translationally modified peptides，RiPPs)^[13–14]。这类细菌素根据修饰方式的不同可分为很多亚类，主要包括羊毛硫肽(lanthipeptides)、环肽细菌素(head-to-tail cyclized peptides)、含硫碳键的细菌素(sactibiotics)、含噻唑和(甲基)恶唑的小肽(thiopeptides)、含糖基化氨基酸的细菌素(glycocins)及拉索肽(lasso peptides)等^[11]。这些细菌素中的特殊氨基酸或结构对稳定小肽、特异性识别不同靶细胞和发挥抑菌生物活性都发挥了很重要的作用。

羊毛硫肽的成熟分子中含有一个或多个羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸残基，是到目前为止在细菌素的应用研究中，研究最多和开发最成功的细菌素。有抑菌活性的羊毛硫肽又称为羊毛硫细菌素(lantibiotic)，它们对很多致病菌，尤其是抗生素耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素粪肠球菌等具有很好的抑菌活性。乳酸乳球菌产生的乳酸链球菌素(nisin)是这类细菌素的典型代表，它不仅具有较强的抑菌活性和较广的抑菌谱，而且还具有抗炎和抑癌等多种生物活性^[8]。牛奶、各种发酵食品、人体肠道和生殖道等均发现nisin产生菌^[15–16]。环肽细菌素分子的N端和C端首尾连接，形成环状结构。来自牛奶和奶酪等的粪肠球菌可产生环肽细菌素enterocin AS-48，它可抑制单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和致病性大肠杆菌等^[17]。Sactibiotics分子中含有半胱氨酸和邻近氨基酸中的α-碳形成的硫碳键，它们一般抑菌谱较窄。如来自人体肠道的苏云金芽孢杆菌产生的thuricin CD可特异性抑制导致肠道菌群失调的艰难梭菌，而不影响正常的肠道菌群^[18]。Thiopeptides是分子中含有噻唑或(甲基)恶唑的小肽，有的还含有一些脱水氨基酸，它的典型特征是拥有核心六元氮杂环。它们对假单胞菌、不动杆菌和分枝杆菌属中的很多耐药菌具有较好的抑菌活性^[19]。Glycocins分子中具有糖基修饰化半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸等。植物乳杆菌产生的glycocin F可抑制酿脓链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌等，具有较广谱的抑菌活性。枯草芽孢杆菌产生的sublancin还具有免疫调节活性^[20]。拉索肽的结构很像一个套索绳，其N端第1位氨基酸和第7位或第9位氨基酸形成环状结构，C端尾巴从环中穿过，形成套索的结构。拉索肽具有多种生物活性，如抑制致病菌和抗癌等。Microcin J25由新生儿粪便中的大肠杆菌产生，研究证明它可以中和产肠毒素大肠杆菌分泌的内毒素、避免肠道损伤和减少炎症反应^[21]。

1.2 Ⅱ类细菌素

Ⅱ类细菌素一般不包含翻译后修饰的特殊氨基酸，有些可在氧化环境下形成自发的二硫键^[22]。Ⅱ类细菌素大体可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd 4种。Ⅱa类细菌素又称为片球菌素(pediocin)类细菌素，含有保守的YGVG结构域，通常具有较窄的抑菌谱，对李斯特氏菌具有较好的抑菌活性，是Ⅱ类细菌素中研究最广泛的一类。pediocin PA-1产自切达奶酪来源的乳酸片球菌，它在远端回肠模型中被证明可明显减少李斯特氏菌的数量^[23]。Ⅱb类细菌素是双组份或多组分细菌素，它的全部活性依赖于2个不同的小肽。植物乳杆菌产生的Ⅱb类细菌素plantaricin EF被证明可保持肠道屏障的完整性^[24]。Ⅱc类细菌素为无前导肽类细菌素，其生物合成不需要前导肽切除过程。粪肠球菌产生的enterocin L50可抑制葡萄球菌、调节肠道菌群和促进宿主机体健康^[25]。Ⅱd类是其他线性非pediocin类的单组分细菌素。如产自大肠杆菌等肠杆菌的microcin V可抑制近缘的致病性大肠杆菌^[26]。

1.3 Ⅲ类细菌素

Ⅲ类细菌素是大分子热不稳定细菌素，分子量大于10 kDa，分为Ⅲa类溶菌素(bacteriolysins)和Ⅲb类非细胞溶解类细菌素(non-lytic bacteriocin)两类。Ⅲa类细菌素可结合靶细胞表面受体，使细胞溶解。Helveticin J产自瑞士乳杆菌，其对一些近缘菌具有一定的抑菌活性。Ⅲb类细菌素主要通过破坏细胞膜起作用。Ⅲ类细菌素目前研究还较少。

2 细菌素的条件性合成

细菌素是益生菌发挥益生功能的重要代谢产物，它们一般通过传统的抑菌活性筛选发现，随着高通量测序技术的飞速发展，利用基因组或宏基因组数据库也发现了越来越多的细菌素生物合成基因簇及可能的产生菌^[27–28]。但是很多含有细菌素生物合成基因簇的细菌在实验室条件下并不能检测到有细菌素产生，这可能是因为细菌素的产生是细菌应对环境变化，如竞争性细菌入侵、生长温度和pH变化等做出的调控反应或作为信号分子利于种间交流^[29–30]。由于细菌素的产生需要产生菌提供额外的代谢能量，从某种程度来说是细菌生长的“负担”，因此很多细菌会在环境变化时“条件性”产生细菌素，以利于自身生长和节省代谢能量。如唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、粪肠球菌和植物乳杆菌的一些菌株被发现只有在与竞争性菌株共培养或添加诱导物时才能产生细菌素或提高细菌素的产量^[31–32]。

对于乳酸菌等益生菌来说，它们细菌素的产生一般通过群体感应系统(quorum-sensing system)来调控。群体感应系统包括诱导分子和组氨酸激酶-反应调控蛋白组成的双组分调控系统。诱导分子有的是细菌素分子本身，有的是细菌素产生菌分泌的其他小肽，有的是环境中其他细菌产生的细菌素或小肽类分子^[33–34]。乳酸乳球菌产生的羊毛硫细菌素nisin是自身诱导调控合成的典型代表。Nisin的生物合成基因簇nisABTCIPRKFEG中包含11个nisin生物合成相关基因，其中nisK和nisR分别编码双组份调控系统的2个组分——组氨酸激酶NisK和反应调节蛋白NisR。Nisin和NisKR组成群体感应系统来调控nisin的生物合成。NisK定位于细胞膜上，当感受到胞外nisin浓度达到一定阈值时，其发生自身磷酸化，并能将磷酸基团转移给NisR使其激活，从而调控下游nisin结构基因nisA及其他相关基因的转录表达，进行nisin的生物合成^[35]。植物乳杆菌NC8产生的Ⅱ类细菌素plantaricin NC8也通过类似的群体感应系统来调控其合成，不同的是其生物合成的诱导肽是植物乳杆菌NC8产生的另外一个小肽PlNC8IF，它通过诱导双组分系统PlNC8HK-PlnD调控plantaricin NC8的产生，且只有在菌群密度较高的固体培养基上才能检测到plantaricin NC8的产生，而在菌群密度较低的液体培养基中则检测不到^[29]。Plantaricin NC8也可被多株不同种属的革兰氏阳性菌如嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌、英诺克李斯特氏菌和肉糖葡萄球菌等诱导产生^[36]。

除此之外，环境中的营养物质、pH值变化、有机酸和温度等都可以影响细菌素的产生。如半乳糖可诱导乳酸乳球菌产生nisin^[37]，pH值降低可诱导乳酸乳球菌产生羊毛硫细菌素lacticin 481^[38]，乙酸可分别促进植物乳杆菌、清酒乳杆菌和鼠李糖乳杆菌产生plantaricin EF、sakacin A和rhamnosin B^[39]等。更有意思的是，细菌素microcin M和H47只有在肠道发生炎症时(铁离子匮乏)才在产生菌中表达，发挥其抑菌活性^[40]。简而言之，细菌在特定条件下产生细菌素，通过“负重前行”，换取对自已更大的益处，如抢占营养资源和杀死竞争者等。这个生理特点同时也赋予了一些益生菌独特的益生特性和功能。

3 细菌素的益生功能及其作用机制 3.1 抑制致病菌尤其抗生素耐药菌

细菌素结构多样，抑菌谱有宽有窄，有些细菌素具有很宽的抑菌谱，可以抑制很多不同种属的细菌，包括食品腐败菌和动物、人体致病菌，甚至是抗生素耐药及多重耐药致病菌。如乳酸乳球菌产生的nisin对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素粪肠球菌(VRE)、肺炎链球菌、无乳链球菌、艰难梭菌、李斯特氏菌等都具有明显的抑菌活性；唾液乳杆菌UCC118产生双组份细菌素Abp118，它具有较宽的抑菌谱，对很多食品腐败菌和肠道致病菌都具有很好的抑菌活性，能够保护小鼠抵御李斯特氏菌的感染；芽孢杆菌产生的cerecidin对MRSA、VRE和蜡状芽孢杆菌等也具有明显的抑菌活性；粪肠球菌产生的enterocin E-760可抑制肠道沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌和金黄色葡萄球菌等^[41–43]。

有些细菌素则具有较窄的抑菌谱，能特异性抑制特定致病菌，不易产生副作用，如来自人体肠道的苏云金芽孢杆菌产生的thuricin CD是一种sactipeptide，它由2个协同发挥作用的小肽组成，对艰难梭菌具有特异性的抑菌作用，可抑制艰难梭菌而不影响正常的肠道菌群结构^{[18, 44]}。大肠杆菌Nissle 1917是一株广泛应用的革兰氏阴性益生菌，它产生的细菌素microcin可在炎症性肠道中特异性抑制侵染性大肠杆菌和肠道沙门氏菌的生长，从而减少这些致病菌在肠道中的定殖^[40]。一株鼠李糖乳杆菌产生的细菌素rhamnocin 519抑菌谱也较窄，它对单核增生李斯特氏菌具有特异性较强的抑菌活性^[45]。很长时间以来，很多细菌素的窄谱抑菌特性一直被认为是其应用上的较大缺陷，而现在越来越多的研究表明，肠道微生物菌群对整个机体健康非常重要，抑菌谱较宽的抗生素除了抑制特定的致病菌，同时也破坏了正常的肠道微生物菌群，引起肠道菌群失调，反而对健康不利。如抗生素的使用引起肠道菌群失调，导致艰难梭菌感染引起腹泻就是一个很典型的例子^[46]。因此，对致病菌具有特定抑菌作用而不破坏正常肠道菌群的细菌素可能是比抗生素更有优势的理想的抗菌药物。

细菌素的结构多样，因此其作用对象及其作用机理也异常复杂。总体来说，目前报道的细菌素大多都具有一个到多个净正电荷，利于其与靶细菌的附着及抑杀。同时，几乎所有的细菌素都具有两亲性结构，使其顺利作用于靶细菌的细胞膜，从而发挥其生物活性。细菌素发挥抑菌活性的分子机制和抗生素明显不同，其抑菌作用方式大体可分为两种，一种是对于革兰氏阳性菌，细菌素可直接破坏靶细胞的细胞壁或细胞膜，导致细胞内容物泄露，从而杀死靶细菌。革兰氏阳性菌细胞壁组成相对简单，只含有肽聚糖和磷壁酸，细菌素可通过细胞壁直接接触细胞膜而起作用。脂Ⅱ分子(lipid Ⅱ)是肽聚糖合成的关键中间体，nisin等羊毛硫细菌素及一些Ⅱ类的细菌素可直接结合脂Ⅱ分子，从而阻断肽聚糖的合成，或以脂Ⅱ分子作为“对接分子(docking molecule)”，结合后导致细胞膜形成孔洞，使胞内营养物质流失，导致细胞裂解。细菌素导致细胞膜形成孔洞的方式较多样，以nisin为例，有两种较为成熟的理论，一种称为“桶板模型”，即nisin分子N端与脂Ⅱ分子结合，插入细胞膜内，而C端跨过细胞膜，像桶板一样排列成一圈，形成圆形的孔洞；另一种称为“楔形模型”，即较高的跨膜电势使nisin与细胞膜平面垂直，导致脂质膜表面发生弯曲，形成类似楔形的孔洞^[47–48]。值得一提的是，万古霉素也结合脂Ⅱ分子，但其结合位点与细菌素明显不同。因此，nisin等细菌素还可以抑制一些万古霉素抗性菌。有的细菌素也可以通过其他方式在细胞膜上形成孔洞，如Ⅱa类的细菌素lactococcin A可以结合细胞膜上的甘露糖磷酸转移系统(Man-PTS)，从而在细胞膜上形成孔洞。Microcin E492可被靶细菌细胞膜外膜上的铁载体受体识别，通过外膜受体TonB进入内膜，然后在细胞膜的内膜形成孔洞。这些孔洞都可使细胞内的钾离子流出、ATP泄露以及细胞外水分子流入，导致营养流失和细胞死亡^[49]。

细菌素的另一种抑菌作用方式是细菌素进入靶细胞内，在胞内抑制基因或蛋白的表达，从而抑制靶细菌的生长。这种方式主要是对革兰氏阴性菌，它们细胞壁组成较复杂，含有肽聚糖、脂多糖类脂质和蛋白质等多种成分，结构多层，比较紧密，除了内膜外，还有一层外膜，细菌素可通过外膜和内膜上的通道或转运蛋白进入细胞内，抑制DNA、RNA或蛋白的合成代谢等来抑制靶细胞的生长。如Microcin B17可利用靶细胞细胞膜上的外膜通道蛋白OmpF和内膜转运蛋白SbmA进入细胞内，抑制DNA超螺旋作用，从而阻抑DNA复制^[50]。拉索肽microcin J25被外膜上的铁载体受体FhuA识别后，利用内膜上的TonB和SbmA蛋白进入靶细胞内，通过影响RNA聚合酶的活性抑制RNA转录^[51]。一些thiopeptides如thiostrepton、lactocillin和GE2270A等可结合核糖体RNA、tRNA或EF-Tu等抑制蛋白合成^[52–53]。

3.2 促进益生菌在人体中定殖

人体中的细菌数量庞大、种类繁多，尤其肠道中的细菌密度较高，这就使细菌较易发生种间和种内互作，而细菌素的产生可为产生菌在肠道中的竞争性定殖提供显著性优势。如由5种益生菌鼠乳杆菌DPC6002和DPC6003、戊糖乳杆菌DPC6004、唾液乳杆菌DPC6005和戊糖片球菌DPC6006组成的复合益生菌可用来治疗沙门氏菌引起的腹泻，但只有产细菌素的唾液乳杆菌DPC6005能在回肠中占据优势^[54]。可产细菌素colicin的大肠杆菌也会比非产生菌在肠道中数量更多且留存时间更长^[55]。

对于益生菌来说，细菌素的产生不仅有利于益生菌在特定部位定殖，且能同时发挥细菌素的抑菌等益生活性，可谓一举两得。如可产细菌素21的粪肠球菌相较于不产细菌素的菌株可顺利在肠道中定殖，并竞争性取代体内不产细菌素的耐万古霉素粪肠球菌V583，这也提供了一种利用细菌素产生菌来特异性降低多药耐药菌在肠道中定殖、改善肠道菌群的潜在治疗方法^[56]。不劳特氏菌属(Blautia)是具有多种益生功能的潜在益生菌^[57]，Blautia producta可产生一种羊毛硫细菌素，有助于其定殖肠道，减少肠道中的耐万古霉素粪肠球菌^[58]。从肠道中分离的一株长双歧杆菌DJO10A能产生细菌素，相较于不产细菌素的突变株来说，它更易在肠道中定殖并发挥其抑制艰难梭菌和大肠杆菌的活性^[59]。产细菌素益生菌可能通过抑菌、竞争排斥或竞争黏附肠上皮细胞等方式来促进其在肠道中的定殖，但细菌素是如何在体内影响益生菌定殖的具体分子机制的相关研究还较少，这也是将来益生菌研究的一个很有潜力的方向。

3.3 调节肠道菌群

肠道菌群与人体互惠共生，密不可分，一般人体肠道中的微生物菌群大部分由拟杆菌门和厚壁菌门组成，具有一定的普遍性，但在不同宿主中相同门中的种属和菌株可能会有很大不同，这跟宿主本身的代谢、病原体敏感性和免疫力等的差异有关。不同菌群在肠道这种密集生态系统中发生共生和拮抗等相互作用，形成较稳定的菌群结构。细菌素的产生在微生物菌群结构的形成和变化中起了非常重要的作用，它可以促进或阻止新菌株对人体特定部位微生物菌群的入侵。一方面，细菌素产生菌较易在细菌素敏感菌占优势的部位占据生态位，改变菌群结构；另一方面，稳定菌群结构中的细菌素产生菌可以阻止或驱逐细菌素敏感菌的入侵，保证菌群结构的稳态^[53]。如肠道共生菌——单形拟杆菌产生的细菌素在肠道中可通过抵御敏感菌来调节菌群的竞争性动态变化^[60]。肠道菌群发生变化可能不同程度地影响人体健康，导致多种疾病，包括感染性疾病、炎症和代谢性疾病等^[61]。研究表明，细菌素可特异性作用于导致这些疾病相关的微生物，调节紊乱的菌群结构，从而缓解疾病症状。

除了上面所述细菌素可抑制特定的肠道致病菌外，它们在肠道中甚至会影响一些在体外检测不到的或未知的微生物来调控菌群动态变化。如唾液乳杆菌UCC118可产生Ⅱ类细菌素Abp118，体外检测主要对革兰氏阳性菌具有抑菌作用，对革兰氏阴性菌检测不到抑菌活性，而在小鼠和猪中饲喂唾液乳杆菌UCC118和不产细菌素的对照菌株，细菌素产生菌明显降低了致病性革兰氏阴性菌的丰度，在猪模型中还显著降低了螺旋体门细菌的丰度^[62]。利用高脂饮食小鼠模型研究也发现，UCC118和不产细菌素的对照菌株相比，可以明显缓解小鼠增重，而且当UCC118与肠上皮细胞粘附时，细菌素合成相关基因也明显上调^[63]。而通过比较分析粪菌移植的易腹泻仔猪肠道菌群的变化，也发现了可产细菌素的格式乳杆菌和谷物乳杆菌，它们产生的细菌素gassericin A可结合肠上皮细胞膜蛋白，促进肠液吸收和减少肠液分泌，抵抗断奶仔猪的腹泻^[64]。

细菌素主要通过发挥抑菌作用和作为信号分子影响种内和种间交流来调控肠道菌群。一方面，细菌素可广谱或窄谱性地抑制肠道中的敏感菌，降低它们在肠道菌群中的丰度；另一方面，细菌素本身作为肽类信号分子，可通过受体反应影响其他细菌的反应和行为，如通过密度控制诱导邻近菌产生细菌素等代谢产物、促使细菌发生抗性胁迫反应、影响氨基酸或能量代谢等，从而间接性地调控肠道菌群结构^[53]。

4 展望

细菌素是很多益生菌产生的重要的益生活性产物，它通过抑制致病菌、促定殖和调节肠道菌群等多种方式发挥益生功能。有的细菌素还具有调节宿主免疫、抗炎和抗肿瘤等生物活性^[8]。因此细菌素未来非常有潜力开发成安全的治疗性药物。目前对细菌素的功能研究大多集中于体外的抑菌活性及其分子机制研究，下一步将更深入地利用动物和人体试验进行细菌素的治疗性研究。益生菌产生的细菌素受到越来越多的关注，不仅因为细菌素的安全特性和具有多种益生功能，更重要的是益生菌是细菌素在体内发挥作用的理想载体，一方面，细菌素是肽类活性物质，经过胃肠道时容易被蛋白酶降解，口服益生菌可顺利地将细菌素运送到肠道发挥作用；另一方面，细菌素的产生又促进了益生菌在肠道中的定殖，使益生菌更有效地行使其益生功能。肠道菌群是益生菌和细菌素发挥益生作用的重要场所，结合飞速发展的组学手段，挖掘肠道内可产细菌素的益生菌和共生菌(下一代益生菌)，深入研究它们产生细菌素的方式，以及细菌素和产生菌与肠道菌群的关系，将为益生菌在健康尤其临床方面的应用提供新的思路。