2022, Vol. 62
表1(Table 1)
南海珊瑚来源真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的分离鉴定及其次级代谢产物研究
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210568
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 叶伟霞, 赵梦冉, 王璐, 蒋晓东, 张文军, 张长生, 田海妍. 2022
- YE Weixia, ZHAO Mengran, WANG Lu, JIANG Xiaodong, ZHANG Wenjun, ZHANG Changsheng, TIAN Haiyan.
- 南海珊瑚来源真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的分离鉴定及其次级代谢产物研究
- Isolation, identification, and bioactive metabolites of coral-derived fungus Aspergillus sp. SCSIO 40435 from the South China Sea
- 微生物学报, 62(5): 1819-1831
- Acta Microbiologica Sinica, 62(5): 1819-1831
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文章历史
- 收稿日期：2021-09-25
- 修回日期：2021-11-03
- 网络出版日期：2021-11-25
引用本文 |
叶伟霞, 赵梦冉, 王璐, 蒋晓东, 张文军, 张长生, 田海妍. 南海珊瑚来源真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的分离鉴定及其次级代谢产物研究[J]. 微生物学报, 2022, 62(5): 1819-1831.
Ye Weixia, Zhao Mengran, Wang Lu, Jiang Xiaodong, Zhang Wenjun, Zhang Changsheng, Tian Haiyan. Isolation, identification, and bioactive metabolites of coral-derived fungus Aspergillus sp. SCSIO 40435 from the South China Sea[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(5): 1819-1831.
南海珊瑚来源真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的分离鉴定及其次级代谢产物研究
1. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所, 广州 广东 510632;
2. 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 中国科学院海洋微生物中心广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 中国科学院海洋微生物中心广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要：[目的] 南海珊瑚共附生真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435次级代谢产物分离鉴定及抑菌活性筛选。[方法] 利用稀释涂布平板法分离珊瑚共附生真菌。采用单菌多代谢产物方法(one strain many compounds，OSMAC)对分离菌株进行化学多样性筛选，并采用滤纸片扩散法对真菌发酵产物进行抑菌活性分析。通过ITS测序鉴定活性菌株SCSIO 40435的分类地位，运用多种色谱手段从其粗提物中分离纯化单体化合物，并利用各种波谱手段(HRESIMS、1D和2D NMR、单晶X-ray衍射法等)确定化合物的结构。最后，采用微量肉汤稀释法对单体化合物的抑菌活性进行评估。[结果] 从南海珊瑚样品中分离得到19株共附生真菌，结合化学多样性和抑菌活性分析，筛选出1株产物丰富且具有多种抑菌活性的菌株SCSIO 40435。利用ITS测序分析将其鉴定为曲霉属真菌(Aspergillus sp.)，进一步从其发酵产物中分离鉴定了4个对三联苯类化合物：dicandidusin A (1)、candidusin A (2)、terphenyllin (3)和4″-deoxyterphenyllin (4)，其中化合物1为一个对三联苯同源二聚体类新化合物。此外，首次对化合物4的单晶结构进行了报道。[结论] 本研究表明，南海珊瑚中含有丰富的共附生真菌资源，且具有产生结构新颖的活性次级代谢产物的潜力，有望成为药物发现和开发的重要来源。
关键词：珊瑚共附生真菌 活性次级代谢产物 对三联苯二聚体
Isolation, identification, and bioactive metabolites of coral-derived fungus Aspergillus sp. SCSIO 40435 from the South China Sea
1. Institute of Traditional Chinese Medicine & Natural Products, College of Pharmacy, Ji'nan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China;
2. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, Key Laboratory of Tropical Marine Bio-Resources and Ecology, RNAM Center for Marine Microbiology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
2. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, Key Laboratory of Tropical Marine Bio-Resources and Ecology, RNAM Center for Marine Microbiology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: [Objective] To investigate the antimicrobial activity and secondary metabolites from the coral-derived fungus Aspergillus sp. SCSIO 40435. [Methods] The coral-associated fungi were isolated by dilution-plating method. One strain-many compounds (OSMAC) approach was used for the analysis of metabolite diversity, and the antibacterial activities of fungal metabolites were tested via the standard disk diffusion method. The bioactive strain SCSIO 40435 was identified by rDNA ITS sequence analysis. The active metabolites of Aspergillus sp. SCSIO 40435 were isolated and purified from the crude extract by chromatographic methods, and their chemical structures were characterized by HRESIMS, 1D and 2D NMR, and single crystal X-ray diffraction analysis. The antibacterial activities of the isolated compounds were measured by the broth microdilution method. [Results] A total of 19 fungal strains were isolated from corals in the South China Sea. The strain SCSIO 40435 with abundant products and multiple antibacterial activities was screened out and identified as Aspergillus sp. SCSIO 40435. Four p-terphenyl compounds were isolated from the crude extract of Aspergillus sp. SCSIO 40435 and identified as dicandidusin A (1), candidusin A (2), terphenyllin (3), and 4″-deoxyterphenyllin (4), among which compound 1 is a new p-terphenyl homodimer. In addition, the single crystal structure of compound 4 was obtained for the first time. [Conclusion] This study demonstrates that corals from the South China Sea are rich in fungal resources and have the potential to produce novel active secondary metabolites, which are expected to become an important source for drug discovery and development.
Keywords:
coral-associated fungi active secondary metabolites p-terphenyl dimer
南海海域辽阔，生物资源种类繁多，是我国最重要的海岛和珊瑚礁、红树林、海草床等生态系统分布区，也是全球海域生物多样性最高的地区之一[1]。珊瑚礁生态系统是由生物和非生物构建的复杂、独特的生态系统，是海洋中的“热带雨林”。珊瑚礁生态系统除为种类繁多的动植物提供栖息场所外还共附生着丰富的微生物种群[2]。这些微生物长期处于极端的生境下(高压、高盐度、寡营养、低温、黑暗等)，寄生或共生于宿主之中，从而与宿主之间产生特殊的交流方式[3–4]。这种相互关系往往使共附生微生物进化出独特的代谢途径和防御机制，具有产生新颖结构的活性物质的潜能[5–6]。近年来，研究人员逐渐把目光从珊瑚礁的生态学意义、珊瑚微生物群的特征等研究领域转向珊瑚共附生真菌活性次级代谢产物的发掘上，并取得了巨大进展。目前，从珊瑚共附生真菌中获得的活性物质种类多样，Wang等从珊瑚共附生真菌次级代谢产物中分离得到具有新颖结构的硫代甘油酸酯取代的骨架重排混元二萜类化合物Alternarin A，该化合物有显著的神经药理活性[7]。Chao等以二级MS为指导从珊瑚来源的真菌中分离得到4个新颖的7元环肽，并半合成了一系列环七肽衍生物，其合成衍生物显示出中等强度的抗结核杆菌活性[8]。Cheng等从珊瑚来源真菌中分离得到新颖的三元螺环橘霉素衍生物[9]。至今已从珊瑚来源真菌中分离得到萜类、聚酮、肽类、蒽醌类以及生物碱等多种结构类型天然产物，这些天然产物呈现出抗癫痫、抗病毒、抗结核、抗炎以及抗肿瘤等多种生物活性[10–13]，珊瑚来源真菌已经成为当前最具开发前景的天然产物新药源之一。
近期，我们从南海来源珊瑚中筛选出1株产物丰富且具有多种抑菌活性的真菌SCSIO 40435，结合ITS测序鉴定为曲霉属真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435，进一步从其大米培养物中分离鉴定了4个对三联苯类化合物(1–4，图 1)。结合HRESIMS、1D和2D NMR、X-ray单晶衍射等波谱数据，确定化合物dicandidusin A (1)为新的对三联苯同源二聚体，2–4为已知化合物，分别为candidusin A (2)、terphenyllin (3)和4″-deoxyterphenyllin (4)。本文报道曲霉属真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的分离筛选及其次级代谢产物的分离鉴定与活性评价。
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| 图 1 化合物的结构图 Figure 1 The structures of compounds. A: structures of compounds 1–4; B: X-ray crystal structure of compound 4. |
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源
供试珊瑚由中国科学院南海海洋研究所蒋晓东博士采集于中国南海，样品采集后立即放置于无菌塑料样品袋中，保存于4 ℃，低温运输至实验室后用于真菌的分离。
1.1.2 培养基(1) 菌株分离固体培养基
PDA培养基(g/L)：马铃薯葡萄糖水24，琼脂粉20，海盐30。GPSA培养基(g/L)：葡萄糖10，细菌学蛋白胨1，可溶性淀粉10，K2HPO4 10，MgSO4 1，琼脂粉20，海盐30，pH 7.0–7.4。甘油-酪素培养基(g/L)：甘油10，酪蛋白胨10，KNO3 2，NaCl 2，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.01，CaCO3 0.2，琼脂粉20，海盐30，pH 7.0–7.4。
(2) 菌株发酵筛选培养基
PDB培养基(g/L)：马铃薯葡萄糖水24，海盐30。大米培养基：大米10 g，海盐0.45 g，蒸馏水15 mL。小米培养基：小米10 g，海盐0.45 g，蒸馏水15 mL。燕麦培养基：燕麦10 g，海盐0.6 g，蒸馏水20 mL。
(3) 抑菌活性筛选培养基
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，调pH 7.0。
MH培养基(g/L)：水解酪蛋白胨肉汤21。
1.1.3 指示菌种类测试病原菌包括：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)。
1.1.4 主要试剂和仪器PCR扩增仪(Thermo Fisher Scientific ABI Veriti 96 well型，德国Eppendorf公司)；多功能组合式摇床(HYG-C，太仓实验设备厂)；超导核磁共振仪(Bruker AVANCE 700M型，德国Bruker公司)；高分辨飞行时间质谱(Bruker maXis，德国Bruker公司)；柱色谱硅胶(100–200目，烟台江友硅胶开发有限公司)，硅胶薄层板(HS-GF 254，烟台江友硅胶开发有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent 1260，美国Agilent公司)；半制备高效液相色谱仪(Hitachi Primaide，日本日立公司)；色谱柱(Phenomenex ODS column 250 mm×10.0 mm，5 μm；Phenomenex，USA)；培养箱(MJ01，湖北黄石恒丰医疗器械有限公司)。试剂：色谱纯乙腈(安徽时联公司)；其他试剂均为国产分析纯(广州化学试剂厂)。
1.2 真菌的分离和纯化将采集到的样品置于超净台中，用经75%乙醇消毒的剪刀剪取珊瑚样品约10 g，置于装有已灭菌人工海水的烧杯中，对其表面进行清洗，用已灭菌的搅拌机将样品充分碾碎，得组织原液。随后将原液稀释至10–1、10–2，用移液枪吸取200 μL加到分离培养基的平板上，用一次性涂布棒涂布均匀，吹干后置于28 ℃培养箱中倒置培养7–30 d，每隔3 d左右观察菌落生长状态。所有长出的真菌菌落均接种于PDA平板上，并多次纯化直至获得纯的菌株。
1.3 菌株发酵筛选及活性测试将分离得到的真菌菌株接种至PDB液体培养基中(50 mL/250 mL)，28 ℃、200 r/min振荡培养2 d作为发酵培养的种子液，将生长良好的种子液以10% (V/V)的接种量接种至3种固体培养基中，静置培养30 d。收菌后以体积比(V/V) 1:1加入丁酮浸泡提取、旋干，提取物均分成2份。一份用甲醇溶解，HPLC进样检测；另一份提取物加DMSO配成20 mg/mL的溶液，并采用滤纸片扩散法[14]进行抑菌活性筛选。
1.4 真菌SCSIO 40435的菌种鉴定 1.4.1 真菌基因组DNA提取及ITS基因序列扩增利用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，以通用引物ITS1 (5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)对菌株ITS区域进行扩增。PCR扩增体系为20 μL：ddH2O 13 μL，1 ng/μL的DNA模板0.5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 1.2 μL，5×FastPfu缓冲液4 μL，5 units/μL的FastPfu酶0.4 μL，10 μmol/L的ITS1引物0.5 μL，10 μmol/L的ITS4引物0.5 μL。PCR程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物由广州擎科生物技术有限公司回收纯化，完成测序。
1.4.2 系统发育分析利用软件SeqMan将测序得到的序列结果进行校对拼接，将拼接得到的完整序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择同源性较高且具有代表性的真菌作为参考序列，下载相应菌株的序列和信息。使用软件MEGA-X以邻接法(neighbor-joining，NJ)对菌株进行系统发育分析[15–17]。
1.5 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435大规模固体发酵和萃取将菌株Aspergillus sp. SCSIO 40435接种至PDB液体培养基中(50 mL/250 mL)，28 ℃、200 r/min振荡培养2 d作为放大发酵培养的种子液，将生长良好的种子液以20% (V/V)的接种量接种至15 kg大米固体培养基中，静置培养30 d。收集菌体以体积比(V/V) 1:2加入丙酮浸泡提取3次，减压浓缩回收丙酮。将3次浓缩浸膏合并，水混旋，乙酸乙酯萃取3次，经减压浓缩后获得118 g粗浸膏。
1.6 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435中活性次级代谢产物的提取分离乙酸乙酯萃取部位(118 g)，经硅胶柱色谱梯度洗脱(氯仿-甲醇：100/0，95/5，90/10，85/15，70/30，50/50，0/100)，通过薄层色谱法(TLC)检识，结合HPLC分析检测合并得馏分Fr. 1–Fr. 4。其中Fr. 1经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(100/0，5/1，4/1，7/3，6/4，5/5，3/7，2/8，0/100)以及乙酸乙酯/甲醇(100/0，7/3，5/5，3/7，0/100)梯度洗脱，经TLC及HPLC分析合并得11个子馏分Fr.1-A–Fr. 1-K，其中Fr.1-F经反相中压色谱(ODS)，采用乙腈/水体系(A相：0.08% HCOOH/H2O；B相：CH3CN)梯度洗脱(VB: VA= 5:95–95:5，流速10 mL/min)得到20个馏分Fr. 1-F-01–Fr. 1-F-20。Fr.1-F-08经凝胶色谱(Sephadex LH-20)，采用氯仿/甲醇(1:1)体系得到4个馏分Fr.1-F-08-L1–Fr.1-F-08-L4，其中Fr.1-F-08-L4经半制备液相，以乙腈/水体系(A相：0.08% HCOOH/H2O；B相：CH3CN)梯度洗脱(0–15 min，50% B相；15–25 min，50%–70% B相；25.1–33.0 min，100% B相)得到化合物1 (2.9 mg)和化合物2 (46.1 mg)。Fr.1-F-08-L3经半制备液相，以乙腈/水体系(A相：0.08% HCOOH/H2O；B相：CH3CN)等梯度洗脱(VB: VA=50:50)得到化合物3 (25.2 mg)。将馏分Fr.1-D通过重结晶法，纯化得到化合物4 (41.0 mg)。化合物1–4结构如图 1。
1.7 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435中次级代谢产物的活性评价采用微量肉汤稀释法[18]测定化合物1–4的最小抑菌浓度(MIC)。将化合物以DMSO为溶剂配成终浓度为2.56 mg/mL的母液，–20 ℃保藏备用。在96孔板上第1列的每孔加入MH液体培养基200 μL，第2列的每孔加入MH液体培养基100 μL，第3列加入190 μL MH液体培养基，其余每列加入MH液体培养基100 μL。然后在第3列每孔加入样品母液10 μL，吹吸混匀，再从第3列吸取100 μL液体到第4列，吹吸混匀，同理依次往下2倍稀释到第12列，最后1列取100 μL弃去。按照同样的方法分别加入DMSO和环丙沙星作为对照组。
用无菌的MH液体培养基将培养好的菌液稀释1 000倍，除第1列外每孔加入稀释菌液100 μL，使化合物的终浓度分别为64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/mL。以上实验每组做3个平行，37 ℃培养。16 h后观察菌株生长情况，按照CLSI中“甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法”的终点判断，与阳性生长对照管比较，抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌的MIC。
2 结果与分析 2.1 菌株的分离鉴定和筛选对分离获得的19株真菌分别采用3种不同的固体培养基(大米、小米及燕麦培养基)培养，通过HPLC-DAD检测样品的化学多样性，通过纸片法筛选抑菌活性，发现菌株SCSIO 40435的次级代谢产物丰富(图 2)，且对4种革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)均具有抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌作用较强(表 1)。将菌株SCSIO 40435的ITS测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，并下载同源性较高的序列构建进化树分析(图 3)，发现菌株SCSIO 40435的ITS序列与Aspergillus candidus (MT524443.1)的相似性最高，以100%可信度聚在一个分支。综合以上分析结果，将菌株鉴定为Aspergillus sp. SCSIO 40435。
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| 图 2 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435发酵粗提物的HPLC检测分析 Figure 2 HPLC analysis of fermentation extracts of the Aspergillus sp. SCSIO 40435. i: rice medium; ii: millet medium; iii: oatmeal medium. |
表 1. 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435三种发酵培养基粗提物对革兰氏阳性菌抑菌活性结果
Table 1. The antibacterial activities of fermentation extracts of Aspergillus sp. SCSIO 40435 against Gram-positive bacteria
| Crude extract | Indicator | |||
| Bacillus subtilis 1064 | Staphyloccocus aureus ATCC 29213 | Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300 | Micrococcus luteus SCSIO ML01 | |
| Rice medium | ++ | + | + | ++ |
| Millet medium | ++ | + | + | + |
| Oatmeal medium | + | ++ | + | + |
| Vancomycin | ++ | ++ | ++ | +++ |
| Trimethoprim | +++ | +++ | +++ | +++ |
| +: 0≤d < 7 mm; ++: 7≤d < 12 mm; +++: 12 mm≤d. | ||||
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| 图 3 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435的neihgbor-joining (N-J)进化树 Figure 3 Neighbor-joining tree of strain of Aspergillus sp. SCSIO 40435. |
2.2 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435中化合物结构鉴定
通过大米固体培养基对真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435进行放大发酵，从中分离得到4个对三联苯类化合物：dicandidusin A (1)、candidusin A (2)、terphenyllin (3)和4″-deoxyterphenyllin (4)，其中化合物1为对三联苯同源二聚体新化合物。
2.2.1 新化合物结构解析化合物1为灰褐色无定形固体，正离子高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)显示其准分子离子峰为m/z 703.178 6 [M+H]+ (C40H31O12计算值为703.181 0)，不饱和度为26。分析化合物1的1H、13C NMR以及HSQC数据(表 2，图S1)发现有2个氧甲基、6个sp2杂化的次甲基、12个季碳和3个活泼质子信号，仅为元素组成信号的一半，提示化合物1可能是同源二聚体。对其核磁数据进一步分析发现化合物1的核磁数据与已知化合物Candidusin A (2)的核磁数据高度相似，不同之处在于化合物1比2少了一个sp2杂化的次甲基(δH 6.76，H-17；δC 114.8，C-17)，推测1通过C-17/C-17′相连。由于1中3个活泼质子信号位于同一处，因此无法利用HMBC相关(图S1)判断二聚体的连接位置。分析1的NOESY相关，发现H-5、H-14与H3-20有相关(图 4A，图S1)，表明化合物1中2个sp2杂化的次甲基分别位于C-14 (δH，7.29；δC，102.4)及C-5位(δH，6.63；δC，105.1)，进而证实化合物1的2个单体通过C-17/C-17′相连，进一步详细地归属1的核磁信号确证了平面结构。化合物1的D环与D′环之间的联苯键可能具有轴手性，对化合物1的旋光值进行测定，发现其旋光值近乎为零(–0.000 7°)，[α]25 D-2 (c 0.025，MeOH)，推测其为外消旋体。鉴于化合物1的含量较少，未对其进行手性拆分。最后，我们推测了化合物1的生物合成机理(图 4B)：化合物1的生物合成起源于酪氨酸，在生物体内酪氨酸经转氨酶的作用转化为4-羟基苯丙酮酸，2个4-羟基苯丙酮酸缩合，生成对三联苯前体，经烯醇互变、还原、脱水等形成对三联苯单体化合物2[19]，化合物2可能在P450氧化酶的催化下形成自由基化合物2a，2个2a发生自由基偶合、烯醇互变形成化合物1[20]。已报道的P450氧化酚羟基引发的自由基偶合反应多数发生于分子内、形成分子内的C-C键，分子间的、能形成具有轴手性的联苯键自由基偶合反应也有报道，但相对较少[20]。
表 2. 化合物1的1H和13C NMR数据(DMSO-d6)
Table 2. The 1H NMR (700 MHz) and 13C NMR (175 MHz) data of compound 1 in DMSO-d6
| No. | δC, type | δH, mult (J in Hz) | COSY | HMBC (H to C) | NOESY |
| 1 | 136.0, C | ||||
| 2 | 148.5, C | ||||
| 3 | 109.6, C | ||||
| 4 | 148.9, C | ||||
| 5 | 105.1, CH | 6.63, s | C-1, C-3, C-4, C-7, C-13 | H-20 | |
| 6 | 128.3, C | ||||
| 7 | 129.3, C | ||||
| 8 | 130.5, CH | 7.33, d (8.5) | H-9 | C-6, C-10, C-12 | H-9 |
| 9 | 115.1, CH | 6.80, d (8.5) | H-8 | C-7, C-10, C-11 | H-8 |
| 10 | 156.5, C | ||||
| 11 | 115.1, CH | 6.80, d (8.5) | H-12 | C-7, C-10, C-9 | H-12 |
| 12 | 130.5, CH | 7.33, d (8.5) | H-11 | C-6, C-10, C-8 | H-11 |
| 13 | 115.1, C | ||||
| 14 | 102.4, CH | 7.29, s | C-13, C-15, C-16, C-18 | H-20 | |
| 15 | 145.3, C | ||||
| 16 | 147.3, C | ||||
| 17 | 107.4, C | ||||
| 18 | 151.2, C | ||||
| 19 | 60.2, CH3 | 3.49, s | C-1 | ||
| 20 | 55.8, CH3 | 3.99, s | C-4 | ||
| 10/15/16-OH | 9.43, s | ||||
| The first line means the atomic number of compound 1. | |||||
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| 图 4 化合物1的2D NMR相关图及其生物合成路径推导 Figure 4 Key 2D NMR correlations and proposed biosynthetic pathway of compound 1. A: key 1H−1H COSY, HMBC and NOESY correlations of compound 1; B: proposed biosynthetic pathway of compound 1. |
2.2.2 已知化合物结构鉴定
Candidusin A (2)：灰褐色固体，HRESIMS m/z [M+H]+ 353.102 8 (C20H17O6计算值353.102 0)。1H NMR (700 MHz，DMSO-d6)：δH 9.37 (3H，s，10-OH/15-OH/16-OH)，7.42 (2H，d，J=8.5 Hz，H-8/12)，7.38 (1H，s，H-14)，7.08 (1H，s，H-17)，6.86 (2H，d，J=8.5 Hz，H-9/11)，6.70 (1H，s，H-5)，3.97 (3H，s，20-OCH3)，3.75 (3H，s，19-OCH3)。13C NMR (175 MHz，DMSO-d6)：δC 157.1 (C-10)，149.9 (C-18)，149.8 (C-4)，148.9 (C-2)，146.3 (C-16)，143.0 (C-15)，136.4 (C-1)，131.0 (C-6)，130.8 (C-8/C-12)，129.1 (C-7)，115.6 (C-9/C-11)，114.5 (C-3)，114.1 (C-14)，107.5 (C-5)，106.0 (C-13)，99.0 (C-17)，61.0 (C-20)，56.3 (C-19)。波谱数据与文献[21]报道基本一致。
Terphenyllin (3)：白色固体，HRESIMS m/z [M+H]+ 339.122 6 (C20H19O5计算值339.122 7)。1H NMR (700 MHz，DMSO-d6)：δH 9.58 (1H，s，10-OH)，9.34 (1H，s，16-OH)，8.51 (1H，s，2-OH)，7.44 (2H，d，J=8.6 Hz，H-8/12)，7.10 (2H，d，J=8.6 Hz，H-14/18)，6.85 (2H，d，J=8.7 Hz，H-9/11)，6.76 (2H，d，J=8.5 Hz，H-15/17)，6.39 (1H，s，H-5)，3.64 (3H，s，20-OCH3)，3.29 (3H，s，19-OCH3)。13C NMR (175 MHz，DMSO-d6)：δC 157.2 (C-16)，156.3 (C-10)，153.5 (C-4)，148.6 (C-2)，139.7 (C-1)，132.8 (C-6)，132.3 (C-14/C-18)，130.2 (C-8/C-12)，129.2 (C-7)，125.0 (C-13)，117.3 (C-3)，115.6 (C-9/C-11)，114.8 (C-15/C-17)，103.4 (C-5)，60.5 (C-20)，56.0 (C-19)。波谱数据与文献[22]报道基本一致。
4″-deoxyterphenyllin (4)：白色固体，HRESIMS m/z [M+H]+ 323.128 5 (C20H18O4计算值323.127 8)。1H NMR (700 MHz，DMSO-d6)：δH 9.33 (1H，s，16-OH)，8.61 (1H，s，2-OH)，7.62 (2H，dt，J=7.0，1.3 Hz，H-8/12)，7.47 (2H，t，J=7.6 Hz，H-9/11)，7.38 (H，tt，J=7.4，1.2 Hz，H-10)，7.12 (2H，dt，J=8.5，2.0 Hz，H-14/18)，6.78 (2H，dt，J=8.5，2.0 Hz，H-15/17)，6.45 (1H，s，H-5)，3.64 (3H，s，20-OCH3)，3.30 (3H，s，19-OCH3)。13C NMR (175 MHz，DMSO-d6)：δC 156.5 (C-16)，153.6 (C-4)，148.7 (C-2)，139.9 (C-10)，138.7 (C-1)，132.9 (C-6)，132.3 (C-14/C-18)，129.1 (C-8/C-12)，127.7 (C-7)，124.9 (C-13)，118.2 (C-3)，128.8 (C-9/C-11)，114.8 (C-15/C-17)，103.7 (C-5)，60.8 (C-20)，56.1 (C-19)。波谱数据与文献[21]报道基本一致。
4″-deoxyterphenyllin (4)的晶体数据：三斜晶系，空间群P-1 (No. 2)，晶体大小为0.01 mm×0.01 mm×0.01 mm；晶胞参数：a= 8.933 3 (7) Å，b=9.805 5 (8) Å，c=10.267 6 (10) Å，α=85.119 (7) °，β=65.971 (9) °，γ=72.469 (7)°，晶胞体积V=782.57 (13) Å3，Z=2，计算密度1.368 g/cm3，Cu-Kα辐射(λ=1.541 84 Å)；收集总衍射点7 224，独立衍射点3 050；R1=0.046 6，wR2=0.148 7。该晶体数据已上传至剑桥晶体学数据库(CCDC-2116133)。
2.3 真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435中化合物抑菌活性实验采用微量肉汤稀释法[18]评估了化合物1–4对2株革兰氏阴性致病菌大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)和4株革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)的抑菌活性。结果表明(表 3)化合物1对6株致病菌无明显抑制活性，MIC均大于64 μg/mL。化合物2和3对革兰氏阴性的大肠杆菌具有显著生长抑制活性，MIC分别为1 μg/mL和0.5 μg/mL，其中化合物2对鲍曼不动杆菌有生长抑制活性，MIC为64 μg/mL。此外，化合物2对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也表现出中等强度生长抑制活性，MIC分别为32 μg/mL和16 μg/mL；但其对枯草芽孢杆菌及藤黄微球菌无明显抑制作用，MIC大于64 μg/mL。不同的是，化合物4对枯草芽孢杆菌及藤黄微球菌则表现出一定的抑制作用，其MIC分别为64 μg/mL和32 μg/mL，而对其他4株指示菌无明显生长抑制活性，MIC大于64 μg/mL。
表 3. 化合物1–4的抑菌活性结果
Table 3. The antibacterial activities of compound 1–4 (MIC, μg/mL)
| Compounds | E. coli ATCC 25922 | A. baumannii ATCC 19606 | S. aureus ATCC 29213 | MRSA ATCC 43300 | B. subtilis 1064 | M. luteus SCSIO ML01 |
| 1 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 |
| 2 | 1 | 64 | 32 | 16 | > 64 | > 64 |
| 3 | 0.5 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 |
| 4 | > 64 | > 64 | > 64 | > 64 | 64 | 32 |
| Ciprofloxacin | 0.125 | 0.125 | 0.125 | 0.125 | 0.03 | 0.125 |
| E. coli is Escherichia coli ATCC 25922; A. baumannii is Acinetobacter baumannii ATCC 19606; S. aureus is Staphyloccocus aureus ATCC 29213; MRSA is methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300; B. subtilis is Bacillus subtilis 1064; M. luteus is Micrococcus luteus SCSIO ML01. Ciprofloxacin is a positive control. | ||||||
3 讨论与结论
珊瑚等海洋无脊椎动物是海洋生态系统的重要组成部分，蕴含着大量的共附生微生物资源。曲霉属真菌不仅是海洋常见真菌种属之一，也是活性次级代谢产物主要产生菌[23]。迄今为止，从海洋来源曲霉属真菌中已发现多种结构类型的次级代谢产物，如生物碱[24]、聚酮[25]、萜类[26]、蒽醌类[27]、异香豆素类[28]、肽类[29]和对三联苯类[30]等。Terphenyllin是最先发现的对三联苯类化合物，由Takahashi等[31]在1976年分离于Aspergillus candidus。此外，2016年Andernach等[32]从菌株Allantophomopsis lycopodina中分离获得对三联苯与萘并呋喃三联苯的二聚体allantonaphthofuran A–C。至今，已报道的对三联苯衍生物已超过230个[33]，但对三联苯类化合物二聚体鲜有报道。对三联苯类衍生物具有多种生物活性，如神经氨酸酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制、抗氧化、细胞毒性、抗菌和免疫抑制活性[33–34]。本文对化合物1–4的抑菌活性进行了评估，发现已知化合物2不仅对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用(16 μg/mL)微强于金黄色葡萄球菌(32 μg/mL)，还对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有较强的抑制作用，MIC达到1 μg/mL。此外，对鲍曼不动杆菌也表现出微弱的抑制活性(64 μg/mL)，为潜在的抗菌药物先导化合物。遗憾的是，其同源二聚体化合物1并没有观察到明显的抑菌活性。
综上所述，本研究通过化学多样性与抗菌活性分析，从南海珊瑚中筛选了一株真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435进行次级代谢产物分离，从中鉴定了4个对三联苯类化合物(1–4)，其中化合物dicandidusin A (1)为首次报道的新颖对三联苯化合物同源二聚体。本研究还对4个单体化合物进行了抗菌活性评估，结果显示已知化合物2的抑菌活性明显强于化合物3和4，推测化合物2中形成的呋喃环单元可能对抑菌活性发挥重要作用。但其同源二聚体化合物1无明显抑菌活性，因此，关于其具体活性作用机理的研究，还有待进一步探索。本研究不仅丰富了现有对三联苯类化合物的多样性，而且为后续利用珊瑚来源的真菌生产活性代谢产物奠定了基础。
补充材料图S1 Dicandidusin A (1)的相关图谱
本文补充材料见网络版http://journals.im.ac.cn/actamicrocn。补充材料为作者提供的原始数据，作者对其学术质量和内容负责。
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