由抗生素滥用引发的抗生素耐药性已经成为不容忽视的全球性问题，严重威胁环境与人类健康以及社会经济的有序发展。目前每年有70万人的死亡与抗生素抗性有关，如若不采取任何措施这一数字将于2050年上升至1 000万人，并造成数以百万亿计的经济损失^[1]。为此世界卫生组织(WHO)于2014年发布了“控制细菌耐药全球行动计划”，旨在呼吁全球合作遏制抗生素抗性的进一步发展。

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)是导致细菌产生抗生素耐药性的“元凶”，因其具备生物活性、迁移转化途径复杂和种类多样等特点，被视作一种新型环境污染物^[2]。抗性基因是自然存在的、编码抵抗抗生素功能的基因片段^[3]。受人类活动的影响，环境中抗生素选择压力持续存在，抗性基因在环境中的丰度也在不断升高^[4]。为了有效阻控抗生素抗性基因在环境中的传播，国内外学者对其增殖传播机制开展了大量研究，但总体上较为宏观，对于抗生素抗性基因存在形式关注较少。直到2013年Mao等^[5]和Zhang等^[6]在胞内/胞外基因的基础上衍生出了胞内抗生素抗性基因(intracellular antibiotic resistance genes，iARGs)和胞外抗生素抗性基因(extracellular antibiotic resistance genes，eARGs)的概念。

环境条件和自身性质的差异使iARGs与eARGs具有截然不同的环境分布及基因转移特征^[7]。iARGs在适宜微生物大量生长的养殖场、污水厂等受人类活动直接影响的环境中占主导，可以随抗生素抗性菌的增殖而扩增，并以垂直基因转移的方式从亲代传递给子代，也可以通过接合和转导两种水平基因的方式实现种内和种间传递^[8]。而eARGs在土壤、沉积物、海洋等自然环境中分布更为广泛，可通过转化过程被环境中感受态细胞获取，使其具有持久性和迁移能力^{[5, 9]}。研究表明，相较于游离态的eARGs，环境介质中吸附在介质界面的吸附态eARGs的转化能力更强^[10]。

为了更好地认识抗生素抗性基因的环境行为，需要进一步开展分类研究，区分iARGs和eARGs在不同环境中的分布特性、传播特征及其对人类健康的差异化影响。因此，本文从明确iARGs和eARGs的定义出发，概述了针对不同环境样本iARGs和eARGs检测方法，总结了iARGs与eARGs在不同生境中的丰度分布特征、传播方式及影响因素，在合理分析现存问题的基础上对未来研究方向进行了前瞻性展望。

1 iARGs与eARGs的分类原则

由于基因在环境中赋存形态的复杂性以及分离方法的局限性，目前研究当中对于iARGs与eARGs的界定没有统一标准。Mao等^[5]和Zhang等^[6]首先依据胞内DNA(iDNA)和胞外DNA(iDNA)存在形式将ARGs分为两类，随后Wang等^[11]提出了胞内、胞外抗生素抗性基因的概念即iARGs和eARGs^{[5–6, 11]}。Mao等进一步将eARGs分为质粒抗性基因(plasmid-borne ARGs)和染色体抗性基因(chromosomal ARGs)，并进行比较研究^[5]。Zhang等考虑了eDNA的吸附性，并以其为依据进行分类研究，将eDNA细分为细胞/颗粒吸附的胞外DNA (cell- associated DNA)和游离态的胞外DNA (cell-free DNA)^[12]。Yu等则根据尺寸大小将ARGs分为颗粒组分(particl-associated assemblages，＞3 μm)、游离态细菌组分(free-living，0.2–3 μm)和无细胞组分(free-living，＜0.2 μm)的ARGs^[13]。He等则根据载体的不同将ARGs分为细菌携带的iARGs、噬菌体携带的eARGs和游离态的eARGs^[14]。为了系统分析ARGs在环境中的分布与传播，本文整合上述分类依据，从赋存形态与形成过程的角度，对iARGs和eARGs给予明确的分类依据(图 1)。

iARGs和eARGs是抗性基因存在的2种形式：(1) iARGs是指由胞内基因载体携带的ARGs，包括完整细胞个体中由染色体携带的ARGs和质粒携带的ARGs；(2) eARGs是指由胞外基因载体携带的ARGs，依据eARGs在环境介质中的赋存形态可分为游离态(f-eARGs)、吸附态(a-eARGs)和噬菌体携带(phage-associated ARGs)的染色体和质粒抗性基因^[14–15]。

需要指出的是，环境中不同形式ARGs的相对比例是动态变化的。一方面iARGs可以通过死细胞的裂解或活细胞的分泌释放到胞外环境，以eARGs的形式存在于环境中；另一方面，环境中的eARGs也可以通过转化进入细胞内成为iARGs。因此，环境样品中iARGs与eARGs分类表征方法的建立，是ARGs分类研究的关键，是精准刻画ARGs环境分布与传播特征的基础，也是科学评估ARGs环境与健康风险的前提。

2 iARGs和eARGs的分离检测方法

环境样本中iARGs与eARGs的分类研究主要包括预处理-分离-回收-检测4个步骤。其中分离和检测方法在研究领域内已经初步统一。分离方法以过滤为核心，鉴于细菌直径通常大于0.5 μm，因此常采用0.20–0.22 μm孔径过滤区分iARGs和eARGs^{[5, 16–17]}。检测方面，基于PCR技术的基因检测是抗生素抗性基因研究的主流方法，包括基于二代测序的宏基因组分析、高通量qPCR芯片等^[18]。

由于环境介质的复杂性，环境样品中iARGs和eARGs分离预处理方法与分离后的高效回收是当前研究的难点(图 2)。对于固体样品中iARGs和eARGs的回收，Mao等在传统的iDNA提取的基础上进行改良，将样品与NaH₂PO₄和交联聚维酮(PVPP)混合、振荡、离心后，对上清液进行抽滤实现iARGs和eARGs的分离，随后采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法回收沉积物的eARGs，并以植物病原菌(Xcc8004)携带的XC2068基因和纤维素合成酶基因CESA9分别作为胞内和胞外基因的内参计算回收率^[5]。CTAB法可有效去除样品中多糖和蛋白等杂质，已广泛应用于生物膜、污泥、沉积物、粪便等固体样品的iARGs和eARGs的提取^{[10, 19–22]}，但是采用CTAB法对水体样品进行胞外基因提取时，由于水相生物量较小无法对DNA有效浓缩，因此提取效率较低(＜10%)^[15]。

因此在水体样品回收eARGs时通常采用乙醇-醋酸钠沉淀法，利用Na⁺离子平衡DNA的负电荷促进DNA的富集。目前该方法也广泛应用于自来水、污水中iARGs和eARGs的提取^[12–13]。

磁珠提取法和核酸吸附颗粒提取法则是通过特殊富集材料的使用进一步提高eARGs的回收效率^{[11, 15]}。Yuan等利用羟基修饰的Fe₃O₄磁珠对核酸可逆吸附的能力，富集污水中的核酸物质，并通过磁场将核酸与磁珠分离，不受样品条件的限制，胞外DNA的提取效率大于85.3%^[15]。Wang等研究制备了一种新型的核酸吸附颗粒(NAAP)，依靠氢氧化铝包裹的二氧化硅颗粒与核酸间的静电吸附作用，从大体积水体中富集并分离胞内和胞外的DNA，回收率可以高达95%^[11]。

与土/水样品相比，空气样品中iARGs和eARGs相关研究报道较少，但考虑到人们健康需求的日益提升，抗生素抗性基因随大气传播对人类健康的潜在威胁将受到越来越多的关注。He等通过微纤维膜采集空气中样品后，经过一定时间的超声在避免细胞裂解的同时从颗粒物中分离细胞相，随后采用醋酸钠乙醇沉淀法对胞内胞外遗传物质进行分离并检测各组分抗性基因^[14]。

然而上述方法只是在传统胞内胞外基因检测的基础上进行了一些细节的优化，并没有解决以过滤为核心的分离方法精度较低等问题。由于eARGs组分较为复杂，仍然需要在胞外DNA的精细化分离上做针对性的研发。

3 iARGs和eARGs的环境分布与传播 3.1 iARGs和eARGs的分布特征及其影响因素

iARGs和eARGs在不同生境中的分布特征不同，其中eARGs占比(在ARGs总和丰度中的占比)在流域上游养殖场＜污水处理厂＜大气＜城市供水系统＜医院环境＜流域下游生境(图 3)。集约化养殖过程中，抗生素作为抑菌剂和生长促进剂被大量使用，耐药微生物在抗生素的选择作用下不断增殖，使iARGs的绝对丰度比eARGs高2–3个数量级。例如，Dong等从猪粪中检测到的iARGs绝对丰度高达1.11× 10¹¹ copies/g，比eARGs高160倍^[10]。Yuan等调查了两个水产养殖场底泥的iARGs和eARGs，发现抗性基因主要存在于胞内，iARGs和eARGs的比值为7.9–45.5^[20]。这与Zhang等在畜禽养殖废物处理池污泥中发现的iARGs和eARGs分布情况相似^[6]。

在污水处理厂，营养物质的持续输入为微生物提供了适宜的增殖条件，较低的抗生素选择压力使iARGs的绝对丰度比eARGs高1–2个数量级。Yu等检测并分析了污水处理厂各构筑物污水的iARGs和eARGs分布情况，总体上iARGs的绝对丰度为6.3×10⁶–1.0×10⁹ copies/mL，eARGs为2.8×10⁵–7.1×10⁸ copies/mL^[13]。在污水生物处理过程中，二沉池出水的iARGs和eARGs绝对丰度相比于进水显著降低，但其相对占比无显著变化^[23]。但经过紫外或氯消毒后，eARGs占比随细胞凋亡显著增加，表明污水处理厂可能是eARGs和iARGs形态转化的重要场所^[24–25]。

大气流动是抗性基因区域传播和远距离传输的主要驱动力之一^[26–27]。研究表明，在空气中iARGs的绝对丰度较eARGs高约1个数量级。例如He等调查PM_2.5中iARGs和eARGs丰度，发现空气中iARGs的绝对丰度为3.36×10³–4.16×10⁵ copies/m³，eARGs绝对丰度为1.35×10³–3.00×10⁴ copies/m³，而不同城市ARGs的赋存特征与气象条件和气体组分差异有关^[14]。

城市供水系统是抗性基因在人群暴露的重要途径，抗性基因在自来水管网中的出现对生产生活中的用水安全构成了威胁。研究表明，在城市供水系统中iARGs较eARGs高0–1个数量级。例如，天津市中心城区集中供应管网末梢水的iARGs是eARGs的3.8倍^[28]。Hao等对自来水中iARGs与eARGs进行了年度监测，结果表明，iARGs和eARGs分别占总ARGs的77.4%和22.6%，且其变化规律与自来水中的余氯浓度有相关性^[29]。

在医院环境中，抗生素的密集使用以及病原菌的大量存在使医院环境的细菌耐药性水平不断升高，为多重耐药病原菌提供了良好的增殖条件^[30]。现有研究表明，医院环境的iARGs与eARGs分布情况与自然环境不同，其中iARGs的绝对丰度较eARGs低0–1个数量级。例如，在富集了医院大量残留抗生素和病原菌的医院废水处理设施中，iARGs的绝对丰度为4.89×10⁹ copies/mL，而eARGs的绝对丰度为1.36×10¹⁰ copies/mL^[10]。

河口等临近水域生态系统是内陆河流和陆地与海洋交汇所形成的生态系统，接纳了大量来自河道径流和陆源排放的污染物，具有较高的抗性基因多样性和丰度^[31]。以我国华北地区最大的水系——海河为例，沿线河道、入海口及近海中eARGs多样性和丰度均高于iARGs^{[5, 22, 32]}。其中，排污口下游河道沉积物中eARGs绝对丰度高达3×10¹⁰ copies/m^3[5]。长江水系也有类似规律，入海口沉积物中iARGs和eARGs分别占总ARGs的22%和78%。与之相比，近海中的eARGs丰度进一步升高至90%^[32]。

可见iARGs和eARGs在不同环境中的丰度与多样性受环境因素(包括营养水平、温度、pH、颗粒物胶体等)和自身性质(包括存在状态、结合形式、片段长度等)的协同影响。丰富的营养物质可以为环境中的微生物提供理想的生长条件，从而促使抗性微生物的增殖，导致iARGs相对丰度提高^[6]。因此，在营养物质丰富的污泥、污水、粪便中iARGs丰度通常较高^{[10, 13]}。土壤、沉积物和气溶胶等环境中存在着丰富的颗粒物和胶体，可以吸附胞外DNA并保护其免于脱氧核糖核酸酶的降解^[33]。相较于砂土，黏土对胞外DNA的吸附能力更强，使eARGs具有更强的持久性^[33]。而温度、盐度、pH等因素可以影响脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性进而影响eARGs的环境丰度^[33–34]。此外，DNA的存在形式是影响iARGs和eARGs分布的另一个重要因素。eARGs(染色体携带或质粒携带)相较于iARGs (细菌个体)具有更高的比表面积和分子灵活性，更易吸附于颗粒物表面，转变为结合态抗性基因，因此在土壤和沉积物等eARGs具有更强的持久性^[35–36]。

3.2 iARGs和eARGs的传播差异

环境中ARGs的传播方式和能力决定了其向病原菌转移和造成潜在健康风险的可能性。由于基因存在形式的差异，iARGs和eARGs在环境中具有截然不同的传播方式，有必要进一步探究不同环境中iARGs和eARGs的传播能力及其影响因素。

3.2.1 iARGs的传播方式

iARGs可以通过接合转移和转导的方式进行水平基因转移。接合转移是iARGs在细胞与细胞间传播的主要方式，也是目前研究最多的水平转移方式。iARGs通过广宿主质粒穿过细胞与细胞间的微孔实现接合转移。不同环境中接合转移发生的频率通常存在差异，活性污泥、粪便和沉积物中接合转移的频率范围分别为10^–7–10^–2、10^–8–10^–3和10^–7–10^{–1[37–42]}(表 1)。接合转移的发生频率的影响因素不仅包括受/供体细胞、质粒类型，也包括温度、环境中重金属、离子液体等因素的影响^[42–45]。研究表明温度升高可以使接合转移的频率增加2个数量级以上^[42]。非营养甜味剂通过改变细胞膜的通透性可以提高iARGs结合转化的频率^[46]。离子液体[BMIm][PF6]通过强化参与接合转移和调控mRNA基因的表达并抑制细胞生长，促进外膜蛋白的合成并提高膜通透性，从而提高接合转移的频率^[43]。重金属铜通过诱导细胞损伤使接合转移的频率提高16倍，而重金属铜通过诱导胞外多聚物(EPS)的分泌阻碍接合转移的发生^[47]。

转导是iARGs进行转移的另一种方式，是由噬菌体介导的胞内基因由感染细胞向受体细胞转移的过程。噬菌体侵入细胞后，细胞内的染色体DNA和质粒DNA被噬菌体利用，并通过同源重组成为噬菌体子代的一部分。当DNA中含有抗性基因片段时，抗性基因便会通过噬菌体的转导作用下不断复制、积累。研究表明，噬菌体是环境中重要的抗性基因储库^[48]。在海洋、猪粪、土壤、污泥等环境中β-内酰胺类、磺胺类、四环素和多重耐药基因存在于噬菌体中，因此环境中的噬菌体可能在对抗性基因的转移起重要的作用^[49–52]。转导发生的频率通常不及接合转移，例如在临床环境中转导发生的频率为9×10^–7–1.5×10^–5，在海洋中为5.1×10^–9– 1.57×10^–8，在淡水中为2×10^–9–(6±0.5)×10^{–7[53–55]} (表 1)。值得注意的是由于噬菌体病毒快速重组和变异的特征，iARGs被病毒利用后会形成新的抗性基因序列，进而导致新型抗性基因的传播^[48]。

3.2.2 eARGs的传播方式

转化是eARGs进行转移的主要途径，转化的发生要求环境中存在胞外DNA且受体细胞处于感受态^[60]。研究已证实eARGs广泛存在于环境中(3.1中进行了描述)，具有通过转化进行基因转移的潜在风险。此外，一些极端的环境条件(比如营养物质的缺乏、抗生素的胁迫)以及对基因修复的需求会诱导细菌处于感受态^{[8, 61]}。由于自然界中80%以上的细菌是潜在的感受态细菌，因此随着抗生素污染的加剧，抗性基因通过转化进行水平转移的可能性可能会提高^[62]

自然界转化发生的频率略低于接合转移，例如在土壤样品中转化发生的频率为2×10^–5– 9×10^–4，在动物粪便中发生的频率为2×10^–7– 10^{–3[57–59]}(表 1)。但是许多证据表明环境中eARGs的传播具有很高的生态风险。Naquin等将含有mecA (甲氧西林抗性基因)的污水样品过滤得到eARGs，并将甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)暴露于污水样品，发现随后S. aureus对甲氧西林产生了抗性，这为敏感菌株通过转化获得耐药性提供了直接证据^[63]。Li等采用反向重水标记的拉曼光谱技术在培养体系中对耐药菌进行追踪，发现土壤中的eARGs可以通过转化迁移到人类致病菌中^[64]。此外，许多新型污染物会促进抗性基因转化发生的频率。广泛应用于日用品的非抗生素抗菌剂三氯生，在环境检测的浓度水平下会诱导ROS产生从而增加膜的渗透性，使eARGs向大肠杆菌(Escherichia coli)转化的频率增加1.5倍^[65]。纳米材料通过破坏细胞膜使eARGs转化频率提高2个数量级^[66]。氯消毒及消毒副产物在造成细胞DNA损伤后，刺激具有DNA损伤修复和外源基因整合功能的recA基因表达，促进了eARGs的转移^[67–68]。

综上所述，iARGs和eARGs通过不同的生物过程在环境介质与微生物间传播，其中iARGs接合频率＞eARGs转化频率＞iARGs转导频率。除此之外，污染物在环境介质中的汇聚为ARGs的传播提供了有利条件，可能会进一步提高ARGs在环境中的传播能力。

4 展望

iARGs和eARGs有明显的环境分布特征，在传播途径上存在明显的差异。在养殖场、污水厂等抗生素污染热点区域，细菌耐药性的传播及潜在健康风险很大程度上取决于主导的ARGs形式。但是，现有环境样品iARGs和eARGs分类表征方法的局限性，如区分eARGs赋存形态能力的不足，限制了ARGs的系统研究。此外，目前对iARGs和eARGs由污染场所向环境介质的转移仍然缺乏有效的阻控手段。同时，由于缺乏对ARGs的分类研究，无法实现与抗生素抗性有关的环境溯源。

本文在综述了现有iARGs和eARGs分离检测方法、环境分布和传播能力的基础上，对未来iARGs和eARGs的研究提出几点建议：(1) 根据iARGs和eARGs赋存形态，针对性建立分离检测标准方法，追踪环境中iARGs和eARGs的变化情况，例如采用密度梯度离心对不同赋存形态的eARGs进行区分；(2) 依据iARGs和eARGs分布与传播特征采取针对性阻控措施，例如改进污水处理厂污水处理工艺以应对污水处理过程中ARGs形态变化引起的传播能力变化；(3)基于不同环境中占主导的ARGs形式，分析iARGs和eARGs的人群暴露水平及其向临床病原菌转移的能力，系统评估环境中ARGs的潜在健康风险。