RNA干扰是真核生物中高度保守的基因表达调控机制，其利用长度为20–30 nt的非编码小RNA (small non-coding RNAs，sRNAs)沉默靶基因表达。1998年，美国斯坦福大学的Fire和马萨诸塞大学的Mello等科学家在Nature上共同发表论文，首次提出RNA干扰的概念^[1]。Fire和Mello等发现线虫中外源双链RNA能够沉默基因表达，因此RNA干扰最初被定义为外源长双链RNA介导的靶标RNA降解过程。随着研究的不断深入，目前广义的RNA干扰是指由长度为20–30 nt、具有调节功能的非编码小RNA参与的抑制靶基因表达的现象。根据起源、结构、效应蛋白及生物学作用的不同，这些非编码小RNA主要分为3类：小干扰RNAs (short interfering RNAs，siRNAs)、微小RNAs (microRNAs，miRNAs)和piwi相互作用RNAs (piwi-interacting RNAs，piRNAs)。在不同的RNA干扰通路中，sRNAs调控了诸多的细胞生命活动，例如细胞发育、RNA加工和稳定性、宿主防御、染色体分离等。值得注意的是，关于RNAi生物学功能的报道主要集中在人类、小鼠和果蝇等动物细胞中，而首次发现RNAi相关的现象却是在植物和真菌中^[2–3]。

真菌中RNAi机制广泛存在，大多数真菌的sRNAs都为siRNAs。在真菌中，由多种途径产生的双链RNA (dsRNA)被具有RNase Ⅲ结构域的核酸内切酶剪切加工成20–30 nt的sRNAs，这些sRNAs可以作为基因沉默的触发器，与一系列特异性蛋白质结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced interference complex，RISC)。在转录水平上，RISC复合物招募组蛋白甲基转移酶，介导异染色质形成；在转录后水平，RISC复合物通过sRNAs碱基互补配对的方式识别并剪切靶标RNA，从而使靶标RNA降解，翻译受到抑制，最终导致特定基因的沉默。RNAi途径的经典作用蛋白，Dicer、Argonaute以及RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)在真菌中具有显著的保守性。早期研究主要揭示了真菌RNAi在基因组防御中的作用。真菌RNAi能够通过抑制转座子跳跃、病毒入侵以及外源基因转入来维持基因组的完整性。近些年来的研究结果发现，和动物细胞中的RNAi途径类似，真菌RNAi也具有广泛的生物学功能，包括调节真菌生长发育、促进着丝粒进化、调节真菌耐药性和毒力等。RNAi在不同的真菌中扮演了不同的角色。本文将针对真菌中RNA干扰的生物学功能作一综述，为真菌RNA干扰机制的研究者提供参考。

1 控制转座子活性

转座子(transposable element，TE)是一类可以在染色体上或不同染色体间自由移动的DNA，在真菌基因组中广泛存在，其移动可导致插入位点突变、临近基因表达失活、DNA双链断裂等，从而影响基因组的稳定性。为了维持基因组的完整性，许多真菌进化出了抑制转座子活性的机制，比如重复序列诱导的点突变(repeat induced point mutation，RIP)和RNA干扰机制。

粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)是真菌中研究RNA干扰的模式菌株，在其营养生长阶段，由重复的转基因序列引发的转录后基因沉默现象被称作quelling，首次报道于1992年^[3]。quelling对于抑制转座子复制是必不可少的。Nolan等发现粗糙脉孢霉quelling途径中的关键蛋白QDE2 (Argonaute蛋白)和Dicer能够抑制类似LINE1的反转录转座子跃迁^[4]，但此过程不需要RNA依赖的RNA聚合酶QDE1和RecQ DNA解旋酶QDE3的参与。另外，在粗糙脉孢霉有性生殖阶段，未配对DNA引发的减数分裂沉默(meiotic silencing by unpaired DNA，MSUD)也能够显著抑制转座子活性。MSUD发生在减数分裂前期，当由于基因缺失、复制和转座等原因引起同源基因未配对时便会引发MSUD，导致未配对DNA发生基因沉默。参与MSUD的主要蛋白元件定位于细胞核周围，其中sad-1是qde-1的同源基因，负责编码RdRP。SAD-1将未配对DNA产生的异常RNA (aRNA)合成为双链RNA，之后dsRNA被加工成与MSUD相关的siRNAs (masiRNAs)^[5–6]。2015年，Wang等鉴定出起源于未配对转座子的masiRNAs，且该类masiRNAs的产生依赖于SAD-1^[7]，从而揭示了MSUD在减数分裂过程中抑制转座子活性进而维持基因组稳定的作用。

人类条件致病真菌新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)使用不同的RNAi途径来抑制转座子活性，其中有性生殖阶段由siRNAs介导的转录后基因沉默现象被称作有性生殖诱导的沉默(sex-induced silencing，SIS)。在有性生殖过程中，Rdp1、Ago1及Dcr1蛋白表达量显著提高，生成大量转座子起源的siRNAs。但当Rdp1蛋白缺失，转座子起源的siRNAs表达量降低，转座子被激活，子代突变率增加^[8]，说明隐球菌在有性生殖过程中使用SIS RNAi途径来抑制转座子活性，达到维持子代基因组完整性的目的，该过程既可以发生在同性交配(α-α)也可以发生在异性交配(a-α)过程中。因此，MSUD和SIS分别是不同真菌在有性生殖阶段抑制转座子表达的重要防御机制。和粗糙脉孢霉相似的是，新生隐球菌营养生长阶段也存在类似quelling的基因沉默现象，称作有丝分裂诱导的沉默(mitotic-induced silencing，MIS)^[9]。Jiang等和Dumesic等通过对新生隐球菌sRNAs进行高通量测序，发现其在营养生长阶段也能够产生转座子起源的siRNAs^[10–11]。Janbon等发现Rdp1缺失导致营养生长阶段转座子相关的基因表达量显著提高，转座子跃迁能力增强^[12]。2013年，Dumesic等的工作揭示了隐球菌营养生长过程中转座子起源的siRNAs的形成机制，即含有次优内含子的转座子基因产生的pre-mRNA容易在剪接体上滞留，从而成为剪接体偶联的蛋白复合体(spliceosome-coupled and nuclear RNAi，SCANR)蛋白复合体的底物，之后在套索分支酶Dbr1的作用下合成dsRNA，dsRNA进入经典的RNAi途径，产生转座子起源的siRNAs^[11]。这些结果说明，在有丝分裂过程中，新生隐球菌能够利用RNAi途径抑制转座子活性。最新研究结果中鉴定了5个参与隐球菌RNAi途径的新蛋白(Rde1–5)，进一步对上述结论进行了证实^[13]。

在其他真菌中，也发现了RNAi途径抑制转座子活性的证据。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一种农业病原微生物，在水稻不同生育期均能引起病害。2001年，Nakayashiki等发现外源转入的MAGGY反转座子在M. oryzae细胞中受到抑制，但该抑制现象与DNA甲基化无关^[14]。Nakayashiki等推测M. oryzae中存在能够抑制MAGGY表达的RNAi机制。后续研究证实，M. oryzae菌丝中确实能够产生大量靶向LTR反转座子的siRNAs (LTR-siRNAs)，其中便包括起源于MAGGY的LTR-siRNAs，说明M. oryzae RNAi的生物学功能之一便是调控转座子活性^[15–16]。2013年，Yamanaka等在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中报道了起源于Tf2反转座子的siRNAs，该类siRNAs的产生受到经典RNAi蛋白的调控，Ago1和Dcr1功能缺失均会导致Tf2表达活性增强，相应地，Tf2起源的siRNAs消失^[17]。芽殖酵母(Saccharomyces castellii)、小麦锈菌(Puccinia graminis f. sp. triticci)中也报道了转座子起源的非编码sRNAs^[18–19]。

近期研究表明，毛霉菌中存在非经典的RNAi途径来维持基因组的完整性。前期研究对卷枝毛霉(Mucor circinelloides)转座子起源的内源小RNA (endogenous short RNAs，esRNAs)进行了报道^[20]，发现这部分esRNAs的表达受到经典RNAi途径调控，其中便包括起源于着丝粒附近区域Grem-LINE1反转座子的siRNAs^[21]。2015年，Trieu等发现卷枝毛霉中存在非经典RNAi途径(non-canonical RNAi pathway，NCRIP)^[22]。NCRIP途径依赖于RdRP和R3B2新型核糖核酸酶Ⅲ类似物。最新研究发现，NCRIP在调节毒力和转座子迁移方面发挥重要作用。在没有NCRIP的情况下，经典的RNAi机制会产生更多的esRNAs来抑制Grem-LINE1反转座子^[23]，说明NCRIP与RNAi经典途径的核心元件相互作用，通过控制着丝粒反转座子的表达来保护基因组的稳定性。NCRIP作为一种新的调控机制，目前所知较少，它在真菌生理学中的作用还有待进一步阐述。

2 参与病毒防御

RNA干扰对于细胞防御病毒入侵具有重要意义，是细胞对抗病毒复制的一种天然免疫机制，这一结论在多种生物体内都得到了证明，包括动物、植物以及真菌中^[24–25]。真菌的RNAi系统通过产生起源于病毒的干扰性小RNA (virus-derived small RNAs，vsRNAs)介导入侵病毒失活^[26]，该机制在丝状子囊菌板栗疫病菌(Cryphonectria paracitica)中研究得较为清楚。

板栗疫病菌是引起板栗疫病的病原真菌，可以被5种不同的病毒感染，因而是真菌中研究RNAi系统抵抗病毒入侵机制的模式菌株。真菌中RNAi参与病毒防御的现象首先发现于板栗疫病菌中。2007年，Segers等发现板栗疫病菌dcl-2基因突变和dcl-1/dcl-2基因双突变均会导致菌株对病毒感染的敏感性增强，且Δdcl-2突变株中病毒RNA的表达水平显著提高，首次证明了真菌RNAi蛋白能够调控病毒入侵过程^[27]。进一步研究发现，在dcl-2的作用下，真菌低毒病毒RNA能够被加工为vsRNAs^[28]。板栗疫病菌编码的4个Argonaute类似蛋白中只有AGL2参与抗病毒的防御反应^[29]。与dcl-2基因类似，病毒感染时agl2的转录水平也显著提高。低毒病毒编码的RNAi抑制蛋白p29缺失时，agl2和dcl2的转录本均有较高程度的积累^[29]，说明在病毒入侵真菌的过程中，p29能够抑制RNAi关键蛋白的表达，这为RNAi参与病毒防御提供了间接证据。

构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的研究进一步证明了真菌中RNAi途径对病毒的抑制作用，丰富了人们对真菌——病毒相互作用方式的认识。在构巢曲霉中，带有反向重复序列的外源转基因能够引发细胞内强烈的RNA干扰现象，但该过程不依赖RdRP^[30–31]。构巢曲霉基因组中分别含有2个能够编码Argonaute、Dicer以及RdRP蛋白的基因，但在RNAi过程中，参与靶标RNA沉默的只有一个Argonaute和一个Dicer蛋白^[32]，两个rdrp基因缺失均不会影响sRNAs的产生^[30]。通过构巢曲霉的病毒感染实验，Hammond等发现曲霉病毒1816能够抑制构巢曲霉细胞内反向重复序列引发的RNAi现象，说明1816病毒中存在RNAi抑制蛋白^[33]。此外，构巢曲霉病毒341入侵细胞时，细胞中能够检测到起源于341病毒的siRNAs，充分说明构巢曲霉RNA干扰系统能够以病毒序列作为靶基因，沉默病毒基因的表达^[33]。这些研究结果表明，与板栗疫病菌类似，构巢曲霉的RNA干扰系统也能够介导病毒防御机制，同时一些病毒能够通过表达RNAi抑制蛋白因子来应对宿主的RNA沉默系统，这是病毒与宿主之间相互作用、相互进化的结果。

随着高通量测序技术的发展，RNAi系统参与病毒防御的功能在更多真菌中得到揭示。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)与陆生植物形成共生体，是土壤微生物群落的重要组成部分。通过sRNAs高通量测序发现，菌根真菌珠状巨孢囊霉能够产生大量靶向病毒基因组的非编码sRNAs，这些sRNAs也可能参与调控共生植物的基因表达，在真菌与植物的互作中发挥作用^[34]。尽管尚未发现能够感染粗糙脉孢霉的病毒^[35]，粗糙脉孢霉细胞中引入dsRNA却能够激活抗病毒基因和干扰素相关基因的表达。

3 调节真菌生长与发育

早期研究中并未观察到真菌RNAi缺陷菌株的表型变化，而且酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)等真菌完全丢失了RNAi系统^[18]，这导致在相当长一段时间内，研究者们认为RNAi机制并不参与调控真菌的生长发育过程，然而，粗糙脉孢霉和卷枝毛霉中的研究推翻了这一结论。2010年，粗糙脉孢霉中发现了类似miRNAs的sRNAs (microRNA-like RNAs，milRNAs)^[36]。milRNAs以类似于动植物miRNAs的方式调节基因表达，但milRNAs缺陷菌株并没有表现出显著的营养生长缺陷，它们似乎不参与调控粗糙脉孢霉营养生长及发育过程^[37]。然而，在粗糙脉孢霉有性生殖阶段，未配对DNA引发的减数分裂沉默缺陷时，DCL-1缺陷菌株表现出纯合子杂交不育的表型，而Dicer蛋白对milRNAs的形成至关重要，揭示了milRNAs参与调控脉孢霉有性生殖过程^[38]。

卷枝毛霉(M. circinelloides)是一种人类条件致病接合菌，能够引发严重的毛霉菌病，其RNA沉默现象首次报道于2003年^[39]。卷枝毛霉基因组中编码2个Dicer蛋白(Dcl1–2)，3个Argonaute蛋白(Ago1–3)以及3个RdRP蛋白(RdRP1–3)^[40]，不同的RNAi蛋白相互组合，通过产生不同类型的esRNAs调节内源基因的表达，其中研究最为清楚的是起源于外显子的siRNAs (exonic siRNAs，ex-siRNAs)。根据产生途径不同，目前已确认的324个ex-siRNAs可以分为4类(图 1)^[38]。第一类ex-siRNAs的形成依赖于Dcl-2和RdRP-2；第二类依赖于Dcl-2和RdRP-1；第三类同时依赖于Dcl-1、Dcl-2、RdRP-1以及RdRP-2；第四类ex-siRNA的数量最少，其产生需要Dcl-1、RdRP-1、RdRP-2。另外，Ago-1同时参与4类ex-siRNAs的生成。Dcl-1缺失导致卷枝毛霉营养生长速率减慢、菌丝形态异常^[41]，Dcl-2缺失导致无性孢子产量显著降低^[42]，预示着卷枝毛霉RNAi系统参与调节营养生长过程。RNAi基因缺失带来的显著表型变化促使卷枝毛霉成为真菌中研究RNAi生物学功能的模式菌株。2015年，Nicolás等通过转录组分析发现，卷枝毛霉中约700个基因的表达受到RNAi途径调控^[43]，这些基因涉及信号转导、糖/脂代谢和能量产生等多种代谢途径。RNAi缺失菌株的表型分析结果与转录组测序结果一致，比如，ago-1^–、dcl-2^–以及rdrp-2^–突变株均表现出了产孢量降低、自溶作用加快的表型(图 2A)^[44]。

除了经典的依赖Dicer的RNAi途径之外，卷枝毛霉中还存在非经典的不依赖Dicer但依赖RdRP的esRNAs产生途径(即NCRIP)，这类esRNAs被称作rdRNAs (rdrp-dependent degraded RNAs) (图 2B)^[44]。rdRNAs绝大部分起源于基因的外显子区，与mRNA序列一致，实际上是mRNA特异的降解产物，其产生依赖于RdRP1、RdRP2以及R3B2新型核糖核酸酶Ⅲ类似物^[22]。RdRP突变导致rdRNAs表达量降低，而对应的mRNA表达量升高。真核同源蛋白簇(eukaryoticorthologous group，KOG)分析结果表明rdRNAs富集的区域集中于辅酶运输与代谢、细胞骨架、离子转运、次级代谢产物合成等相关基因^[22]，充分说明卷枝毛霉rdRNAs参与调控多种细胞生命活动进程。最新研究发现，卷枝毛霉基因组中3 187个基因(超过基因组的25%)受到NCRIP途径的调控。在非压力条件下，NCRIP途径抑制抗吞噬作用相关基因的表达，但在面临巨噬细胞吞噬时，NCRIP的抑制作用解除，抗吞噬基因表达量显著提高，进一步证明了卷枝毛霉的RNAi途径能够对环境信号做出应答^[23]。

此外，在子囊菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)中，起源于外显子的esRNAs也能够发挥调节功能。深绿木霉是一种常见于土壤和根系生态系统中的真菌，能够引起植物防御反应并刺激植物生长^[45]，其基因组中编码2个Dicer蛋白(dcr1–dcr2)，3个Argonaute蛋白(ago1–ago3)以及3个RdRP蛋白(rdr1–rdr3)。为了探究深绿木霉RNAi机制的生物学功能，Carreras-Villaseñor等在深绿木霉中构建了多种RNAi缺陷菌株^[46]，并对缺陷菌株的表型和转录组进行深入分析。在光信号和机械损伤刺激下，野生型深绿木霉会由营养生长转为无性生殖过程，产生大量分生孢子。但在Δdcr2、Δdcr1Δdcr2及Δrdr3突变株中，光信号引发的分生孢子产生量显著降低。Δdcr2、Δdcr1Δdcr2突变株菌丝生长速率降低，菌丝细胞结构发生改变。对WT、Δdcr1、Δdcr2和Δdcr1Δdcr2的转录组进行分析，发现Dicer蛋白控制着发育或代谢等不同的生物学过程，这可能是Dicer缺失菌株中产孢量降低的原因^[46]。此外，Dcr2缺失菌株中sRNAs表达量变化与转录组差异表达数据相一致，这些研究结果证明，除了防御侵入性核酸之外，RNAi途径及其产生的sRNAs通过调节基因表达在深绿木霉的生长和发育中发挥重要作用。

除了参与真菌的无性生殖过程，RNAi机制还参与了一些真菌的有性发育，比如前文提到的粗糙脉孢霉。近年来的研究也证实了RNAi机制对真菌有性发育的影响。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小粒谷物赤霉病的主要病原菌，该真菌通过有性孢子(子囊孢子)和无性孢子(分生孢子)繁殖。Son等发现禾谷镰刀菌FgDicer1和FgAgo2蛋白通过产生ex-siRNAs调控子囊孢子形成，而FgDicer2和FgAgo1主要参与发夹RNA诱导的RNAi途径^[47]。随后，Zeng等确认禾谷镰刀菌在有性生殖期间也能够产生milRNAs，FgDicer1和FgDicer2能够利用milRNAs调控有性发育^[48]。灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)是研究高等担子菌发育过程的模式菌株。研究者们在灰盖鬼伞中验证了22个新的milRNAs，靶基因预测发现灰盖鬼伞milRNAs能够调控子实体的发育过程^[49]。

4 介导异染色质组装

异染色质最初是用细胞学染色方法定义的，指的是在整个细胞周期中保持浓缩外观的染色体区域。在细胞分裂间期，常染色质呈伸展状态且被碱性染料着色较浅，异染色质处于凝聚状态且被碱性染料着色较深。裂殖酵母S. pombe的染色体含有大量重复的DNA序列，特别是在着丝粒上，这些重复的DNA序列常被包装成异染色质。

早在2002年，Volpe等发现当裂殖酵母的RdRP、Dicer及Argonaute等RNAi作用元件缺失后，异染色质区域恢复转录，细胞内异染色质mRNA水平提高，且组蛋白H3K9甲基化丢失，突变体在染色体分离中显示出缺陷，这通常与异染色质组装中的缺陷有关^[50]，这一研究结果提示RNAi机制影响着异染色质的组装。RNA介导异染色质形成的标志是RNAi的介入和H3K9的甲基化。简单来说，siRNAs和它们的Argonaute结合蛋白组装成RNA诱导的转录沉默复合体(RITS)，并在染色体互补区域指导染色质的遗传修饰和异染色质的形成。通过对RITS复合物进行鉴定，确定了siRNAs与异染色质装配体之间的联系^[51]。异染色质的形成需要DNA结合因子的帮助，该DNA结合因子在裂殖酵母中是otr (outermost)重复区域的重复序列。RITS复合物由Ago1、Chp1和Tas3蛋白组成，其中Chp1是包含染色质域的蛋白，能够募集RITS复合物结合到otr重复序列，激活的Ago1蛋白与siRNAs引导链相结合也增强了RITS对otr的结合能力。成熟的RITS复合物招募组蛋白甲基转移酶，甲基化H3K9，从而激活Swi6蛋白，染色质压缩形成异染色质^{[50, 52]}，从转录水平上抑制该区域基因的表达。除此之外，裂殖酵母细胞内还检测到了起源于着丝粒区域的非编码sRNAs，并且Rdp1在着丝粒处富集^[50]。这些研究结果皆说明，裂殖酵母异染色质的形成与RNAi途径密切相关，RNAi与异染色质组装的交集将基因调控的两个领域结合在一起。

5 促进着丝粒进化

着丝粒是一个特殊的DNA位点，它是组装多蛋白复合体(动粒)所必需的，由串联重复的卫星DNA和转座子序列组成，有助于真核生物中染色体的准确分离。着丝粒可以分为点着丝粒和区域着丝粒，其中点着丝粒通常是小于400 bp的短DNA序列(如酿酒酵母)，区域着丝粒的范围从几千个碱基(如庞氏裂殖酵母)到几百万个碱基(如人和植物)不等。不同物种中着丝粒的功能具有绝对的保守性，但着丝粒区域的DNA序列在不同物种中的长度和碱基组成上相差较大，呈现快速趋异进化的趋势。

前文提到，裂殖酵母异染色质的形成与RNAi途径密切相关，而着丝粒是异染色质形成的关键区域，那么RNAi机制对于着丝粒结构和功能的维持是必不可少的吗？研究表明，RNAi关键基因缺失会导致着丝粒区域的异染色质形成异常，H3K9甲基化消失，以及染色体错误分离^[53]，即裂殖酵母RNAi途径通过控制着丝粒区域转座子的表达来调节着丝粒功能。最新研究发现，除了裂殖酵母之外，在隐球菌和黑粉菌中也存在类似的机制。2018年，Yadav等对真菌界担子菌的着丝粒进化机制进行了研究^[54]。Yadav团队选择了3种隐球菌作为研究对象，其中新生隐球菌H99菌株和JEC21菌株含有完整的RNAi系统，格特隐球菌(Cryptococcus deuterogattii) R265菌株的RNAi系统丢失。利用保守的着丝粒蛋白CENP-A和CENP-C对隐球菌的着丝粒进行鉴定，发现新生隐球菌和格特隐球菌着丝粒的位置、组成元件等没有显著差异，但R265菌株中着丝粒的长度明显短于拥有RNAi系统的H99菌株和JEC21菌株，CHIP-seq结果显示R265菌株CENP-C蛋白所结合的序列也较短。此外，RNAi缺失的R265菌株在着丝粒区域丢失了全长的逆转录因子，只残留了部分转座子序列，而RNAi完整的H99菌株和JEC21菌株留有全长的逆转录因子，且着丝粒区域的胞嘧啶伴随着甲基化修饰。当H99菌株和JEC21菌株的RNAi途径缺失时，突变株在传代过程中也会偶尔出现着丝粒缩短的情况。进一步利用黑粉菌重复上述实验，得到了类似结果。着丝粒区域转座子的驯化会导致功能区域或重复序列的产生，从而促进着丝粒的进化^[55]。这一系列的研究结果表明，RNAi和胞嘧啶DNA甲基化的丢失导致转座子跃迁能力增强，着丝粒区域转座子缺失，从而导致了进化过程中着丝粒长度的缩短。RNAi系统通过抑制着丝粒区域转座子的活性，促进转座子驯化，进而导致着丝粒结构和功能的快速进化。

6 调节耐药性与毒力

卷枝毛霉(M. circinelloides)对临床上常用的抗真菌药物常表现出耐药性，这使得毛霉菌病难以治愈且死亡率较高，深入了解真菌耐药性机制对于改善治疗至关重要。2014年，Calo等发现RNAi能够以表观遗传突变的方式引发卷枝毛霉对抗真菌药物FK506和雷帕霉素产生耐药性^[56]。该团队发现RNAi导致的表观突变株中携带针对fkbA基因的反义小RNA，可以触发fkbA mRNA降解，从而阻止药物靶标FKBP12的产生。该过程需要多个经典的RNAi蛋白参加，包括Dcll、Dcl2、Ago1和RdRP2。Dcl2、Ago1或者RdRP2缺失均会导致fkbA沉默现象消失。有趣的是，NCRIP途径的关键蛋白R3B2和RdRP3缺失均会提高表观遗传突变速率，促进了抗性菌株的产生，即NCRIP途径负调控依赖RNAi的表观突变过程^[57]。这些发现揭示了卷枝毛霉中固有的RNAi途径能够以可逆的方式抑制药物靶标的表达，从而调控真菌抗药性(图 2A)。另外，研究者们对另一种抗真菌药物5-氟乳清酸(5-FOA)进行检测，同样筛选到了抗5-FOA的表观突变体。与FK506抗性突变株相似的是，5-FOA抗性突变株中相关sRNAs的产生也是暂时的，在没有药物存在的环境中，表观突变体在传代过程中会逐渐恢复对5-FOA的敏感性^[58]。这些研究结果进一步证实，表观突变是一种普遍现象，它可以影响卷枝毛霉中的多个遗传位点，并诱导对多种抗真菌药物的耐药性。

显然，致病真菌耐药性的产生能够增强毒力，促进其对宿主的感染，但RNAi对真菌毒力的影响不仅如此，还体现在其对致病真菌-宿主相互作用的调节方面。真菌的非编码sRNAs可以突破物种界限，跨界转运。转运到宿主细胞内的跨界sRNAs能够对靶标基因进行沉默，从而调节宿主的免疫反应，这种机制被称作跨界RNA干扰(cross-kingdom RNAi)。该机制在大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、灰霉菌(Botrytis cinerea)等致病真菌中均有发现。大豆疫霉菌产生2种靶向宿主RNAi系统的效应蛋白，PSR1和PSR2，其中PSR1能够抑制宿主miRNAs和siRNAs的合成，PSR2则特异性地打断siRNAs积累过程，从而减弱植物宿主的免疫应答反应，促进真菌自身感染^[59]。灰霉菌在感染过程中产生跨界sRNAs转运到宿主细胞内，这些跨界sRNAs与宿主Argonaute蛋白结合，劫持宿主的RNAi系统，沉默宿主免疫应答基因，比如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、氧化物酶、细胞壁相关的激酶等(图 2C)，从而增强自身毒力。研究发现，拟南芥灰霉菌(Arabidopsis thaliana B. cinerea) RNAi蛋白缺失会导致致病真菌毒力降低，但拟南芥Ago1蛋白缺失则会增强突变株对灰霉菌的抵抗力^[60]。此外，对于一些植物病原真菌，如胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)^[61]，RNAi蛋白缺失导致真菌刺穿叶片的能力显著降低，从而降低真菌致病性。

7 总结和展望

地球上真菌种类约150万种，是自然界第二大生物类群，这预示着真菌中的代谢通路和基因表达调控机制都较为复杂，比如有些真菌在进化过程中丢失了RNAi系统，而保留RNAi系统的真菌在典型的RNAi途径之外，还出现了非典型RNAi途径。自然界中的真菌会面临各种环境压力，有效的能量代谢对其至关重要，RNAi机制对真菌的作用是什么呢，这是促使我们开展相关研究的初衷。此外，RNAi机制在不同物种中的进化历程，以及工业生产中RNAi是否能够发挥一定功能，这些也是值得探索的方向。尽管目前关于RNAi作用机制和生物学功能的研究已经取得了一些进展，但仍有许多问题有待解决。

(1) 首先，对于新型干扰性sRNAs的挖掘有待进一步深入。纵观RNAi研究领域，sRNAs高通量测序是必不可少的一种研究手段。高通量测序结果中揭示了大量起源于转座子、外显子、内含子的sRNAs，而起源于rRNA或tRNA的sRNAs通常会被当作随机降解片段而忽略，但少数研究发现线虫、小鼠以及人类细胞中部分rDNA起源的sRNAs受到RNAi途径调控^[62–64]，具有特定的生物学功能，真菌的RNAi机制能否将rRNA或rRNA反义链加工为具有调节功能的sRNAs，又是否参与调节真菌特定的生命活动，比如调节rRNA稳态，有待进一步验证。

(2) 此外，传统的高通量测序技术通常利用末端连接接头的方式对sRNAs进行反转录并测序，对于携带特殊修饰或者不具有5′-P/3′-OH的sRNAs来说，现有的接头连接方法很可能会略过特殊的sRNAs序列，使测序结果产生偏差，这无疑阻碍了研究者们对RNAi机制的全面探索。2021年，Shi等报道的PANDORA-seq通过联合酶处理的方式去除RNA修饰^[65]，扩大了sRNAs测序的范围。实验方法的更新能够大大促进该领域的研究进展，未来的研究工作中应努力探索适用于真菌领域的sRNAs技术。

(3) 最后，真菌中分子生物学工具的匮乏也是限制该领域发展的一大原因，值得注意的是，CRISPR技术是一项很好的尝试，目前在脉孢霉、曲霉、隐球菌、木霉等真菌中均已建立了成熟的CRISPR系统^[66–68]，有助于推动真菌领域RNAi生物学功能的研究进展。