苏云金芽胞杆菌是世界上广泛应用的生物杀虫剂，其体内一系列的Cry蛋白、几丁质酶和植物杀虫蛋白等参与其防御害虫的功能。1976年Regev等首先鉴定了苏云金芽孢杆菌来源的几丁质酶是一种能够水解几丁质的分泌型蛋白^[1]，随后的研究还发现在苏云金芽孢杆菌体内过表达几丁质酶能增加菌株的抗虫活性，因此苏云金芽孢杆菌来源的几丁质酶吸引了越来越多研究者的目光^[2–3]。从功能上看，几丁质酶能够通过水解害虫的外壳及围食膜来增加苏云金芽孢杆菌的活力，但是具体的机制并不清楚，关于提高苏云金芽孢杆菌来源几丁质酶活力的研究尚属于空白。

几丁质酶是一种能够专一性地催化GlcNAc-GlcNAc或GlcNAc-GlcNc (GlcNc，脱乙酰基的几丁质单糖) 糖苷键断裂，从而使几丁质降解成为几丁寡糖或者单糖的一类酶的总称^[4]。根据作用方式的不同，几丁质酶通常分为内切型几丁质酶和外切型几丁质酶。内切型的几丁质酶从几丁质多糖链的内部随机水解几丁寡糖((GlcNAc)_n，n≥2)，在水解的初期水解产物以几丁寡糖(GlcNAc)₄、(GlcNAc)₃和(GlcNAc)₂为主，随着时间的增加，最终产物为(GlcNAc)₂和GlcNAc。外切型的几丁质酶主要是从几丁质酶的还原端或者非还原端以二糖为单位水解几丁质，生成终产物(GlcNAc)₂，部分外切型的几丁质酶同时具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性，能够水解(GlcNAc)₂生成GlcNAc^[5–6]。

根据氨基酸序列不同，几丁质酶分为糖苷水解酶18、19家族。18家族几丁质酶几乎分布在所有的物种中，即使在体内没有几丁质组分的植物及哺乳动物中同样存在，不同来源的18家族几丁质酶结构域的组成不同，通常包括催化结构域(catalytic domain)和几个辅助结构域，例如几丁质的结合结构域(chitin binding domain，CBD)和纤粘蛋白Ⅲ型结构域(fibronectin type-Ⅲ domain，FnⅢ)，部分真菌和植物来源的几丁质酶含有多个CBD或者不含CBD结构域^[7]。18家族几丁质酶催化结构域中有一个8股(β/α)折叠，8个β链(β1-β8)被8个α螺旋(α1-α8)所环绕，催化结构域通常含有DXXDXDXE或DXDXE保守结构域。19家族几丁质酶分布在高等植物、线虫和少数细菌如链霉菌、假单胞菌等。19家族的几丁质酶的催化结构域中α螺旋的含量高，与壳聚糖酶和溶菌酶有一些结构上的相似性，活性中心存在2个或3个保守的谷氨酸残基，与18家族的几丁质酶保守结构域类似^[8]。几丁质酶的水解机制主要分为3步，第一步：底物与活性口袋关键的氨基酸结合，以活性中心DXDXE为例，当底物与酶没有结合时，第一个天冬氨酸与第二个天冬氨酸靠近，远离质子供体谷氨酸；当底物与酶结合后，第一个天冬氨酸的侧链转向谷氨酸；第二步：底物中间体的形成和糖苷键的断裂，谷氨酸作为质子供体，一个天冬氨酸作为亲核试剂使底物质子化，通过一步法的酸/碱水解完成糖苷键的断裂；第三步：产物的释放和水分子的激活，当底物的糖苷键断裂后，活性中心的水分子被激活，引发亲核攻击完成反应，释放生成的产物。

本研究的对象苏云金芽孢杆菌来源的ChiA74属于18家族几丁质酶，由催化结构域、纤连蛋白Ⅲ结构域和几丁质结合结构域组成(图 1)。催化结构域含有几丁质酶保守的氨基酸活性位点；CBD结构域与底物几丁质的结合相关；FnⅢ结构域在真核和原核生物体内广泛分布，但是具体的作用尚不清楚。在过去的研究中，BtChiA蛋白能够在大肠杆菌内异源表达获得可溶性良好的蛋白，并且解析了晶体结构^[9]。

蛋白往往由多个不同的结构域所组成，不同结构域独立折叠并维持相对稳定，发挥各自的功能^[10]。2006年科学家提出了蛋白可以分为2个大的功能模块，发挥催化功能的活性中心以及维持催化中心活性的支架蛋白的新概念^[11]。在此概念的基础上，蛋白质结构域工程通过结构域的增加、交换或者缺失来改变支架蛋白的结构，并保证活性中心的稳定，筛选具有优良性状的功能蛋白。为了提高BtChiA的催化活力，本研究基于蛋白质结构域工程的理念设计了截短CBD和FnⅢ结构域的突变体蛋白BtChi△50 (BtChiA含有644个氨基酸，BtChi△50截短了453–644位的氨基酸序列), 并在大肠杆菌BL21(DE3)宿主内异源表达及纯化得到BtChiA和BtChi△50，分析2个蛋白水解胶体几丁质的活力、鉴定其产物类型及含量。

1 材料与方法 1.1 材料

本实验室所用的菌株为苏云金芽孢杆菌BMB171，由湖北大学陈守文老师馈赠。大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性内切酶、T5核酸外切酶、蛋白Marker购自于上海雅酶生物科技有限公司。PCR产物纯化和胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Bradford蛋白浓度试剂盒购自与Omega Bio-Tek公司。Ni-NTA蛋白纯化树脂购自GE公司。几丁质粉末、单糖GlcNAc、二糖(GlcNAc)₂购自于Sigma公司。乙腈购自于弗顿生化科技有限公司。

1.2 表达载体构建

以苏云金芽孢杆菌BMB171基因组DNA作为模板，利用PrimeSTAR DNA聚合酶PCR扩增BtChiA、BtChiA△50基因，PCR引物及酶切位点信息见表 1。PCR扩增条件为95℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，28个循环；72 ℃ 10 min。用EcoR Ⅰ处理pET28a使其线性化，作为重组表达的载体。将T5核酸外切酶试剂盒分别连接BtChiA、BtChiA△50与线性化的载体pET28a，取5 µL连接产物转化大肠杆菌DH5α，接种至卡那霉素抗性LB固体平板上筛选阳性转化子，菌落PCR及EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定阳性克隆，将初步验证正确的质粒送到生工工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的重组表达质粒命名为pET28a-BtChiA和pET28a-BtChiA△50。

1.3 重组蛋白的诱导表达和纯化

将构建好的表达载体pET28a-BtChiA和pET28a-BtChiA△50分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆于LB液体培养基(50 µg/mL的卡那霉素)中，并将菌体扩大培养至200 mL。在OD₆₀₀大约0.6左右加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)，置于18 ℃继续培养12 h，诱导重组蛋白表达。培养物在6 000 r/min离心10 min收集菌体，将菌体沉淀悬浮于30 mL裂解缓冲液(10 mmol/L PBS，pH 8.0)中，置于冰上利用超声破碎法裂解菌体(600 W超声4 s，间歇4 s，超声10 min)。将超声破菌后的细胞液在4 ℃、10 000 r/min离心30 min，收集上清液。利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，将上清液与2 mL Ni-NTA柱结合，然后分别用5个柱体积含有20、50 mmol/L咪唑的PBS除去非特异性结合的杂蛋白，然后用4个柱体积含有300 mmol/L咪唑的PBS将目的蛋白洗脱出来。通过SDS-PAGE检测纯度后，利用10 kDa的超滤管离心交换缓冲液除掉蛋白中的咪唑，最终将蛋白分装后保存在–80 ℃，用Bio-Rad快速蛋白测定Bradford法测定蛋白浓度。

1.4 胶体几丁质的制备

参照文献进行胶体几丁质的制备^[12]。(1) 称取3–4 g几丁质粉末，缓慢加入到60 mL浓盐酸中(边加边搅拌)，在4 ℃条件下剧烈搅拌过夜至溶液呈黄色；(2) 将上述混合物加入到1 L冰冷的95%乙醇中，快速搅拌后于4 ℃放置过夜；(3) 4 ℃、3 800 r/min离心15 min，收集沉淀部分；(4) 用大量水反复冲洗沉淀至pH接近5.5，冲洗完成后加入少量水(50 mL以内)溶解几丁质沉淀，转移至离心管中，然后10 000 r/min离心，收集沉淀部分即为胶体几丁质。称取5 g制备好的胶体几丁质溶解在100 mL pH 8.0的磷酸缓冲液中即为5%胶体几丁质。

1.5 重组几丁质酶的比酶活测定

GlcNAc标准曲线的制作：准确称取0.1 g GlcNAc固体粉末溶解于100 mL纯水中获得1 mg/mL的GlcNAc母液，然后用pH值为8.0的PBS缓冲液将母液稀释为0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GlcNAc；分别取500 µL上述浓度的GlcNAc中加入500 µL DNS溶液，100 ℃反应10 min，反应完毕后冰上冷却，12 000 r/min离心5 min；取上清液在分光光度计上测定540 nm处的吸光值；实验结果重复3次，根据数据绘制标准曲线(图 2)。

比酶活的测定：将50 µL纯化后的BtChiA、BtChiA△50分别与500 µL 5%胶体几丁质混合，37 ℃反应10 min，然后加入500 μL DNS试剂，100 ℃金属浴10 min，迅速放置于冰上冷却，测定OD₅₄₀，设置3个重复，取平均值，根据N-乙酰-氨基葡萄糖标准曲线计算酶的比活力。在37 ℃、pH 8.0的条件下，定义一个酶活力单位U为每分钟水解胶体几丁质释放1 μmol还原糖所需的酶量。

1.6 BtChiA和BtChiA△50水解胶体几丁质产物的分析

将100 µL BtChiA、BtChiA△50分别与5% 胶体几丁质混合，反应体系为1 mL，控制蛋白反应浓度为15 mmol/L，37 ℃摇床反应，对照组不加酶，于30 min、1 h、2 h、6 h时分别取样100 μL，100 ℃加热终止反应。将反应后的样品利用SHIMADZU高效液相色谱进行分析，80%乙腈和20%水相在0–30 min等梯度洗脱，流速0.5 mL/min，色谱柱Agilent Carbohydrate column (5 µmol/L，4.6 mm×250 mm)。

1.7 BtChiA和BtChiA△50水解(GlcNAc)₂产物的分析

用10 mmol/L pH 8.0的磷酸缓冲液配制0.5 mg/mL的(GlcNAc)₂，用终浓度15 mmol/L的BtChiA和BtChiA△50分别在37 ℃反应过夜(约12 h)，100 ℃金属浴加热终止反应。按照1.6方法HPLC分析产物组分。

1.8 BtChiA和BtChiA△50几丁质结合能力的测试

称取几丁质粉末0.15 g，在两管几丁质粉末中分别加入300 μL 0.5 mg/mL的BtChiA和BtChiAΔ50蛋白使最终的几丁质浓度为5% (W/V)，混匀，于4 ℃静置1 h，期间轻柔振荡数次；反应完成后，离心取上清及洗涤数次后的结合在几丁质粉末上的蛋白和对照(浓度为0.5 mg/mL的BtchiA和BtchiA△50)进行SDS-PAGE检测，并测定离心后上清的蛋白浓度，与初始蛋白浓度的比值定义为蛋白对几丁质的结合能力。

2 结果与分析 2.1 几丁质酶BtChiA和BtChiA△50的表达纯化

将含有表达质粒pET28a-BtChiA和pET28a- BtChiA△50的E. coli BL21(DE3)在18 ℃诱导过夜，重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE检测纯化结果(图 3)。可以看出BtChiA和BtChiA△50均能在大肠杆菌中可溶性表达，经过亲和纯化的蛋白纯度高达90%以上。BtChiA和BtChiA△50分子量大小预测分别接近74 kDa和50 kDa，从SDS-PAGE胶上可以看出，表达的蛋白分子量大小正确。2个蛋白在纯化后期除盐、浓缩的过程中均能以可溶性的状态稳定存在。

2.2 BtChiA和BtChiA△50比酶活的测定

纯化后BtChiA和BtChiA△50的蛋白浓度分别为2.13 mg/mL与1.82 mg/mL，计算得出比酶活分别为19 U/mg与31 U/mg，截短CBD和FnⅢ后的BtChiA△50的比酶活较BtChiA提高了1.6倍。

2.3 BtChiA和BtChiA△50水解胶体几丁质的产物分析

按照1.6所示的方法用100 µL BtChiA和BtChiA△50分别水解5%胶体几丁质，从30 min起始有(GlcNAC)₂和GlcNAc生成，在2 h到6 h期间，BtChiA水解体系中(GlcNAC)₂含量降低，GlcNAc含量增加，到6 h左右反应基本上终止。对比BtChiA和BtChiA△50水解5%胶体几丁质的产物，经过6 h，BtChiA水解胶体几丁质得到49.3%的(GlcNA_C)₂和50.7%的GlcNAc，BtChiA△50水解胶体几丁质得到64.2%的(GlcNAc)₂和35.8%的GlcNAc，将BtChiA截短CBD和FnⅢ结构域后，水解产物中(GlcNAc)₂的比例增加，而GlcNAc的比例降低(图 4)。结合2019年José E. Barboza-Corona等报道的几丁质酶的晶体结构以及本研究对水解产物的分析，预测BtChiA从胶体几丁质的还原端朝着非还原端以二糖为单位生成(GlcNAc)₂，是一种进程性的外切型几丁质酶^[9]。部分(GlcNAc)₂在BtChiA作用下生成单糖，尽管BtChiA△50比酶活高于BtChiA，但是水解(GlcNAc)₂的活性降低，因此生成(GlcNAc)₂含量增加，但GlcNAc含量降低。

2.4 BtChiA与BtChiA△50几丁质的结合能力测试

按照1.8所示的方法将BtChiA和BtChiA△50分别与5%几丁质粉末结合(图 5)，SDS-PAGE胶显示BtChiA和BtChiA△50均能与几丁质粉末结合，但是并不能完全结合，泳道2和5均含有未结合的上清液，泳道3和泳道6的对比说明结合在BtChiA△50上的几丁质比BtChiA少。经过定量分析，BtChiA反应液浓度为0.500 mg/mL，与几丁质粉末结合后的上清为0.119 mg/mL，BtChiA与几丁质粉末的结合率为76.2%；BtChiA△50反应液浓度为0.500 mg/mL，与几丁质粉末结合后的上清为0.348 mg/mL，BtChiA△50与几丁质粉末的结合率为30.4%，截短CBD和FnⅢ结构域后BtChiA△50比BtChiA对几丁质的结合性下降了2.5倍。CBD结构域跟几丁质的结合有关，FnⅢ结构域的功能尚不清楚，但也有研究表明FnⅢ与几丁质以及其他一些生物多聚物分子的结合有关。当BtChiA截短CBD和FnⅢ结构域后，尽管蛋白能够稳定存在，但是结合几丁质的能力明显下降。目前已经报道的几丁质酶截短C端结构域后大多数仍然能够与几丁质有结合，这说明催化结构域也有结合几丁质的能力，多结构域共同存在对几丁质的结合性更强。

3 讨论

蛋白质结构域工程是对目标蛋白性质进行多方面优化的重要手段^[10]。几丁质酶主要由N端和C端结构域组成，其中N端为活性中心所在的催化结构域，C端包括FnⅢ结构域和CBD结构域。每个结构域通常能独立折叠及稳定存在，结构域工程通过对蛋白自身的结构域进行删除、叠加及不同蛋白之间的结构域互换来优化蛋白的性质^[11]。本研究构建了BtChiA和突变体BtChiA△50蛋白的大肠杆菌重组表达菌株，实验结果显示，BtChiA和BtChiA△50蛋白在BL21(DE3)中能够可溶性表达，蛋白在纯化的过程中很稳定。2007年Driss等在表达了苏云金芽孢杆菌库斯塔变种(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)来源的几丁质酶Chi255及截短CBD的Chi255△5，Chi255和ChiA74的氨基酸序列有97%的相似性，与本研究相同的是在纯化过程中Chi255与Chi255△5状态稳定，不同的是，研究者用含有胶体几丁质的平板检测截短蛋白的活性，发现Chi255和Chi255△5有水解胶体几丁质的活性，部分截短或者全部截短FnⅢ结构域的蛋白没有水解胶体几丁质的活性^[13]；2016年Sha等在大肠杆菌表达了苏云金芽孢杆菌HZP7来源的几丁质酶Chi74、截短CBD的Chi63及截短CBD和FnⅢ的Chi54，3个蛋白均很稳定，作者利用DNS法对Chi74及突变体蛋白的活性进行检测，Chi74、Chi63和Chi54的活性依次下降，但是最适温度及pH值没有发生变化。通过对比分析苏云金芽孢杆菌不同亚种来源的几丁质酶，发现CBD和FnⅢ结构域为苏云金芽孢杆菌来源几丁质酶的重要组成部分，但并非维持活性及稳定性的必须结构，这说明BtChiA是进行蛋白质结构域工程改造的良好实验材料^[14]。

几丁质酶水解几丁质能够获得大量几丁寡糖，在医药保健、农业领域有广泛的应用，因此，利用蛋白质结构域工程对几丁质酶的改造已经有了广泛的报道。在结构域的增加方面，2004年Limón等发现哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)来源的几丁质酶Chit42和Chit33具有抑制部分真菌的活性，但是缺少CBD。他们将哈茨木霉菌来源的CBD分别融合在Chit42和Chit33的N端构建了杂合的Chit42-CBD和Chit33-CBD，Chit42-CBD水解几丁质的活力相比较Chit42提高了3倍，Chit33-CBD水解几丁质的活力相比Chit33提高了2倍，并且Chit42-CBD和Chit33-CBD抑制真菌的活性提高了，说明CBD有效地提高了几丁质酶对不溶性几丁质的结合性包括真菌的细胞壁组分^[15]。2019年谷天燕等在将苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalae)来源的几丁质酶ChiB的N端融合上自身来源的CBD，构建好N端和C端均含有CBD的DChDB_chiB融合蛋白，融合蛋白增强了几丁质酶对几丁质、胶体几丁质和黑曲霉几丁质的结合能力，同时增强了对植物病原真菌长枝木霉的抑制作用^[16]。在结构域的交换方面，2021年Su等将白长链霉菌(Streptomyces albolongus)来源的几丁质酶的SaChiA4的CBD替换成了环太芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的几丁质酶ChiA1的CBD，融合蛋白R-SaChiA4相比较SaChiA4水解几丁质粉末的活性提高了54% (28 U/mg)，水解胶体几丁质的活力提高了49%^[17]。在结构域缺失方面，2015年Lin等在粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的几丁质酶smChiC基础上截短CBD获得SmChiCG426蛋白，截短CBD和FnⅡ获得SmChiCG330蛋白，SmChiACG426和SmChiCG330水解胶体几丁质的催化效率(K_cat/K_m)是SmChiA的1.06倍和2.09倍^[18]。2015年Chen等在大肠杆菌中表达了铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的几丁质酶Pachi和截短CBD的CHA突变体蛋白，相比较野生型的Pachi蛋白，CHA对底物胶体几丁质亲和力下降了1.85倍，但是催化活性提高了1.26倍^[19]。以上文献提到的几丁质酶活性数值见表 2。

本研究首次定量分析了苏云金芽孢杆菌BMB171来源的几丁质酶BtChiA74及突变体蛋白BtChiA△50水解胶体几丁质的活力及水解产物，通过DNS法分析截短了CBD和FnⅢ结构域的BtChiA△50水解5%的胶体几丁质的比酶活比BtChiA74提高了1.6倍，BtChiA△50对底物的结合性比BtChiA74下降了2.5倍，以上结果说明，CBD并非维持BtChiA活性必需的结构域，但是对于提高几丁质酶与底物结合能力非常重要。CBD的功能是提高几丁质酶对于不溶性底物的结合性，CBD和FnⅢ形成β折叠会造成酶的不稳定并且在结构上阻碍产物的释放，但是关于CBD和FnⅢ对于几丁质酶催化活性的影响目前并不清楚^[20–21]。BtChiA水解胶体几丁质生成的GlcNAc的含量是(GlcNAc)₂的1.02倍，BtChiA△50水解胶体几丁质生成的(GlcNAc)₂含量是GlcNAc的1.79倍，突变体BtChiA△50水解胶体几丁质生成的(GlcNAc)₂含量提高，而GlcNAc的含量降低。2020年Song等在毕赤酵母中表达了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源的几丁质酶ChiA，ChiA充分水解30%的胶体几丁质产物是GlcNAc和(GlcNAc)₂，主要产物是GlcNAc；并且ChiA以(GlcNAc)₂作为底物，水解生成GlcNAc^[22]。ChiA和BtChiA蛋白序列的同源性高达67%，暗示着BtChiA也可能具有水解(GlcNAc)₂的活力，相关的实验正在进一步的探索中。本研究是首次通过定性及定量研究几丁质酶及其截短蛋白水解胶体几丁质的产物组成及含量变化，可供对比分析的例子较少，BtChiA水解(GlcNAc)₂的活性还需要进一步的验证。

本研究基于蛋白质结构域工程的思路，获得了比酶活提高的突变体蛋白BtChiA△50，利用HPLC方法对BtChiA水解胶体几丁质的产物进行了定性和定量的分析，发现截短CBD后BtChiA△50水解胶体几丁质生成的(GlcNAc)₂含量明显提高。因此，删除BtChiA的C端CBD结构域能够为获得高活性的几丁质酶、优化产物结构提供一种新策略，本研究也为深入研究几丁质酶水解产物种类及含量的差异机制提供了基础。