2022, Vol. 62
表1(Table 1)
滇藏热泉arxA基因型厌氧砷氧化原核微生物多样性及其影响因素
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220326
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 闫广盛, 马力, 王露霞, 于志成, 杨渐, 普布多吉, 吴耿, 蒋宏忱. 2022
- YAN Guangsheng, MA Li, WANG Luxia, YU Zhicheng, YANG Jian, Dorji Phurbu, WU Geng, JIANG Hongchen.
- 滇藏热泉arxA基因型厌氧砷氧化原核微生物多样性及其影响因素
- Diversity of arsenic-oxidizing prokaryotes containing arxA gene in Yunnan-Tibet hot springs and the influencing factors
- 微生物学报, 62(6): 1986-2000
- Acta Microbiologica Sinica, 62(6): 1986-2000
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文章历史
- 收稿日期：2022-05-02
- 修回日期：2022-05-24
- 网络出版日期：2022-05-31
引用本文 |
闫广盛, 马力, 王露霞, 于志成, 杨渐, 普布多吉, 吴耿, 蒋宏忱. 滇藏热泉arxA基因型厌氧砷氧化原核微生物多样性及其影响因素[J]. 微生物学报, 2022, 62(6): 1986-2000.
Yan Guangsheng, Ma Li, Wang Luxia, Yu Zhicheng, Yang Jian, Dorji Phurbu, Wu Geng, Jiang Hongchen. Diversity of arsenic-oxidizing prokaryotes containing arxA gene in Yunnan-Tibet hot springs and the influencing factors[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(6): 1986-2000.
滇藏热泉arxA基因型厌氧砷氧化原核微生物多样性及其影响因素
1. 中国地质大学(武汉), 生物地质与环境地质国家重点实验室, 湖北 武汉 430074;
2. 西藏自治区高原生物研究所, 西藏 拉萨 850000
2. 西藏自治区高原生物研究所, 西藏 拉萨 850000
摘要：[目的] 探究滇藏地区热泉沉积物微生物及arxA基因的多样性及其影响因素。[方法] 采用Illumina MiSeq高通量测序技术和统计学的分析方法，针对3个滇藏地热区的22个样点，进行地球化学分析及微生物多样性分析，并分析其与环境因子之间的相关性。[结果] 沉积物微生物群落主要门类及其丰度占比为Chloroflexi (21.27%)、Deinococcus-Thermus (17.25%)、Aquificae (13.39%)、Proteobacteria (9.27%)、Acetothermia (8.3%)、Bacteroidetes (4.96%)与Crenarchaeota (4.57%)；具有arxA基因的微生物主要门类及其丰度占比分别为Proteobacteria (64.87%)、Bipolaricaulota (9.55%)、Deinococcus-Thermus (6.42%)与Crenarchaeota (4.05%)；不同地热区优势种群有所差异，主要受温度、pH值、砷浓度、总溶解固体(TDS)及海拔等因素的影响，Mantel检验呈显著相关性(P < 0.001)。[结论] 沉积物中具有arxA基因的微生物主要以Proteobacteria为主；不同地热区受到不同环境因子及地理隔离因素的影响，优势群落存在一定地理分布差异；然而，其中具有arxA基因的微生物与pH值无相关性，主要受控于海拔、砷浓度、TDS与空间因素等，体现了此类微生物生理代谢特征的差异性与特殊性。
关键词：滇藏地区 热泉 砷氧化 arxA基因
Diversity of arsenic-oxidizing prokaryotes containing arxA gene in Yunnan-Tibet hot springs and the influencing factors
1. State Key Laboratory of Biogeology and Environmental Geology, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei, China;
2. Tibet Plateau Institute of Biology, Lhasa 850000, Tibet, China
2. Tibet Plateau Institute of Biology, Lhasa 850000, Tibet, China
Abstract: [Objective] To study the diversity of microorganisms in sediments of hot springs in Yunnan and Tibet, the existence of arxA in them, and the influencing factors. [Methods] Illumina MiSeq and statistical analysis were employed for geochemical analysis and microbial diversity analysis of the 22 samples in 3 geothermal areas in Yunnan and Tibet and the relationship between the microorganisms and environmental factors was elucidated. [Results] The dominant phyla in the sediments were Chloroflexi (abundance: 21.27%), Deinococcus-Thermus (abundance: 17.25%), Aquificae (abundance: 13.39%), Proteobacteria (abundance: 9.27%), Acetothermia (abundance: 8.3%), Bacteroidetes (abundance: 4.96%), and Crenarchaeota (abundance: 4.57%). arxA gene-harboring phyla were Proteobacteria (abundance: 64.87%), Bipolaricaulota (abundance: 9.55%), Deinococcus-Thermus (abundance: 6.42%), and Crenarchaeota (abundance: 4.05%). The dominant populations were different among the geothermal areas, which was mainly caused by the temperature, pH, arsenic content, total dissolved solids (TDS), and altitude, as manifested by the significant correlation (P < 0.001) between the microorganisms and the environmental factors verified by Mantel test. [Conclusion] arxA gene-harboring microorganisms in the sediments of hot springs were dominated by Proteobacteria and were affected by environmental factors and geographical isolation. They exhibited geographical distribution pattern, as indicated by unique dominant microbial groups in different geothermal areas. In contrast, the arxA gene-containing microbial groups showed no correlation with pH, but were mainly influenced by altitude, arsenic content, TDS, and spatial variables. This suggests the unique physiological characteristics of them among the whole microbial communities.
Keywords:
Yunnan and Tibet hot springs arsenic oxidation arxA gene
砷(arsenic，As)是自然界中分布极为广泛的一种有毒类金属元素，广泛存在于金属矿区、地下水、农田以及热泉等自然环境中，参与地球上众多的生物地球化学循环过程[1–2]。自然界中的砷形态众多，有价态As3–、As0、As3+与As5+，溶解态的砷主要存在价态为As3+与As5+[3]。矿物是砷的主要赋存形式，通常砷会以吸附态的形式存在于矿物(比如水铁矿和氧化铝等)表面，自然界中的含砷矿物有200多种，比如砷黄铁矿(FeAsS)、雄黄(AsS)、雌黄(As2S3)、臭葱石(FeAsO4·2H2O)等，其中砷黄铁矿在自然界中的丰度最高[4–5]。环境中砷的来源主要有自然和人为过程两部分[6]，自然过程有岩浆活动、含砷硫化物的氧化(如雄黄矿、富砷黄铁矿等)、微生物介导的砷转化、陆地或水中含砷矿物的风化等[7–10]。人为来源包括含砷煤炭的燃烧、矿物的开采与冶炼、含砷工农业废水的排放、二甲胂酸等农药杀虫剂的使用等[6, 11–13]。砷的形态、毒性和迁移性会受到水文、矿物学、化学形态及生物作用的共同影响，其中，微生物介导的砷转化是环境砷行为的主要影响因素[14]。
微生物参与砷形态的转化的途径包括氧化还原、甲基化与脱甲基、巯基化与脱巯基等，多种功能基因参与了不同的砷代谢过程[15–17]。其中，砷氧化是指微生物通过位于细胞周质空间的砷氧化酶(arsenite oxidase)将As3+氧化成As5+的过程[18]，这一类微生物被称为砷氧化微生物(arsenic oxidizing bacteria)。根据代谢机制的不同，砷氧化微生物又被分为异养型(heterotrophic arsenite oxidizers，HAOs)与化能无机自养型(chemolithoautotrophic arsenite oxidizers，CAOs)。其中HAOs必须借助外加有机碳源获取能量将As3+氧化成As5+，是微生物自身的氧化解毒过程[19]；而CAOs以As3+作为电子供体，O2 (好氧)或含氧酸根(厌氧，包括硝酸根等)作为电子受体，从而实现As3+氧化并产生能量固定CO2用于自身生长[20]。目前研究最透彻的砷氧化酶是AioA (又叫AroA、AoxA和AsoA)，编码基因是aioA基因。aioA基因广泛存在于原核生物中，这些微生物不仅门类多样，而且功能也各有差异。例如异养型砷氧化微生物Thermus HR13既能氧化As3+，又能在厌氧环境下还原As5+[21]。再如兼性微生物Rhizobium NT-26[22]，该微生物能在好氧环境下氧化As3+，又能在厌氧环境下利用硝酸根作为电子受体，As3+作为电子供体生长。在近些年的研究中，研究人员新发现了一种同样具备砷氧化功能的基因片段，该片段缺失了传统的aioA基因片段，且与arrA砷还原基因类似，研究人员将其命名为arxA基因，酶为ArxA。目前对于arxA基因的研究较少，很多机制观点尚不明确。在几项关于具有arxA基因的化能自养型与光能自养型微生物的研究[23–28]中，研究人员发现此类微生物仅可在化能自养条件下与硝酸盐的还原建立关系，除此之外，由于ArxA、ArrA与AioA均属于DMSO还原酶家族，研究人员推测不同砷代谢酶的进化关系可能为ArsC→ArrA→ArxA→AioA，ArxA与ArrA有更大的同源性。迄今为止，所有报道具有arxA基因的砷氧化功能微生物仅在美国莫诺湖及其附近热泉和热水溪河床[2, 23, 25–26, 29]、美国黄石公园热泉[26]、我国云南腾冲热泉[30]以及蒙古库苏古尔湖[31]等地的沉积物中被发现，且都是厌氧的碱性环境。因此，对arxA基因的研究有助于在如今研究尚浅的大背景下，加深我们对这一类新型砷氧化微生物的了解。
热泉是地球环境中重要的砷排放来源之一，参与砷的地球化学循环，在岩浆流体的影响下，往往具有较高浓度的砷富集[32]。因此，热泉是研究微生物介导的砷生物地球化学循环的理想地质体。我国的滇藏地热带是世界上最活跃的地热区之一，该地区地热资源异常丰富，以藏南、川西、滇西地区为最多[33]。其中，西藏阿里地区多果曲热泉是目前已报道的极端环境中自然砷含量(40 mg/L)最高的地区(西藏温泉志)；而西藏日喀则市的搭格架地热区的高温间歇泉在我国境内十分罕见，含有丰富的铯等元素[34–35]；云南腾冲因其独特的地理位置，水热活动范围大、强度高、类型齐全，有着极为丰富的地热及地质微生物资源[36]。以上地热区地球化学特征鲜明，高温高砷环境为极端嗜热微生物提供了一个良好的生存环境，如此环境下极有可能孕育出代谢特征明显的砷氧化类微生物。因此，对滇藏地区热泉微生物进行多样性及功能基因分析能够帮助我们了解其中的微生物群落结构，丰富我们对砷氧化微生物在地区分布上的认识。本研究以滇藏地区3个不同砷浓度的典型地热区代表性热泉为研究对象，通过地球化学分析、高通量分析及统计学分析对22个热泉沉积物样点进行了微生物群落多样性研究以及与环境因子和空间因子的响应研究，旨在加深我们对热泉生境中砷氧化微生物群落多样性的认知，并为后续相关热泉生境砷氧化微生物的研究提供数据基础及参考。
1 材料与方法 1.1 采样点分布本研究涉及沉积物样点共22个，其中：西藏阿里地区多果曲地热区(DGQ) 9个样点，采集时间2020年10月，地理坐标集中于北纬30°42′19″，东经82°6′20″，平均海拔4 860 m；西藏日喀则市搭格架地热区(DGJ) 7个样点，采集时间2019年8月，地理坐标集中于北纬29°35′54″–29°35′56″，东经85°45′0″–85°45′16″，平均海拔5 086 m；云南省腾冲市(TC) 6个样点，采集时间2020年7月与2021年12月，地理坐标集中于北纬24°57′12″–24°95′10″，东经98°23′24″–98°43′61″，海拔在1 300–1 500 m。
1.2 样品采集与测试每个样点均采集2份表层沉积物(0–5 cm)与热泉水混合物装于50 mL离心管(无菌)中约2/3体积，用封口膜密闭，野外储存于干冰箱中，实验室内储存于−80 ℃超低温冰箱用于微生物DNA的提取；采集3管热泉水经0.22 μm滤膜过滤后装于15 mL离心管中，其中一管用于检测阴离子，一管添加浓HNO3酸化至pH < 1用于检测阳离子，一管添加15% 浓H2O2和25% 浓HNO3用于检测砷等微量元素。
采样过程中涉及的现场指标测试如下：地理坐标信息使用便携式GPS仪器(eTrex H，美国)测定；使用温度/pH探针原位测量水温和pH值(LaMotte)；水化学参数，如总溶解固体(TDS)等，使用便携式水质分析仪(Thermo Scientific ORION STAR A329)现场测量；湖泊溶解氧、碱度、硫化物和二价铁浓度等水化学指标使用哈希试剂盒(HACH)，采用分光光度法测定；碱度采用滴定法现场测定。
室内检测指标测试方法如下：NO3–、NO2–等主要阴离子待测样品采用离子色谱IC (Dionex ICS-900，IonPac AS18 4×250 mm；Thermo Fisher)检测，K+、Na+、Ca2+、Mg2+等主要阳离子待测样品采用离子色谱IC (Dionex ICS-900，IonPac CS12A 4×250 mm；Thermo Fisher Scientific Inc.)测定；砷等微量元素待测样品采用电感耦合等离子体ICP-MS (ICAP RQ，Thermo Fisher，Carlsbad)测试，其中O2 (AsO+，m/z 91)作为动态反应池气体，Rh (Rh+，m/z 103)作为内标。
1.3 DNA的提取及PCR扩增所有采集的样点均进行了DNA的提取，每个样点设置3个平行样，方法采用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒(MP Biomedical)提取。采用515F及带有barcode的806R引物与根据前人研究改进后的arxA功能基因引物[26]分别进行16S rRNA与arxA基因扩增，序列信息如下：16S rRNA基因，515F (5′-GTGYCAGC MGCCGCGGTAA-3′)与806R (5′-GGACTACN VGGGTWTCTAAT-3′)；arxA基因，arxA_Deg_F_B (5′-CCATCWSCTGGRACG AGGCCYTSG-3′)与arxA_Deg_R_B (5′-GTWGTTGTAGGGGCGGA AS-3′)。PCR扩增程序为：16S rRNA基因，预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 45 s，退火53 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，重复变性至延伸三步39个循环，末次延伸72 ℃ 10 min，最后12 ℃保温；arxA基因，预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，重复变性至延伸三步39个循环，末次延伸72 ℃ 10 min，最后12 ℃保温。扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用EC3 Imaging System凝胶成像系统(UVP)进行观察，选择阳性样品切胶装于2 mL已灭菌离心管中用于纯化回收，纯化采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)，DNA的浓度检测采用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop Technology)，浓度达标的DNA样品送至Illumina MiSeq平台进行高通量测序(2×250 bp/2×300 bp双端测序)。
1.4 高通量数据分析测试下机的原始基因序列首先通过FLASH (fast length adjustment of short reads)的默认设置拼接完成之后，删除前后引物序列，然后使用QIIME v1.9.0程序的推荐步骤进行序列的解析和高质量序列的筛选，同时去除低质量(质量分数Q < 20)的序列。采用USEARCH程序的UCHIME模块进行嵌合体检查[37]。针对16S rRNA基因序列，样品间基因的数量使用扩增序列变异体(amplicon sequence variants，ASVs)作为标记基因统计数值。对于arxA基因序列，采用98%的核酸序列相似性划分分类操作单元(operational taxonomic units，OTUs)并统计样品间基因的数量[38]。所有16S rRNA和arxA基因的代表性序列均需通过USEARCH软件的usearch-sinax功能分别搜索16S rRNA基因数据库(SILVA v138)和NCBI基因数据库(Refseq)鉴定序列的分类学信息。
1.5 统计学分析统计学分析主要通过R语言(R4.1.1)软件完成。利用“vegan”软件包进行α多样性指数计算；利用“vegan”软件包进行mantel分析，以检验单一环境因子对微生物群落的相关性；利用“reshape2”和“ggplot2”软件包构建相对丰度柱状图，评估不同地区样本的种群丰度差异；利用“Hmisc”软件包计算环境变量与种群相对丰度之间的Pearson相关系数；利用“vegan”、“grid”和“ggplot2”软件包，采用典型对应分析(CCA)评价环境因子和空间变量对微生物群落结构的影响；采用主邻域矩阵(PCNM)的空间分解方法对样本的地理坐标进行分析，将样本地理坐标分为多个空间向量，选择具有显著相关性(P < 0.05)的空间变量与环境因子利用“vegan”软件包进行方差分解分析(variance partitioning analysis，VPA)以确定环境因子与空间因子对微生物群落结构影响的相对贡献率。
1.6 登录序列号本研究所得序列已提交至NODE数据库，序列号为OEP003361。
2 结果与分析 2.1 水体理化性质DGQ所采集的热泉沉积物样品pH比较接近，为7.5–8.0，呈弱碱性，温度为46–78 ℃，热泉水TDS为2 400 mg/L左右，其中主要离子成分为HCO3–、Na+、Cl–、K+和SO42–；DGJ热泉样品pH为8.5–9.0，偏碱性，温度为32–58 ℃，溶解氧(DO)数据不全，已检测数据有近半成小于1 mg/L，表明样品环境接近缺氧或厌氧，TDS为900 mg/L左右，主要离子成分为HCO3–、Na+、Cl–和SO42–。TC热泉样品pH为6.0–9.6，大部分为弱碱性—碱性水，仅有WGQ一个样点为酸性水，温度为38–95 ℃，TDS为500–1 800 mg/L，泉水中主要离子成分为HCO3–、Na+、Cl–、K+、Ca2+和SO42–，整体来讲差异较大特征较为显著。统观以上三者，TC各样点之间各参数之间的差异性较大，这与TC各样点分布分散环境差异较大有关；而三地TDS的差异也表明DGQ泉眼可溶性物质的含量也较高。除此之外的其他重要数据可见表 1。
表 1. 采样点信息及主要理化参数
Table 1. Information of sampling points and main physical and chemical parameters
| Location | Sample ID | GPS (E/N) | pH | T/℃ | Altitute/m | TDS/(mg/L) | NO3–/(mg/L) | NO2–/(mg/L) |
| DGQ | DGQ-1 | 82°6′20″/30°42′19″ | 7.5 | 69 | 4 861 | 2 390.0 | 1.2 | 18.6 |
| DGQ-2 | 82°6′20″/30°42′19″ | 7.7 | 70 | 4 861 | 2 316.0 | 1.1 | 19.2 | |
| DGQ-3 | 82°6′20″/30°42′19″ | 7.5 | 78 | 4 861 | 2 385.0 | 1.3 | 19.0 | |
| DGQ-4 | 82°6′20″/30°42′19″ | 8.0 | 66 | 4 861 | 2 386.0 | 1.3 | 29.7 | |
| DGQ-5 | 82°6′20″/30°42′19″ | 7.5 | 46 | 4 861 | 2 339.0 | 1.2 | 19.6 | |
| DGQ-6 | 82°6′20″/30°42′19″ | 8.0 | 63 | 4 861 | 2 426.0 | 1.1 | 21.4 | |
| DGQ-7 | 82°6′20″/30°42′19″ | 8.0 | 65 | 4 861 | 2 390.0 | 1.0 | 19.9 | |
| DGQ-9 | 82°6′20″/30°42′19″ | 8.0 | 56 | 4 861 | 2 393.0 | 1.0 | 26.6 | |
| DGQ-10 | 82°6′20″/30°42′19″ | 7.7 | 72 | 4 861 | 2 385.0 | 1.1 | 18.7 | |
| DGJ | DGJ1-2 | 85°45′5″/29°35′54″ | 8.6 | 58 | 5 055 | 900.7 | 1.7 | 16.2 |
| DGJ1-3 | 85°45′5″/29°35′54″ | 8.7 | 49 | 5 054 | 899.3 | 1.0 | 16.2 | |
| DGJ1-4 | 85°45′5″/29°35′54″ | 8.5 | 40 | 5 054 | 909.6 | 1.0 | 15.7 | |
| DGJ2-2 | 85°45′3″/29°35′56″ | 8.9 | 54 | 5 051 | 903.1 | 1.1 | 13.4 | |
| DGJ2-3 | 85°45′3″/29°35′56″ | 8.8 | 46 | 5 050 | 909.8 | 1.2 | 15.8 | |
| DGJ2-4 | 85°45′3″/29°35′56″ | 8.8 | 32 | 5 048 | 905.5 | 1.0 | 0.9 | |
| DGJ13 | 85°44′57″/29°36′6″ | 8.5 | 49 | 5 070 | 932.6 | 1.8 | 14.1 | |
| TC | DGG-R | 98°26′17″/24°17′12″ | 7.9 | 75 | 1 414 | 832.8 | 1.9 | 7.4 |
| GMQ | 98°43′61″/24°95′10″ | 9.6 | 94 | 1 352 | 1764.0 | 0.0 | 11.6 | |
| 98°26′16″/24°57′2″ | 7.2 | 71 | 1 337 | 729.3 | 0.2 | 0.3 | ||
| HMZ3 | 98°26′17″/24°57′0″ | 9.1 | 92 | 1 350 | 918.9 | 1.8 | 13.0 | |
| LL03 | 98°40′5″/24°39′18″ | 9.1 | 88 | 1 369 | 527.1 | 0.0 | 0.0 | |
| LP-Mix2 | 98°23′24″/24°54′31″ | 8.0 | 56 | 1 137 | 1 360.0 | 4.9 | 0.0 | |
| Locations are the areas of samples collection, DGQ means Duo Guo Qu, DGJ means Da Ge Jia, TC means Teng Chong. | ||||||||
另值得一提的是，三地样点总砷含量呈现出一个明显的高、中、低的梯度变化(图 1)：DGQ样品中总砷浓度在40 mg/L左右，为最高，其次DGJ样品中总砷浓度为7–8 mg/L，而TC样品中总砷浓度为0.005–1.000 mg/L，为最低。
|
| 图 1 不同地热区总砷浓度箱图 Figure 1 Box plots of total arsenic concentrations in different geothermal areas. DGQ means Duo Guo Qu Geothermal Zone, DGJ means Da Ge Jia Geothermal Zone, TC means Teng Chong Geothermal Zone. |
2.2 微生物群落多样性特征
通过对22个沉积物样点16S rRNA基因高通量数据进行处理，共得到1 004 241条序列，这些序列分属于65个门，140个纲，292个目，416个科，562个属。其中，门级别平均丰度靠前的分别为：Chloroflexi (21.27%)、Deinococcus-Thermus (17.25%)、Aquificae (13.39%)、Proteobacteria (9.27%)、Acetothermia (8.3%)、Bacteroidetes(4.96%)与Crenarchaeota (4.57%)；纲级别靠前的分别为：Chloroflexia (16.73%)、Deinococci (16.63%)、Aquificae (12.93%)、Acetothermiia (8.28%)、Gammaproteobacteria (4.36%)与Alphaproteobacteria (3.85%)。而通过对arxA基因高通量结果进行分析处理，共得到915 394条序列，分属于26个门，40个纲，57个目，78个科，87个属。其中，门级别平均丰度靠前的分别为：Proteobacteria (64.87%)、Bipolaricaulota (9.55%)、Deinococcus-Thermus (6.42%)、Crenarchaeota (4.05%)、Planctomycetes (1.75%)、Verrucomicrobia (1.09%)，纲级别靠前的分别为：Betaproteobacteria (47.9%)、Alphaproteobacteria (14.15%)、Deinococci (6.42%)、Thermoprotei (4.05%)与Gammaproteobacteria (2.55%)，除此之外，arxA基因所得序列的Shannon-Wiener指数范围为0.91–4.93，Simpson指数范围为0.27–0.98，而观察到的ASV数量则是DGJ地区要明显高于DGQ与TC。详细信息见表 2。
表 2. 沉积物样品arxA基因α多样性指数
Table 2. Alpha diversity index of arxA genes in sediment samples
| Sample ID | Total reads | Observed ASVs | Shannon-Wiener | Simpson | Equitability |
| DGQ-1 | 55 691 | 192 | 2.0 | 0.6 | 0.4 |
| DGQ-2 | 46 039 | 280 | 1.6 | 0.4 | 0.3 |
| DGQ-3 | 41 353 | 188 | 2.4 | 0.8 | 0.5 |
| DGQ-4 | 43 846 | 265 | 1.3 | 0.4 | 0.2 |
| DGQ-5 | 35 304 | 344 | 3.6 | 0.9 | 0.6 |
| DGQ-6 | 53 124 | 161 | 1.1 | 0.4 | 0.2 |
| DGQ-7 | 50 511 | 161 | 0.9 | 0.3 | 0.2 |
| DGQ-9 | 54 802 | 214 | 1.3 | 0.4 | 0.2 |
| DGQ-10 | 51 277 | 223 | 1.8 | 0.6 | 0.3 |
| DGJ1-2 | 46 682 | 450 | 3.8 | 0.9 | 0.6 |
| DGJ1-3 | 50 176 | 617 | 4.4 | 1.0 | 0.7 |
| DGJ1-4 | 33 474 | 568 | 4.3 | 1.0 | 0.7 |
| DGJ2-2 | 44 641 | 414 | 2.8 | 0.8 | 0.5 |
| DGJ2-3 | 38 680 | 488 | 4.3 | 1.0 | 0.7 |
| DGJ2-4 | 30 898 | 606 | 4.9 | 1.0 | 0.8 |
| DGJ13 | 37 057 | 441 | 4.1 | 0.9 | 0.7 |
| LP-Mix2 | 25 553 | 267 | 3.9 | 1.0 | 0.7 |
| LL03 | 50 076 | 187 | 3.4 | 0.9 | 0.7 |
| HMZ3 | 41 554 | 145 | 2.6 | 0.9 | 0.5 |
| 6 973 | 199 | 4.4 | 1.0 | 0.8 | |
| GMQ | 47 751 | 153 | 1.9 | 0.5 | 0.4 |
| DGG-R | 29 932 | 177 | 2.9 | 0.9 | 0.6 |
| Locations are the areas of samples collection, DGQ means Duo Guo Qu, DGJ means Da Ge Jia, TC means Teng Chong. | |||||
2.3 微生物多样性与环境因子和空间因子的响应 2.3.1 微生物群落与环境因子的相关性
通过单一环境因子与微生物群落之间的相关性分析(Mantel检验)，结果表明主要环境因子(pH、温度、海拔、砷浓度、TDS和NO3–)与沉积物微生物种群及arxA功能基因微生物均具有显著的相关性(P < 0.001) (表 3)。
表 3. 单一环境因子与微生物群落结构的Mantel检验
Table 3. Mantel test of single environmental factor and microbial communities
| Environmental factor | R | P | |||
| 16S rRNA | arxA | 16S rRNA | arxA | ||
| pH | 0.43 | 0.38 | < 0.001 | < 0.001 | |
| Temperature | 0.36 | 0.29 | < 0.001 | < 0.001 | |
| Altitude | 0.46 | 0.36 | < 0.001 | < 0.001 | |
| As | 0.47 | 0.42 | < 0.001 | < 0.001 | |
| TDS | 0.51 | 0.36 | < 0.001 | < 0.001 | |
| NO3– | 0.37 | 0.35 | < 0.001 | < 0.001 | |
为进一步了解主要微生物与主要环境因子的相关性，选取丰度前14的沉积物微生物纲级别与丰度 > 1%的arxA功能基因微生物纲级别进行了Pearson相关性分析(图 2)，结果表明沉积物中Gammaproteobacteria与Alphaproteobacteria对环境因子最为敏感，其中Gammaproteobacteria与TDS和砷浓度呈显著正相关(P < 0.001)，与海拔呈正相关(P < 0.05)；而Alphaproteobacteria与温度和TDS呈显著正相关(P < 0.01)，与砷浓度呈正相关(P < 0.05)。除此之外，温度的影响较为广泛，除了与Alphaproteobacteria相关之外，还与Thermodesulfovibrionia呈正相关(P < 0.05)，与Oxyphotobacteria (P < 0.05)和Acidobacteriia (P < 0.05)呈负相关。包含arxA基因微生物中，占主要丰度的Betaproteobacteria与海拔和TDS呈正相关(P < 0.05)，与砷浓度呈显著正相关(P < 0.01)；Gemmatimonadetes与海拔呈显著负相关(P < 0.01)，与NO3–呈显著正相关(P < 0.001)；除此之外，纲级别中未鉴定纲也与海拔、砷浓度与TDS存在一定负相关性，这为arxA基因的多样性提供了更多的可能，值得进一步探究。
|
| 图 2 热泉沉积物(A)以及包含arxA基因(B)主要丰度微生物(纲级别)与主要环境因子Pearson相关性分析 Figure 2 Pearson correlations between dominant classes of microbial [microbial in hot springs sediments (A) and microbial with arxA genes (B)] and main environmental factors (***: P < 0.001; **: P < 0.01; *: P < 0.05). |
为了解主要环境因子与微生物群落α多样性指数的相关性，进行了Pearson相关性分析(图 3)，结果表明，对于沉积物微生物群落的α多样性指数，NO3–的相关性最大，与ASV数呈显著正相关(P < 0.001)，其余环境因子分别与不同指数呈现出一定的相关性，pH值无相关性。而对于arxA基因微生物的α多样性指数，砷浓度、TDS与温度呈现出的相关性非常显著，TDS更是与所有指数均具有相关性。
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| 图 3 热泉沉积物(A)以及包含arxA基因(B) α多样性指数与主要环境因子Pearson相关性分析 Figure 3 Pearson correlations between alpha diversity index [microbial in hot springs sediments (A) and microbial with arxA genes (B)] and main environmental factors (***: P < 0.001; **: P < 0.01; *: P < 0.05). |
2.3.2 环境与空间因子对微生物群落结构的影响
主坐标分析(PCoA)结果表明，DGQ、DGJ与TC三个地区的样点聚类明显，彼此之间存在着明显的地理差异，故地理因素对样点的影响也不可忽视。在利用R语言软件对高通量数据进行空间向量分析(PCNM)后，产生了4个分解向量，对这4个分解向量进行筛选，最终得到了PCNM1、PCNM3和PCNM4这3个显著相关(P < 0.05)的空间因子。综合环境因子与这3个空间因子分别对沉积物微生物种群与arxA基因微生物进行CCA分析(图 4)，结果表明，二者的CCA分析中影响较大的是PCNM1、海拔、砷浓度与TDS，要强于pH与温度，其中PCNM1对群落的影响最大，且相关性最高，分别与TC样品正相关，与DGQ与DGJ负相关。通过方差分解分析绘制了环境因子与空间因子对微生物群落结构变化的解释比例VPA图(图 5)，可看出对于沉积物微生物，环境因子(包括pH、温度、海拔、砷浓度、TDS和NO3–)的解释量为43%，空间因子(包括PCNM1、PCNM2、PCNM3和PCNM4)的解释量为35%，二者共同的解释量为28%，二者总体解释量为50%，未解释量为50%；对于arxA基因微生物，环境因子的解释量为32%，空间因子的解释量为27%，二者共同的解释量为22%，二者总体解释量为37%，未解释量为63%。
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| 图 4 不同环境因子与空间因子对沉积物(A)以及包含arxA基因(B)微生物群落典范对应(CCA)分析 Figure 4 Canonical correspondence analysis (CCA) between microbial communities [microbial in hot springs sediments (A) and microbial with arxA genes (B)] and different environmental or spatial factors. (DG: Duo Guo Qu, DGJ: Da Ge Jia, TC: Teng Chong). |
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| 图 5 环境因子与空间因子对沉积物(A)以及包含arxA基因(B)微生物群落组成贡献VPA图(环境因子：包括pH值、温度、海拔、砷浓度、TDS和NO3–；空间因子：包括PCNM1、PCNM2、PCNM3和PCNM4) Figure 5 Variance partitioning analysis (VPA) between microbial communities [microbial in hot springs sediments (A) and microbial with arxA genes (B)] and different environmental or spatial factors (environmental factors: inclouding temperature, pH, altitude, arsenic content, TDS and nitrate; spatial variable: inclouding PCNM1, PCNM2, PCNM3 and PCNM4). |
3 讨论 3.1 微生物多样性特征分析
迄今为止，关于世界各地热泉微生物的报道主要集中于美国黄石公园[39]、马来西亚[40]、俄罗斯堪察加半岛[41]以及中国云南与西藏等地区[42–44]。细菌域优势种群较为相似，主要集中于Aquificae、Proteobacteria、Firmicutes、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi、Bacteroidetes等门，本研究结果与之相符。但由于不同样点之间环境特征的差异，不同样点之间的优势菌群也存在着差异，其中DGQ地区优势菌门为Deinococcus-Thermus、Aquificae与Chloroflexi；DGJ地区为Chloroflexi、Proteobacteria与Bacteroidetes；而TC地区样点之间存在较大差异性，优势菌门各不相同，为Chloroflexi、Aquificae、Proteobacteria、Acetothermia或古菌门Crenarchaeota。
目前，对于arxA基因微生物的研究屈指可数，大多都分离自Proteobacteria中的Gammaproteobacteria[2, 23, 25, 27, 31, 45–46]。例如，Oremland等[2]从美国加利福尼亚州Mono湖分离出的一株兼性化能自养微生物MLHE-1，发现该微生物既能在以无机电子供体(As3+、H2、S2–)与NO3–的厌氧培养基中生长，也能在以醋酸盐为电子受体的培养基上异养生长，这是最早分离出的厌氧自养砷氧化微生物，系统发育分析其属于Gammaproteobacteria，与Alkalispirillum mobile (98.5%)和Alcalilimnicola halodurans (98.6%)最为相似。另外，Wu等[30]在我国云南省腾冲市热海景区大滚锅热泉中成功分得了Desulfotomaculum属的一株微生物TC-1，其基因成功扩增出了arxA基因，且能够参与硫砷酸盐的形成，这有助于加深我们对arxA基因微生物多样性的了解。本研究中arxA基因微生物门级别丰度占优的门类为Proteobacteria，平均占比达到了64.87%，证明arxA基因主要属于Proteobacteria微生物，这与前人的研究结果相符。在纲级别，DGQ样点中占主导的是Betaproteobacteria，DGJ中则是Betaproteobacteria与Alphaproteobacteria各占一定丰度，而TC样点中则存在较多的未鉴定纲，Gammaproteobacteria虽在大部分样点中也具有一定占比但比重较小，最高在DGQ-3样点中占比13.63%，平均2.55%，Gammaproteobacteria的弱势加上TC样点未鉴定纲的存在，表明研究地区有极大潜力分离出与前人研究不同的微生物，存在一定新颖性。
3.2 环境因素与空间因素对微生物群落的影响 3.2.1 环境因素对微生物群落的影响环境因子对微生物群落的影响非常大，光强、温度、pH值、DOC和硫化物等都会影响热泉中的微生物群落结构。温度是其中的关键因子，温度低于微生物的生长下限，菌株的生长会受到抑制，高于上限则会导致菌株的死亡或休眠[42, 44, 47–49]。从图 3中可以看到，温度对arxA微生物的ASV数就表现出了显著负相关性(P < 0.001)。除此之外，由于TC各样点之间温度差异较大，这或许可以解释该地区优势种群的差异；同时，Chloroflexi作为热泉环境中比较典型的一类菌，在LL03、GMQ与DGQ-3中丰度较低，Wang等[48]在研究中发现，Chloroflexi在热泉中的耐受温度在72–75 ℃，以上三者环境温度均高出了这个界限，Chloroflexi相对丰对较高的样点，比如DGJ1-2、DGJ13等，大多位于低温度(43–55 ℃)，这也是温度对丰度的又一典型影响。从图 2中可以看出，沉积物微生物中对温度表现出较强相关性的Acidobacteriia、Acetothermiia、Oxyphotobacteria与Thermodesulfovibrionia等纲，在arxA基因微生物中都鲜有丰度，而以Betaproteobacteria为主的arxA微生物则并未对温度表现出明显的相关性。
pH往往对微生物群落的影响巨大，可以通过影响微生物的细胞凋亡[50]、环境中离子浓度[51]以及细胞膜的完整性[52]等来影响微生物群落组成。从图 2与图 3中可以看出，不管是主要丰度微生物还是微生物的α多样性指数，都鲜有内容与pH具有相关性，推测其原因可能是所研究的22个样点pH大多位于7.5–9.0之间，pH的差异相对较小，故微生物与之响应较弱。除此之外，pH并不是直接影响微生物群落结构，而是一个综合指标，由所溶解离子成分等指标共同决定[53]，可以看出，Proteobacteria门下微生物不论是在对沉积物微生物的Pearson分析中还是对arxA基因微生物的分析中都对pH不具有相关性。在前人的研究中，近中性(7.2 < pH < 9.4)的环境条件下，Crenarchaeota与Aquificae的丰度会增加[54]，在本研究中pH值范围与之相符，Aquificae得到了印证，有6个样点占比超过25%，平均占比13.39%，为优势菌群之一；Crenarchaeota虽在GMQ (22.3%)与LL03 (61.4%)样点中存在较高丰度，但在其他样点丰度相对较低，故pH虽对本实验中微生物相关性较弱，但一定程度上决定着优势菌群。值得一提的是，在前人对腾冲热泉的研究中[43]，Crenarchaeota对于温度的响应是在中温(59–77 ℃)条件下丰度最高，这与本研究结果也有出入，此上种种，表明温度或pH值均并非唯一决定微生物多样性特征的环境因素。
除却温度与pH值的影响外，从图 3 arxA功能基因微生物α多样性指数的Pearson相关性分析结果中可以看出TDS对其的影响非常与大，与所有指标均具有相关性；同时图 2表明TDS对沉积物与arxA基因主要丰度微生物的相关性也非常显著。TDS为水中总溶解性固体，反映了可溶性化学组分的浓度，离子浓度直接影响了微生物的生长，故对微生物群落的影响较大。最后，从arxA基因α多样性指标数据中可以看出，DGJ地区微生物种群ASV数明显高于DGQ与TC，结合三地砷浓度梯度变化的特点，可以推测出，砷浓度会影响微生物的多样性特征，砷浓度过高或过低均会一定程度上降低arxA基因微生物的多样性。
3.2.2 空间因素对微生物群落的影响空间因素对微生物群落的影响也不可忽视，诸多学者已验证空间因素对微生物群落影响的重要性[55–56]。作为一种综合因子，其与微生物种群多样性的响应是多种因素共同作用的结果。本研究中，DGQ与DGJ样点地理位置上多为集群分布，空间因素差异小，TC样点相对分散，差异大，这一点也在CCA分析中得到了印证，可以看出，TC样点分布较为分散，另外二者非常集中。从表 1中可以看出，三地海拔存在着明显的差异，3个采样点之间距离相距较远，存在着地理隔离。不同隔离地区微生物群落多样性会存在一定差异，例如，目级别以下，TC地区微生物未鉴定种群丰度明显增多，其次TC地区样点Proteobacteria的丰度也要低于另外二者。VPA结果表明，环境因子对微生物群落组成的解释量要大于空间因子，但二者共有解释量要明显大于二者单独解释量，可以推测出，空间因子的变化，造成了环境因子的变化，进而二者共同影响微生物种群多样性。最后，从CCA分析结果中可以看出，不同因子对沉积物微生物与arxA基因微生物种群多样性的影响较为相似，且以Proteobacteria为主的arxA基因微生物在总的沉积物微生物中占了不小的比例，故砷氧化过程很有可能是研究区热泉环境的重要生物地球化学过程之一。
4 结论(1) 不同砷含量的滇藏地区典型热泉沉积物中微生物主要由Chloroflexi、Deinococcus-Thermus、Aquificae、Proteobacteria、Acetothermia等门类组成，且不同采样点优势菌门有所差异，TC样点彼此之间差异也较大，沉积物微生物中所含arxA基因微生物主要由Proteobacteria 组成；
(2) 不同砷含量的滇藏地区典型热泉微生物群落分布特征受环境与空间因子共同作用影响，环境因子影响要大于空间因子，影响微生物群落分布的主要环境因子为海拔、温度、pH值、TDS与砷浓度等，但其中arxA基因微生物对pH值无明显相关性。
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