2022, Vol. 62
表1(Table 1)
凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道健康的影响
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210671
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 刘日亮, 乔羽, 黄桂青, 钱薇, 熊佳利, 王新宇, 郑卫江, 姚文. 2022
- LIU Riliang, QIAO Yu, HUANG Guiqing, QIAN Wei, XIONG Jiali, WANG Xinyu, ZHENG Weijiang, YAO Wen.
- 凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道健康的影响
- Effect of synbiotic containing Bacillus coagulans and lactulose on gut health in mice with DSS-induced ulcerative colitis
- 微生物学报, 62(3): 869-881
- Acta Microbiologica Sinica, 62(3): 869-881
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文章历史
- 收稿日期：2021-01-07
- 修回日期：2021-01-12
- 网络出版日期：2022-01-17
引用本文 |
刘日亮, 乔羽, 黄桂青, 钱薇, 熊佳利, 王新宇, 郑卫江, 姚文. 凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道健康的影响[J]. 微生物学报, 2022, 62(3): 869-881.
Liu Riliang, Qiao Yu, Huang Guiqing, Qian Wei, Xiong Jiali, Wang Xinyu, Zheng Weijiang, Yao Wen. Effect of synbiotic containing Bacillus coagulans and lactulose on gut health in mice with DSS-induced ulcerative colitis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(3): 869-881.
凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道健康的影响
南京农业大学消化道微生物实验室, 江苏省消化道营养与动物健康重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要：[目的] 旨在探究凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠临床体征、肠道形态和肠道菌群结构的影响。[方法] 选取24只初始体重为(22.96±1.87) g的7周龄雄性C57/BL6小鼠，随机分为4组，每组6只，即CON组、DSS组(连续5 d饮用2.5% DSS水)、SYN-P组(合生元预防组，造模前7 d每日灌胃1次合生元)和SYN-T组(合生元治疗组，造模后7 d每日灌胃1次合生元)。适应期7 d，试验期19 d，随后实施安乐死采样。[结果] 第10天DSS造模后，除CON组外其余3组小鼠体重开始下降，其中DSS组小鼠体重下降速度最快且疾病活动指数(DAI)最高；第14天停止饮用DSS后，SYN-P和SYN-T组体重逐渐恢复正常，而DSS组未能恢复。与CON组相比，DSS组小鼠结肠长度显著降低(P < 0.05)，单位体重的肝脏和脾脏重量显著增加(P < 0.05)，SYN-T组小鼠单位体重的肝脏重量显著增加(P < 0.05)。组织形态学分析表明：CON组结肠绒毛高度显著高于DSS和SYN-P组(P < 0.05)，DSS组结肠隐窝深度显著高于其他三组(P < 0.05)，DSS组结肠绒毛隐窝比显著低于SYN-P和SYN-T组(P < 0.05)。盲肠菌群分析表明：菌群多样性指数显著改变(ACE、Chao1、Shannon和Anova，P < 0.05)；门水平上，相较于DSS组，SYNP组Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著下降(P < 0.05)，SYNT组脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著下降(P < 0.05)；属水平上，肠球菌属(Enterococcus)等13个优势菌属相对丰度发生改变。PICRUSt分析表明：相较于CON和DSS组，SYN-P和SYN-T组碳水化合物代谢KEGG通路显著上调(P < 0.05)；另外果糖和甘露糖代谢等11条3级代谢通路受到影响。[结论] 乳果糖和凝结芽孢杆菌合生元通过预防和治疗两种方式可缓解DSS所诱导的溃疡性结肠炎小鼠相关临床症状，改善肠道组织形态，减少肠道内引发炎症反应的Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度。
关键词：凝结芽孢杆菌 乳果糖 DSS 肠道菌群
Effect of synbiotic containing Bacillus coagulans and lactulose on gut health in mice with DSS-induced ulcerative colitis
Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Nutrition and Animal Health, Laboratory of Gastrointestinal Microbiology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China
Abstract: [Objective] To investigate the effect of synbiotic containing Bacillus coagulans and lactulose on clinical symptoms, intestinal morphology and microbiota in mice with dextran sodium sulfate (DSS)-induced ulcerative colitis. [Methods] A total of 24 7-week-old male C57/BL6 mice with initial body weight of (22.96±1.87) g were randomized into 4 groups (6 in each): control group (CON), DSS group (2.5% DSS in water for 5 days), SYN-P group (gastric gavage of oral synbiotic once a day for 7 days before DSS administration), and SYN-T group (gastric gavage of oral synbiotic once a day for 7 days after DSS administration). After 7-day pre-feeding period and 19-day experimental period, the mice were euthanized and samples were collected. [Results] On the 10th day in the experimental period, except CON group, mice began to lose weight, among which DSS group had the fastest weight loss and the highest disease activity index (DAI). After DSS treatment was terminated (14th day), the body weight of SYN-P and SYN-T groups gradually returned to normal level, while that of DSS group did not. Compared with CON group, DSS group showed decrease in colon length (P < 0.05) and increase in liver and spleen indexes (liver or spleen weight/body weight) (P < 0.05), while SYN-T group demonstrated rise of liver index (P < 0.05). As for the histomorphology, the height of colon villi in CON group was larger than that in DSS and SYN-P groups (P < 0.05), and colonic crypt depth in DSS group was larger than that in the other three groups (P < 0.05). The villus height-to-crypt depth ratio in DSS group was significantly smaller than that in SYN-P and SYN-T groups (P < 0.05). As to the caecal microflora, the diversity indexes (ACE, Chao1, Shannon, and Anova) of microflora changed (P < 0.05). At the phylum level, the relative abundance of Desulfobacterota and Deferribacteres in SYN-P group decreased (P < 0.05) and that of Deferribacteres in SYN-T group reduced (P < 0.05) compared with that in DSS group. At the genus level, the relative abundance of 13 dominant genera such as Enterococcus changed. PICRUSt analysis showed that the KEGG pathway of carbohydrate metabolism was up-regulated in SYN-P and SYN-T groups compared with that in CON and DSS groups (P < 0.05). In addition, 11 pathways at KEGG level 3, including fructose and mannose metabolism, were affected. [Conclusion] Synbiotic containing B. coagulans and lactulose can relieve clinical symptoms in mice with DSS-induced ulcerative colitis, improve the intestinal morphology, and reduce the relative abundance of Desulfobacterota and Deferribacteres that caused inflammatory response in the intestinal tract through prevention and treatment.
Keywords:
Bacillus coagulans lactulose DSS intestinal microbiota
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性炎症疾病，临床特征包括肠道黏膜病变和溃疡、结肠变窄、腹泻和大便带血等现象，发病率与复发率极高，严重影响人类和动物的健康[1–2]。其病因尚未明确，可能涉及心理因素、遗传异质性、免疫反应失调和肠道微生物等多个方面，其中肠道微生态失调被认为可能是发病的潜在机制，主要涉及某些致病菌(如变形杆菌)的升高和益生菌(如乳酸杆菌)的减少等[3–4]。
因发病机制尚未明确，UC目前治疗策略主要侧重于通过药物预防和恢复由各种诱因引起的肠道过激免疫性反应[5]。在我国2020年7月1日“禁抗令”这一划时代的法令颁布之前，人们热衷于采取向饲料中添加抗生素来达到预防和治疗动物的UC，然而抗生素在使用过程中导致的细菌耐药性、机体残留和降解困难等一系列负面影响严重威胁了生态安全和人类健康。因此，在高度关注生态化、无害化和零残留的今天，急需寻求一种新型、有效、稳定的抗生素替代物来解决UC这一问题。
益生菌和益生元近年来已被证明可调节肠道微生物组成、促进有益菌的增殖并抑制致病菌的生长，通过改善肠道微生态为UC治疗提供了一种高效且低毒的新策略[6–7]。凝结芽孢杆菌是一种常用益生菌，其代谢产物主要以L-乳酸为主，能够通过降低胃肠道的pH值和分泌抗菌肽调节肠道菌群结构，进而抑制有害菌的生长，有利于恢复胃肠道的生态平衡[8]。此外凝结芽孢杆菌菌体的活性抗原能够刺激机体的非特异性免疫反应，从而提高机体免疫力减少炎症反应[9]。乳果糖是由一分子半乳糖和一分子果糖组成的功能性寡糖，不能被宿主消化酶降解，在结肠内菌群的作用下降解生成高浓度小分子有机酸和氢气[10]。研究表明[11]，0.5%乳果糖可选择性地促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖，使其形成优势菌群，而大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌很难利用功能性寡糖作为碳源营养物，因此抑制了致病菌的繁殖与代谢，维持了肠道微生态平衡。
合生元是由益生菌(如上述的凝结芽孢杆菌)和益生元(如上述的乳果糖)组合而成的生物制剂，兼具益生菌和益生元的益生效果，且效果往往优于单一使用益生菌或益生元。合生元通过益生元增强益生菌在肠道的附着和繁殖，从而改善动物肠道环境，提高饲料转化率[12]。因此，本试验旨在探究凝结芽孢杆菌-乳果糖合生元对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠生长性能、肠道形态和肠道菌群结构的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料合生元：本研究配方包含凝结芽孢杆菌(活菌数1×109 CFU/g，由江苏远山生物技术有限公司提供)和乳果糖口服溶液(商品编号Z1080403016，购自江苏先声再康药业有限公司)；DSS [相对分子质量为20 000-50 000，购自翌圣生物科技(上海)有限公司]；DNA提取试剂盒(QIAGEN，QIAamp® fast DNA stool mini Kit，Cat No. 51614，德国)；灌胃合生元工作液配置：每日将1.5 g菌粉溶解于4.5 mL PBS中混匀，然后将4.5 mL菌粉溶液与1.5 mL乳果糖溶液(667 mg/mL)转移至15 mL离心管中混匀，即为灌胃工作液。
1.2 试验设计选取24只初始体重为22.96±1.87 g的7周龄雄性C57/BL6小鼠，随机分为4组，每组6只，即CON组、DSS组、SYN-P组(合生元预防组)和SYN-T组(合生元治疗组)(见图 1)。然后置于南京农业大学屏障动物中心[光照周期为12 h/d；温度为(22±2) ℃；相对湿度(50±5)%]饲喂标准日粮，适应一周后开始试验。试验期共19 d：DSS组、SYN-P组和SYN-T组在第8天到第12天进行DSS造模(将2.5% DSS溶解于水中供小鼠饮用)；SYN-P组在DSS造模前7 d (即试验第1–7 d)每日灌胃1次合生元(每只小鼠灌胃1×109 CFU凝结芽孢杆菌及100 μL乳果糖；处理小鼠时颠倒混匀工作液，用移液器转移400 μL工作液至1.5 mL离心管中，用配备灌胃针的注射器吸取后灌入小鼠胃中)，其余试验日灌胃PBS；SYN-T组在DSS造模后7 d (即试验第13– 19 d)每日灌胃1次合生元(同上)，其余试验日灌胃PBS；CON组和DSS组则于所有试验日灌胃PBS。
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| 图 1 试验设计 Figure 1 Study design. |
1.3 样品采集
实验结束时，用二氧化碳法对小鼠实施安乐死，随后用解剖剪沿腹中线打开腹腔。取大约2 cm长的结肠组织冲洗干净并置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续组织切片观察；收集盲肠内容物迅速装入2 mL灭菌冻存管，–80 ℃保存用于后续微生物相关分析。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 生长性能和疾病活动指数(disease activity index)评分根据标准方案[13](表 1)每天准确记录小鼠的采食量、体重、直肠出血和大便黏稠度并评分，将体重、直肠出血和大便黏稠度3项得分的总值作为疾病活动指数。对小鼠解剖采样时称量肝脏和脾脏重量，测量结肠长度。
表 1. 疾病活动指数评分标准
Table 1. Disease activity index (DAI) scoring criteria
| Score | Weight loss/% | Rectal bleeding | Stool consistency |
| 0 | 0 | Normal | Normal |
| 1 | 0.1–5.0 | Small amount of blood | Loose normal |
| 2 | 5.0–10.0 | Blood in stool regularly seen | Mild diarrhea |
| 3 | ＞10.0 | Blood in all stool | Diarrhea |
1.4.2 结肠组织形态学分析
将于4%多聚甲醛溶液中固定24 h的结肠组织取出，并按照脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色共6个步骤处理[14]。利用光学显微镜对肠道组织形态进行观察，随机选取3–5个典型视野中共10根走向平直的绒毛，参照刘秋东等[15]借助ImageJ软件测量小肠绒毛长度、隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度比。
1.4.3 肠道菌群分析取0.2 g左右小鼠粪便样品使用QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN，Hilden，德国)试剂盒并严格按照说明书提取总DNA，使用NanoDrop超微量分光光度计(Nano-drop-2000，Nano-Drop Technologous，美国)测定浓度与纯度。
利用PCR仪(GeneAmp®9700型，ABI，美国)扩增小鼠粪样细菌16S rRNA基因高变区V3–V4，细菌通用引物使用正向引物341F (5ʹ-CCTAYGGGRBGCASCAG-3ʹ)和反向引物806R (5ʹ-GGACTCNNGGGTATCTAAT-3ʹ)。纯化后的扩增产物在Illumina MiSeq PE250平台(Illumina，San Diego，USA)按照标准操作流程构建PE 2×300文库，依托上海凌恩生物科技有限公司完成。
测序得到的fastq文件使用QIIME (1.17)进行质量过滤，之后使用UPARSE软件包(7.1)在97%相似水平进行OTU (operational taxonomic units)聚类分析并且用UCHIME删除嵌合序列[16–17]。原始数据已上传NCBI (National Center for Biotechnology Information；accession No. SRP344234)。比对数据库SILVA (SSU132)，使用RDP (ribosomal database project)算法对OTU进行分类，置信阈值设定为70%[18]。为评估各组间微生物多样性的差异，基于OTU相对丰度进行了单样本多样性(α-多样性)和组间多样性(β-多样性)分析。用于可视化不同组别之间数据集交集的Venn图通过在线绘制网站绘制(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。基于Unweighted Unifrac算法的非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)坐标图评估菌群β-多样性。用于进一步比较分析的门和属水平微生物筛选标准为平均相对丰度 > 1%且有效样本数≥80%。
1.4.4 基于16S rRNA基因序列的肠道菌群功能预测基于OTU原始丰度表通过生物信息学软件PICRUSt预测宏基因组功能基因，将预测基因与KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库比对进行功能注释。
1.5 数据统计和分析数据通过Microsoft Excel初步整理后，使用SPSS® Statistics 26.0统计软件进行Shapiro- Wilk test检验其正态性，然后根据正态分布与否分别用One-Way ANOVA或Kruskal-Wallis进行组间差异检验，利用Turkey-Kramer test进行多重比较。数据表现方式为平均值(mean)±标准误(SEM)。P < 0.05作为差异显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 饲用合生元对DSS感染小鼠结肠炎体征的影响合生元对小鼠结肠炎体征的影响如图 2所示。由图 2A所示，第10天起，除CON组，其余3组小鼠体重开始出现下降，其中DSS组下降速度最快；在第14天停止饮用DSS后，SYN-P组和SYN-T组均逐渐恢复至正常对照组水平，而DSS组未能恢复。由图 1B所示，第13天DSS组的DAI评分最高，其次是SYN-T组，SYN-P组显著低于DSS和SYN-T组。由图C、D所示，与CON组相比DSS组结肠长度明显缩短(P < 0.05)，而SYN-T组和SYN-P组与CON组无显著差异(P > 0.05)。由图 1E、F所示，与CON组相比DSS组和SYN-T组单位体重的肝脏重量显著增加(P < 0.05)，且DSS组单位体重的脾脏重量显著增加(P < 0.05)，SYN-P组肝脏重量和脾脏重量与CON组无显著差异(P > 0.05)。
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| 图 2 合生元对DSS刺激小鼠结肠炎体征的影响 Figure 2 Effects of synbiotic on clinical signs of mice with DSS-induced ulcerative colitis. A: body weight; B: DAI; C, D: the length of the colon; E: liver weight/body weight; F: spleen weight/body weight. |
2.2 饲用合生元对DSS刺激小鼠结肠组织形态的影响
由表 2可知，对照组结肠绒毛高度显著高于DSS和SYN-P组(P < 0.05)，和SYN-T组无差异(P > 0.05)。DSS组结肠隐窝深度显著高于其他3组(P < 0.05)。CON组结肠绒隐比显著高于其他3组(P < 0.05)，且SYN-P和SYN-T组结肠绒隐比显著高于DSS组(P < 0.05)。
表 2. 合生元对DSS刺激小鼠结肠组织形态的影响
Table 2. Effects of synbiotic on the colon morphology of mice with DSS
| Items | Treatment groups | SEM | P-value | |||
| CON | DSS | SYN-P | SYN-T | |||
| Villus height/μm | 196.78a | 162.72b | 157.57b | 180.42ab | 5.72 | 0.050 |
| Crypt depth/μm | 68.35b | 81.04a | 66.29b | 72.53b | 2.02 | 0.037 |
| Villus height/crypt depth | 2.87a | 2.03c | 2.38b | 2.49b | 0.08 | 0.000 |
如图 3所示，对照组结肠组织各层清晰可见、黏膜上皮完整且连续、腺体排列整齐、未发生炎症细胞浸润、未见溃疡；DSS组小鼠结肠组织有肉眼可见的病理损伤、黏膜发生脱落、黏膜层结构明显水肿、黏膜上皮细胞不完整、可看到典型的溃疡等。同DSS组相比，SYN-P和SYN-T组的小鼠结肠损伤显著降低，黏膜组织结构也相对完整，固有层有少量炎症细胞浸润，未见溃疡。
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| 图 3 合生元对DSS刺激小鼠结肠组织形态的影响 Figure 3 Effects of synbiotic on the colon morphology of mice with DSS. |
2.3 饲用合生元对DSS刺激小鼠盲肠微生物多样性的影响
如图 4A和B所示，SYN-T组丰度指数(ACE和Chao1)和多样性指数(Shannon)显著低于CON组(P < 0.05)，与其他两组无差异(P > 0.05)。基于Unweighted Unifrac距离的NMDS分析表明各组微生物区系明显分开(图 4C，P < 0.05)，其中CON组较为集中。韦恩图(图 4D)用于分析各组共有和独有OTU数目，CON组总OTU数目显著高于SYN-P组和SYN-T组(P < 0.05)，其独有OTU数目最多，为788个。
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| 图 4 合生元对DSS刺激小鼠盲肠微生物多样性的影响 Figure 4 Effects of synbiotic on the cecal microbial diversity of mice with DSS. A–B: α-diversity; C: β-diversity; D: Venn analysis. |
2.4 饲用合生元对DSS刺激小鼠盲肠菌群结构的影响
合生元对DSS刺激小鼠盲肠菌群组成的影响如图 5所示。在门水平上(图 5A)，优势菌门依次为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)，占小鼠菌群的99%以上。在属水平上(图 5B)，有30个属相对丰度大于1%为优势菌属。
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| 图 5 合生元对DSS刺激小鼠盲肠菌群组成的影响 Figure 5 Effects of synbiotic on the cecal microbial composition of mice with DSS. A: phyla levels; B: genus levels; relative abundance > 1%. |
合生元对DSS刺激小鼠盲肠中差异微生物相对丰度的影响如图 6所示。门水平上，相较于DSS组，SYN-P组Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著下降(P < 0.05)，SYN-T组脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著下降(P < 0.05)。属水平上，相较于CON组，SYN-T组毛罗杆菌科NKA136群(Lachnospiraceae NK4A136 group)、毛螺杆菌科未分类(Lachnospiraceae uncultured)、嗜木聚糖真杆菌群([Eubacterium] xylanophilum group)、氏菌属(Roseburia)和Alistipes相对丰度显著下降(P < 0.05)，SYN-P组毛螺杆菌科未分类(Lachnospiraceae uncultured)、嗜木聚糖真杆菌群([Eubacterium] xylanophilum group)和氏菌属(Roseburia)显著下降(P < 0.05)，DSS组嗜木聚糖真杆菌群([Eubacterium] xylanophilum group)、氏菌属(Roseburia)显著下降和肠球菌属(Enterococcus)显著上升(P < 0.05)。相较于DSS组，SYN-T组惰性真杆菌群([Eubacterium] siraeum group)、颤螺旋菌科未分类(Oscillospiraceae_uncultured)、Odoribacte、弧菌科未分类(Desulfovibrionaceae_uncultured)和Mucispirillum显著下降(P < 0.05)，SYN-P组惰性真杆菌群([Eubacterium] siraeum group)、Odoribacte和Mucispirillum显著下降，另外SYN-T组Limosilactobacillus显著上升(P < 0.05)。
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| 图 6 合生元对DSS刺激小鼠盲肠中差异微生物相对丰度的影响 Figure 6 Effects of synbiotic on the relative abundance of cecal difference microbiota of mice with DSS. |
2.5 小鼠盲肠微生物功能预测分析
小鼠盲肠菌群16S rRNA基因序列的PICRUSt分析表明，合生元显著影响DSS刺激小鼠的盲肠菌群功能，共影响KEGG二级代谢通路4条和三级代谢通路11条(表 3)。在二级代谢通路中，功能基因主要富集在碳水化合物代谢通路，SYN-P和SYN-T两组的相对丰度显著高于其他两组(P < 0.05)。三级代谢通路上，糖酵解与糖原异生、果糖和甘露糖代谢、光合生物的碳固定、磷酸转移酶系统与谷胱甘肽代谢等通路主要在合生元两组富集，细菌运动蛋白和细菌趋化性等主要富集在CON组和DSS组，双组分信号系统等主要富集在DSS组。
表 3. 合生元对DSS刺激小鼠盲肠菌群功能预测KEGG通路的影响
Table 3. Effects of synbiotic on the cecal bacterial functional prediction of KEGG metabolic pathways of mice with DSS
| KEGG levels | KEGG pathways | Relative abundance/% | SEM | P-value | |||
| CON | DSS | SYN-P | SYN-T | ||||
| 2 | Carbohydrate metabolism | 10.52b | 10.59b | 11.03a | 11.25a | 0.779 | 0.005 |
| 2 | Cell motility | 2.42a | 2.18a | 1.26b | 0.97b | 0.162 | 0.007 |
| 2 | Signal transduction | 1.68ab | 1.84a | 1.52bc | 1.37b | 0.049 | 0.011 |
| 2 | Environmental adaptation | 0.16a | 0.17a | 0.15b | 0.14b | 0.002 | 0.011 |
| 3 | Glycolysis/gluconeogenesis | 1.08c | 1.11bc | 1.16ab | 1.18a | 0.010 | 0.021 |
| 3 | Fructose and mannose metabolism | 0.98b | 0.99b | 1.17a | 1.24a | 0.032 | 0.022 |
| 3 | Propanoate metabolism | 0.48b | 0.49b | 0.52b | 0.55a | 0.007 | 0.044 |
| 3 | Bacterial motility proteins | 1.05a | 0.95a | 0.47b | 0.32b | 0.082 | 0.012 |
| 3 | Flagellar assembly | 0.53a | 0.39ab | 0.15bc | 0.08c | 0.049 | 0.021 |
| 3 | Bacterial chemotaxis | 0.49a | 0.50a | 0.28b | 0.21b | 0.034 | 0.035 |
| 3 | Two-component system | 1.53ab | 1.70a | 1.37bc | 1.22c | 0.050 | 0.020 |
| 3 | Carbon fixation in photosynthetic organisms | 0.61c | 0.64bc | 0.67ab | 0.69a | 0.008 | 0.023 |
| 3 | Phosphotransferase system (PTS) | 0.49b | 0.32c | 0.67ab | 0.90a | 0.060 | 0.018 |
| 3 | Base excision repair | 0.45c | 0.46bc | 0.50ab | 0.52a | 0.007 | 0.047 |
| 3 | Glutathione metabolism | 0.18b | 0.17b | 0.18ab | 0.21a | 0.004 | 0.025 |
3 讨论
UC作为一种主要的炎症性肠病，具体发病机制迄今尚未明确。部分研究已表明，肠道微生物与肠道炎症之间有密不可分的关系，例如将患有结肠炎小鼠的肠道菌群移植到无菌小鼠中会引起肠道炎症[19]。所以，在UC的防治中越来越重视肠道菌群的作用，而由各种原因引起的肠道菌群失调往往是致病菌数量增加而益生菌数量减少。大量文献报道，在饮食中添加特定益生菌可以调整肠道菌群结构，竞争性排除病原微生物，从而预防和治疗肠道炎症[20]。本课题组前期研究发现，在仔猪无抗日粮中添加乳果糖-凝结芽孢杆菌合生元可改善仔猪的生长性能、腹泻率和代谢等[21–22]。因此，本试验在前期的基础上进一步探讨乳果糖-凝结芽孢杆菌合生元在治疗和预防两种方式上对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道健康的影响。
本研究中，2种合生元处理均减轻了由DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状，如体重、DAI指数、结肠长度及肝脏和脾脏重量在一定程度上被改善。其中DSS造模后可发现合生元预防组小鼠DAI评分低于治疗组小鼠，治疗组小鼠灌胃合生元后DAI评分迅速下降，这表明合生元对小鼠健康有实时的积极影响。另外，肠道免疫激活和炎症反应增加与肠道结构受损密切相关[23]。本试验中组织病理学评分进一步证实上述结果，DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠表现出结肠损伤且两种合生元处理均在一定程度上缓解该症状。这些结果表明乳果糖-凝结芽孢杆菌合生元通过两种处理均在一定程度上缓解了小鼠的溃疡性结肠炎。
同时，宿主与肠道微生物之间存在动态平衡，结肠组织损伤引起屏障功能丧失往往伴随着肠道菌群的结构改变[24]。另外，微生物数据库可用性的提高和分子生物学技术的最新发展提高了对微生物群落表征的认识，并揭示了肠道微生态失调与肠道炎症之间的关系[25]。本研究通过16S rRNA基因高通量测序发现，DSS诱导小鼠产生结肠炎后，灌胃合生元治疗对小鼠盲肠菌群多样性影响更大，包括多样性指数ACE、Chao1和Simpson和独有OTU数目降低。这可能是由于采样前治疗组小鼠仍在灌胃合生元，提示合生元治疗较预防对肠道菌群多样性有更大的动态影响。
虽然小鼠经过两种合生元处理后结肠个别属水平微生物和KEGG通路有一定差异，但整体趋势一致，提示合生元对小鼠肠道菌群有一定动态影响。与实验室先前研究结果类似[26]，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)是小鼠的2个主要菌门。本研究中，合生元可显著降低灌胃DSS模型小鼠盲肠食糜中Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度。Huang等[27]研究表明，Desulfobacterota可能释放LPS到肠道引起炎症反应，同时扰乱肠道能量代谢。在患有炎症性肠病的小鼠和猪模型中，脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著升高[28–29]；灌胃小鼠益生菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) HDB1258时，脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度显著降低[21]。小鼠盲肠食糜菌群PICRUSt功能预测分析得出类似结果，细菌运动性蛋白和鞭毛组装KEGG通路主要富集在对照组和DSS组，而合生元两组显著改善。细菌运动性蛋白和鞭毛组装通路作为病原菌粘附到绒毛和入侵上皮细胞必不可少的途径，容易导致肠道产生炎症性损伤[30–31]。属水平分析进一步表明，益生菌Limosilactbacillus[24]在合生元治疗组显著上升；与炎症呈正相关的肠球菌属(Enterococcus)[32]和Mucispirillum[33]及可分泌毒素破坏肠黏膜的弧菌科(Desulfovibrionaceae_uncultured)[34]在DSS组显著上升，且通过合生元处理可降低这些致病菌的丰度。有趣的是，尽管多数差异菌相对丰度在DSS组较高，但碳水化合物代谢KEGG通路主要富集在合生元两组，这可能是因为与肠炎相关的致病菌有较低的能量代谢、微生物信号调节和细胞处理途径[35]。同时，磷酸转移酶系统KEGG通路在DSS组下调证实了该结果。磷酸转移酶系统主要参与葡萄糖的运输，可运送糖类物质给微生物提供能量进行代谢[36]。
综上所述，乳果糖和凝结芽孢杆菌合生元通过预防和治疗两种方式可降低DSS所诱导的溃疡性结肠炎小鼠DAI指数，增加体重和结肠重量，改善肠道组织形态，减少肠道内引发炎症反应的Desulfobacterota和脱铁杆菌门(Deferribacteres)相对丰度，一定程度上缓解了肠道炎症。
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