冷泉(cold seep)是指富含大量甲烷等碳氢化合物的流体从深部向海底沉积物表面渗漏或喷发形成的地质构造，多分布于大陆架边缘和板块交界处^[1]，是典型的化能合成生态系统。目前已在全球发现数百个冷泉^[2]，其中在我国南海的神狐、台西南和琼东南等海域均有发现^[3]。冷泉生态系统因其特殊性(不依赖表层光合系统)以及富含有大量的温室气体甲烷，从20世纪80年代被发现以来一直是研究的热点区域^[4]。在冷泉沉积物中具有高丰度且不同功能的化能自养型微生物群落^[5]，它们驱动着冷泉内的碳、氮、硫元素循环过程。其中最主要的是甲烷厌氧氧化过程(anaerobic oxidation of methane，AOM)和伴随同时进行的硫酸盐还原过程(sulfate reduction，SR)，由厌氧甲烷氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea，ANME)和硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)共同完成，ANME通常与SRB类群形成共生体(consortia)，进而参与碳和硫元素循环，可消耗掉来自海洋沉积物中超过90%的甲烷^[6]，是天然的甲烷屏障。

相较于海洋中普通沉积物环境，冷泉内微生物群落结构的多样性相对较低，主要为参与甲烷代谢的微生物类群^[7]。通过对分布于全球的23个冷泉沉积物微生物多样性的汇总研究，发现冷泉中的主要代表性类群包括厌氧甲烷氧化古菌ANME、好氧甲烷代谢细菌(methylococcales)、硫酸盐还原菌SRB和硫氧化菌SOB (sulfur-oxidizing bacteria，SOB)^[8]。虽然冷泉内微生物类群在其他环境中也有发现，但丰度却明显高于热液和沿岸沉积物等其他环境^[6]。此外，各冷泉位点的主要微生物类群仍存在差异^[9]，例如在墨西哥湾位点，ANME-1b是主要微生物类群并主要分布在沉积物中的甲烷-硫酸盐带交界处^[10]；在甲烷浓度较高的水合物脊区，主要微生物类群是ANME-2和Desulfosarcina-Desulfococcus类群^[11]；在黑海沉积物菌席区，主要类群是ANME-1a和ANME-1b^[8]。对冷泉微生物分布特征的相关研究也在不断完善，早期研究曾认为水深等地理分布条件的差异是影响冷泉微生物分布的重要因素^[12]。但对主要微生物类群例如SRB分布的研究发现，其分布与甲烷和硫酸根离子的通量有关^[13]，随着研究范围和样本数量的扩大，在新西兰附近冷泉的研究显示电子受体，尤其是氧气的可利用性是影响微生物多样性的主要驱动因子^[14]；在地中海冷泉的研究则发现，不同位点的甲烷和硫酸盐浓度差异通过影响主要微生物过程影响了微生物的分布^[15]；同时还发现，其他的微生物类群如Chloroflexi也会随主要类群一同相应环境因子的变化^[16]。通过对全球范围内的研究结果显示，原位的环境差异，例如沉积物深度和不同的可利用电子受体造成了不同冷泉间微生物的分布差异^[8]，这也是目前较为认可的结论。但冷泉是复杂且异质性很强的生态系统，冷泉内存在有菌席区、碳酸盐岩区等不同的生境，环境因子存在差异，这些生境中微生物群落的多样性和分布可能存在差异，研究不同生境的微生物多样性和分布，可以在已有的全球范围内冷泉微生物类群和分布的宏观认识的基础上，进行有力的补充和完善。

Formosa冷泉位于南海北部陆坡，是南海目前仍然活跃的2个冷泉之一^[17]，早前对该冷泉位点的多样性分析的结果表明，Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi是细菌的主要类群，Euryarchaeota和Crenarchaeota是古菌的主要类群^[18]。Formosa冷泉内有菌席区、贻贝区、碳酸盐岩区等多种环境条件不同的生境^[19]，通过早期对Formosa冷泉的地质勘查，发现冷泉内部存在菌席区以及被贻贝或碳酸盐岩石覆盖的大片区域^{[18, 20]}，生境类型多样。

为了探究微生物在Formosa冷泉不同生境间的分布差异情况，本研究选取了在Formosa冷泉菌席和碳酸盐岩区采集的插管柱状沉积物样本，进行16S rRNA基因扩增子高通量测序和古菌、细菌16S rRNA基因以及主要功能基因的定量实验，结合甲烷、硫酸盐等主要环境因子的测定结果，尝试回答以下科学问题：(1)冷泉区内部不同生境微生物分布规律是什么？主要的功能微生物类群(如ANME)是否具有分布差异？(2) 影响和控制微生物类群分布的主要环境因子有哪些？

1 材料与方法 1.1 样本的采集和地球化学参数测定

本研究样本于2020年5月–6月采集自台西南盆地Formosa冷泉区域，由“科学”号科考船搭载的“发现”号ROV (remote operated vehicle)采集了4根插管柱状沉积物样本。取样点涵盖了冷泉内的主要生境，包括菌席区、碳酸盐岩区沉积物，以及冷泉外部(无甲烷渗漏区)沉积物。其中菌席区取样点包括黑色菌席和白色菌席覆盖的区域，菌席区可观察到甲烷气泡冒出且样本具有刺激性气味(硫化氢气体挥发)，根据测得的甲烷浓度变化范围大小，将黑色菌席区命名为高甲烷浓度菌席区(mat with high methane concentration，Mat_HM)，白色菌席区命名为低甲烷浓度菌席区(mat with low methane concentration，Mat_LM)。碳酸盐岩区取样点(carbonate)有大块的碳酸盐，且无甲烷渗漏。最后在无甲烷渗漏区域(control)采集了1根插管柱状沉积物样本，作为对照(样品信息见表 1)。

沉积物样本回收到甲板后，在实验室按照2 cm一层进行分样。沉积物中甲烷浓度的测定，使用切除顶端的5 mL注射器，取2 mL沉积物注入含有3 mL 2 mol/L氢氧化钠的顶空瓶中，用橡胶塞和铝盖加固进行密封，常温保存。孔隙水样品按照2 cm间隔用Rhizon (Rhizosphere，Holland)进行抽取，取1 mL孔隙水加入含有1 mL 20%醋酸锌溶液的试剂瓶中，4 ℃保存进行后续的定量检测；取5 mL孔隙水，–20 ℃保存用于后续阴阳离子的检测；取5 mL孔隙水，用注射器加入至提前用氮气吹扫的顶空瓶中，加铝盖密封后–20 ℃保存用于溶解无机碳(dissolved inorganic carbon，DIC)的测定。

在船上低温冷库中，用切除顶端的5 mL注射器，按照划定的层位抽取沉积物样本装入15 mL离心管，置于液氮罐中保存，航次结束后用干冰运输回实验室，转移至–80 ℃超低温冰箱保存，用于后续DNA提取实验。

1.2 环境因子测定

沉积物中甲烷浓度的检测是从样品瓶中抽取500 µL顶空至装有HayeSep色谱柱和火焰电离检测器(FID)的SRI气相色谱仪中完成。SO₄^2–离子浓度由Dionex ICS-900离子色谱仪测定，SO₄^2–浓度测定前用超纯水进行500倍稀释，4.5 mmol/L Na₂CO₃和0.8 mmol/L NaHCO₃混合溶液与11 mmol/L硫酸作为SO₄^2–的洗脱液，Ion Pac AS23-type柱用于阴离子检测^[21]，测试精度±2%。NH₄⁺离子的测定采用靛酚蓝法^[22]，由Unico V1850型可见分光光度计测定。取1 mL孔隙水样品中加入0.05 mL苯酚-硝普钠溶液和0.05 mL NaClO碱性溶液，混匀后反应1 h，于630 nm波长处进行比色测定，测试精度为±1.8%。DIC和DIC-δ¹³C值的检测通过IsoPrime 100连续流动比同位素质谱仪(CF-IRMS)测定，事先用0.5 mL孔隙水样本与纯磷酸在40 ℃下反应5 h收集产生的二氧化碳^[21]，DIC浓度的测试精度优于2%，DIC-δ¹³C值为VPDB标准，精度优于0.1‰。硫化氢的检测方法为哈希法^[23]，硫化氢在用醋酸锌溶液固定为沉淀后与显色剂甲基蓝反应显蓝色，样本测定前用超纯水稀释100倍，取1 mL于比色皿用DR 5000分光光度计在670 nm测定样本光长进行标定。

1.3 环境DNA提取和16S rRNA基因扩增

本实验中所有样本环境DNA的提取均采用Power Soil Kit试剂盒(MoBio Laboratories)进行提取，有以下改进：(1) 取0.25–0.30 g沉积物样品，装入装有玻璃砂的离心管，加入试剂盒中的C1试剂，先在涡旋仪上振荡1 min，档位设置为5档。增加这一步骤的主要目的是将沉积物和试剂溶液充分混合。(2) 放入细胞破碎仪中对细胞进行打碎，频率为70 Hz，运行时间为30 s，运行3次，每次间隔120 s。目的是将沉积物中的细胞充分破碎，使细胞中的DNA释放到溶液中便于后续的分离与收集。

对细菌和古菌16S rRNA基因进行PCR扩增，引物是扩增16S rRNA基因V4区通用引物，选用5′端带有特异识别序列(barcode)的515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)^[24]，PCR体系(50 µL)为：10×ExTaq buffer (Mg²⁺ plus) 5 µL，25 mg/mL的BSA溶液5 µL，2.5 mmol/L dNTPs mixture 4 µL，5 U/µL ExTaq酶(TaKaRa) 0.5 µL，10 µmol/L引物各1.5 µL，DNA模板2 µL，去离子水30.5 µL。PCR条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 7 min。其中每个样本设置3组平行重复。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(110 V电压，40 min)和Qubit荧光计进行质量和浓度检测合格后，通过胶回收试剂盒Gel Extraction Kit (Omega)对电泳结果回收并纯化。纯化后的目的片段PCR产物送至派森诺生物公司，质检合格后建库，利用NovaSeq (pair-end 2×250 bp)平台进高通量测序。

1.4 16S rRNA基因和功能基因定量检测

对古菌16S rRNA基因进行扩增，引物为Arch21F (5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′)和Arch958R (5′-YCCGCGTTGAMTCCAATT-3′)^[25]；对细菌的16S rRNA基因进行扩增，引物为Bac27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和Bac1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)^[26]；对甲烷代谢菌关键基因mcrA进行扩增，引物为mlas (5′-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3′)和mcrA rev (5′-CGTTCATBGCGTAGTTVGGR TAGT-3′)^[27]；对硫酸盐还原菌关键基因dsrA进行扩增，引物为dsr-1F (5′-ACSCAYTGGAARC ACG-3′)和dsr-4F (5′-GTGTARCAGTTDCCRC A-3′)^[28]；对甲烷好氧氧化关键基因pmoA基因进行扩增，引物为A189F (5′-GGNGACTGGG ACTTCTGG-3′)和mb661R (5′-CCGGMGCAAC GTCYTTACC-3′)^[29]；对产物进行纯化，转移到移到Escherichia coli的DH5α感受态细胞中，以氨苄青霉素(100 μg/mL)抗性和菌落PCR筛选阳性克隆子，用质粒提取试剂盒(Omega)回收阳性克隆质粒，去离子水梯度稀释后作为后续qPCR反应的标准曲线。

qPCR的体系如下：SYBR^® Premix ExTaq^TM Ⅱ (TaKaRa) 10 μL，ROX Ⅰ 0.4 μL，扩增目的片段所用的引物[古菌Uni519F (5′-CAGCMG CCGCGGTAA-3′)/Arch908R (5′-CCCGCCAATT CCTTTAAGTT-3′)^[30]，细菌Bac341F (5′-CCTA CGGGAGGCAGCAG-3′)/Bac519R (5′-GWATT ACCGCGGCKGCTG-3′)^[31]，mcrA基因mlas/ mcrA-rev^[27]，dsrA基因dsrF (5′-ACSCACTGGA AGCACGGCGG-3′)/dsrR (5′-GTGGMRCCGTG CAKRTTGG-3′)^[28]，pmoA基因A189F/mb661R^[29]]各1 μL，加入1 μL原始DNA，用去离子水补至20 μL。PCR的扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。其中退火温度：古菌为60 ℃，细菌为56 ℃，mcrA基因为55 ℃，dsrA基因为59 ℃，pmoA基因为55 ℃。最后得到的标准曲线相关系数R²在0.99以上，扩增效率为90%–110%。

1.5 测序结果处理和统计分析

利用利用QIIME2 (2020.11)^[32]的cutadapt插件，对合格的双端测序文件通过特异性序列(barcode)对序列进行拆分(demultiplexing)，同时去除序列中的引物、barcode和adapter序列，利用DADA2插件去除嵌合体序列，得到以ASV (amplicon sequence variants)为单元的特征表以及ASV序列，对29个样本序列数进行归一化(本研究中测序深度选为所有样本中序列数最低值34 628)。依据16S rRNA数据库SILVA138，使用classifier-sklearn插件进行物种注释。利用feature-table插件的filter-seqs方法将代表序列过滤为只包含古菌和细菌的序列，并分别绘制古菌和细菌类群的相对丰度柱状图。利用ASV表后续在R软件(https://www.r-project.org/)上进行相关的α多样性和β多样性分析，样本的α多样性用Richness指数、Shannnon指数和Simpson指数来评估，分析使用“vegan”^[33]和“picante”^[34]程序包完成；样本的β多样性水平用“vegan”程序包的“vegdist”函数^[32]计算Bray-Curtis距离矩阵，并使用“vegan”^[33]和“ape”^[35]程序包进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)评估。多因素分析采用RDA (redundancy analysis)分析方法，使用“vegan”程序包“dbrda”函数^[33]计算环境因子与样本微生物多样性Bray-Curtis距离的相关性，环境因子矩阵的变量包括甲烷浓度、硫酸根离子浓度、硫化氢浓度、铵根离子浓度和溶解无机碳(DIC)浓度，用“car”程序包的“vif”函数^[36]检查确保了环境变量之间不存在共线性，对环境因子矩阵进行了标准化(z-scoring)处理。

2 结果与分析 2.1 环境因子测定与16S rRNA基因和功能基因的丰度定量

对照区D239的样本均未检测到甲烷浓度，硫酸盐浓度保持在20 mmol/L左右，随深度无明显变化趋势且未检测到硫化氢浓度。铵根离子浓度范围是40–160 μmol/L，随沉积物深度先增加后减少，在6cmbsf处发生转变。DIC浓度为5–10 mmol/L，DIC的δ¹³C值变化范围是–10‰––15‰，DIC浓度和同位素分馏比随沉积物深度增加无明显变化趋势(图 1)。黑色菌席区的样本D231-4甲烷浓度随深度呈现先增加后减少的趋势，在6 cmbsf处甲烷浓度达到最大值6 mmol/L，在10 cmbsf深处迅速降低；硫酸盐浓度变化随深度增加呈现递减趋势，从2 cmbsf处的9 mmol/L递减到8 cmbsf处消耗殆尽，且硫化氢浓度随沉积物深度增加，在8 cmbsf处达到最大值约15 mmol/L。铵根离子浓度随深度增加呈现递减趋势，变化范围为20–120 μmol/L。DIC浓度基本维持在20 mmol/L，DIC的δ¹³C值范围为–20‰––30‰ (图 1)。白色菌席区样本D244-1同样能检测甲烷浓度随沉积物深度增加呈现先增加后减少的趋势，在沉积物6 cmbsf处达到最大值约2 mmol/L，明显低于黑色菌席区；硫酸盐浓度随深度增加而明显降低，从表层的3 mmol/L到8 cmbsf处降到接近于0，硫化氢浓度则随深度增加而先增加后减少，在8 cmbsf处浓度最高达到18 mmol/L，但8 cmbsf以下虽然未检测到硫酸盐浓度，但仍能检测到10 mmol/L左右的硫化氢浓度。铵根离子浓度随深度增加递减，浓度变化范围为20–200 μmol/L。DIC浓度维持在20 mmol/L，DIC的δ¹³C值变化范围为–25‰––30‰，随深度增加而降低(图 1)。碳酸盐岩区样本D244-3未检测到甲烷浓度和硫化氢浓度，且硫酸盐浓度稳定在25 mmol/L左右，随深度无明显变化，该结果与对照区结果接近。铵根离子浓度的变化范围为50–100 μmol/L，随深度增加而增加。DIC浓度低于10 mmol/L，且DIC的δ¹³C值范围为–15‰––20‰ (图 1)。

基于对古菌和细菌细胞内16S rRNA基因拷贝数的研究(古菌单个细胞内平均16S rRNA基因拷贝数为1.7，细菌则为4.7)^[37]，我们将细菌和古菌的16S rRNA基因定量结果转化为了细胞数目，单位为cells/g (湿重)。对照区古菌细胞数变化范围为5×10⁸–3×10⁹ cells/g，细菌细胞数则均少于1×10⁹ cells/g，细菌和古菌细胞数均随沉积物深度增加而递减，在沉积物表层古菌细胞数是细菌的2–3倍，但8 cm以下层位二者细胞数接近(图 2)。黑色菌席区细菌和古菌的生物量约为10⁹–10¹⁰ cells/g (湿重)，是对照区的10倍，且细菌细胞数是古菌细胞数的2–3倍，二者细胞数均随深度减少；mcrA基因拷贝数为10⁹–10¹⁰ copies/g (湿重)，在SMTZ层(8 cmbsf附近)丰度达到最大值。dsrA基因拷贝数为10⁸–10⁹ copies/g (湿重)，随深度增加拷贝数减少。pmoA基因拷贝数为10⁷–10⁸ copies/g (湿重)，表层沉积物中丰度最高。各层位古菌、细菌的细胞数以及功能基因的拷贝数均明显高于对照区的定量结果(图 2)。白色菌席区细菌和古菌的生物量约为10⁹–10¹⁰ cells/g (湿重)，表层沉积物中细菌细胞数明显大于古菌，但细胞数均随深度增加而递减，且二者细胞数接近；mcrA基因拷贝数为10⁹–10¹⁰ copies/g (湿重)，且丰度随深度增加而增加；dsrA基因拷贝数为10⁸–10⁹ copies/g (湿重)，丰度随深度增加而递减；pmoA基因拷贝数为10⁷–10⁸ copies/g (湿重)，与黑色菌席区的定量结果接近，微生物细胞数和功能基因定量结果均明显高于对照区的定量结果(图 2)。碳酸盐岩区细菌和古菌的生物量约为10⁹ cells/g (湿重)略低于菌席区，但mcrA基因拷贝数[10⁹ copies/g (湿重)]、dsrA基因拷贝数[10⁸ copies/g (湿重)]和pmoA基因拷贝数[10⁷ copies/g (湿重)]均明显高于对照区(图 2)。

2.2 不同生境微生物多样性

测序样本共计29个，其中非冷泉对照区(编号D239-1) 8个，冷泉黑色菌席区(编号D231-4) 9个，冷泉白色菌席区(编号D244-1) 9个，冷泉碳酸盐岩区(编号D244-3) 3个。合格总序列为2 143 394条，去除嵌合体后测序Reads总量2 057 378条，占比为85.56%–97.41% (表 2)，其中古菌358 481条，划分为875个ASV；细菌1 701 519条，划分为4 674个ASV。

对于包括古菌和细菌在内的群落整体水平，我们基于Richness指数、Shannon指数和Simpson指数比较样本α多样性(图 3)。根据Richness指数，对照区(control)的丰富度最低，白色菌席区(Mat_LM)微生物丰富度最高，整体上与对照区相比冷泉沉积物有较高微生物丰富度；Shannon指数和Simpson指数的计算结果则显示，对照区与其他位点的样本有显著差异，微生物类群多样化程度最高的是对照区(control)，最低的是碳酸盐岩区(carbonate)，α多样性呈现对照区 > 白色菌席区 > 黑色菌席区 > 碳酸盐岩区的趋势。

不同生境微生物类群相对丰度如图 4所示，从古菌组成来看，黑色菌席区(D231-4)主要的古菌类群是ANME，且具有如下的变化趋势：在表层和次表层硫酸盐浓度较高的环境，ANME-2a/b和ANME-2c是主要类群，分别占古菌类群的30%和20%左右；相对丰度随深度增加递减；ANME-1b则相对丰度随深度增加而增加，在底层硫酸盐耗尽的环境中成为优势古菌物种，占古菌整体百分比超过50%；细菌类群则主要是参与硫氧化的Campylobacteria类群和参与硫酸盐还原的Desulfobacterota类群，这2类微生物在各沉积物各个层位的相对丰度均超过了20%；Gammaproteobacteria类群同样丰度较高且主要集中于浅层沉积物，占细菌类群的10%左右。

在白色菌席区(D244-1)，ANME-2a/b是优势古菌类群，且相对丰度随深度增加而增加，最高占古菌类群百分比超过50%；ANME-2c相对丰度变化随深度变化较小，相对丰度在5%左右，而ANME-1b和Woesearchaeales类群则主要分布在表层和次表层，底层沉积物中则有少量产甲烷菌Methanococcoides的存在；在表层发现Gammaproteobacteria的相对丰度超过30%，而主要的细菌优势种还是Desulfobacterota和Campylobacteria，其中Desulfobacterota类群相对随深度有明显增加趋势，最高占细菌类群百分比达到50%，而Campylobacteria相对丰度维持在10%左右。

碳酸盐岩石区(D244-3)的优势古菌类群是ANME-1b，在次表层相对丰度可达到70%，表层有高丰度的Woesearchaeales，而底层则是ANME-2a/b丰度最高，占古菌百分比在30%左右；细菌主要类群中Campylobacteria相对丰度随深度增加而增大，从10%增加到25%左右，Desulfobacterota和Gammaproteobacteria的相对丰度则随深度增加而递减。

对照区(D239)无甲烷、硫化氢和硫酸盐浓度的变化，科水平上主要古菌类群是Nitrosopumilaceae，在50%以上的层位所占比例能够达到70%以上，在底层主要的古菌类群则是Woesearchaeales，占古菌相对丰度为30%–50%，未发现ANME类群；细菌则主要由Planctomycetota和Proteobacteria组成，Planctomycetota占细菌相对丰度随深度增加而增加，最高达到20%；Proteobacteria相对丰度随深度增加而递减，最高超过30%，Proteobacteria中的主要亚群是Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria。

2.3 不同生境间微生物群落结构差异分析

群落的β多样性反映比较不同样品中微生物群落组成的差异。本研究基于Bray-Curtis距离对4种不同生境样本进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，所有样本沿水平方向聚集为2簇(PERMANOVA检验R²=0.58，P=0.001)，如图 5所示，冷泉区样本聚集在左侧，右侧是对照区样本，水平坐标轴对样本间整体差异贡献了55.17%的解释度。在冷泉样本中，不同生境样本沿垂直方向分布，黑色菌席区单独聚为一簇，而白色菌席区与碳酸盐岩区无显著差别，纵坐标轴贡献了12.77%的解释度。划分的3个聚类单元分别是黑色菌席区、白色菌席区和碳酸盐岩区、对照区。不同生境的微生物群落多样性和组成具有明显差异。水平坐标轴贡献55.17%的解释度，而纵坐标轴贡献了12.77%的解释度。

2.4 环境因子与微生物多样性之间的关系

结合原位甲烷、硫酸根离子、铵根离子、硫化氢的浓度变化，基于Bray-Curtis矩阵进行了基于距离矩阵的RDA分析(图 6)。在主要的微生物类群中，ANME各亚群与硫酸根和铵根呈正相关，与甲烷、硫化氢和DIC呈负相关；SRB的SEEP-SRB1、SEEP-SRB2和Desulfatiglans亚群与硫酸根、铵根离子呈正相关，与甲烷、硫化氢和DIC呈负相关；硫氧化菌的Sulfurovum和Sulfurimonas亚群则和甲烷浓度呈正相关，与其他环境因子均呈负相关；Chloflexi的Anaerolineaceae亚群与硫酸根、铵根离子浓度呈正相关，与甲烷、DIC和硫化氢呈负相关；Gammaproteobacteria的Woeseiaceae亚群与硫化氢、甲烷和DIC呈正相关，与硫酸根和铵根离子呈负相关，也是主要类群中唯一和硫化氢呈正相关的类群(表 3)。

第一坐标轴能够解释33.62%的全部变量对不同生境类群的影响，DIC和硫化氢沿第一坐标轴将冷泉区样本和对照区样本分开；第二坐标轴能够解释6.46%全部变量对不同生境类群组成的影响，甲烷、硫酸根和铵根沿第二坐标轴将冷泉区内3种不同生境的样本分开。

3 讨论 3.1 冷泉不同生境间主要微生物类群与分布差异

通过对全球冷泉的综合调查研究，ANME类群是冷泉环境的特征类群之一^[8]，在本研究样本中对照区未发现ANME类群，菌席区和碳酸盐岩区发现的ANME亚群包括ANME-1a、ANME-1b、ANME-2a/b、ANME-2c、ANME-3，且ANME是古菌的最主要类群，同时ANME类群在不同生境间的分布存在差异。黑色菌席区主要的ANME类群是ANME-1b、ANME-2a/b和ANME-2c，随深度增加ANME-1b类群的相对丰度不断增加，在缺乏硫酸盐的底层沉积物中占古菌百分比达到50%–70% (图 4)，这一现象在其他冷泉环境中已有发现^[38–40]，ANME-1之所以在硫酸盐耗尽的底层富集，有研究推测其能够通过甲烷氧化过程的逆反应进行产甲烷过程^[41–43]，还有研究推测其能够在缺乏硫酸盐的环境单独进行甲烷氧化过程^{[42, 44–46]}。白色菌席区主要ANME类群是ANME-2a/b和ANME-2c，且ANME-2a/b亚群的相对丰度随沉积物深度增加而增加，在底层硫酸盐消耗殆尽的环境中占古菌相对丰度仍能达到50% (图 4)，之前的研究得出的结论普遍认为ANME-1主要分布于底层，硫化氢浓度较高的环境，而ANME-2a/b倾向分布于硫酸盐浓度较高的沉积物表层^[44]，上述现象与该结论不完全相符的原因可能是因为存在大型生物扰动造成的表层沉积物掉落现象^[47]。碳酸盐岩的形成与AOM作用有关^[48–49]，在对美国沿岸冷泉位点的碳酸盐岩区微生物类群进行的调查发现，ANME-2是主要的ANME亚群，但ANME-1在测得AOM速率相对较低的样本中相对丰度更高^[50]，本研究中碳酸盐岩区的主要ANME类群是ANME-1b和ANME-2a/b (图 4)，证明ANME类群在AOM速率不同的碳酸盐岩区样本中主要亚群存在差异。已有研究表明ANME-2a/b是不同冷泉间分布最为广泛的ANME类群^[8]，本研究中ANME-2a/b同样在不同生境内都成为ANME类群的优势种。此外之前的研究的主要结果认为冷泉内古菌数量相对较少^[11]，但本研究中例如白色菌席区，古菌数量在沉积物底层可以达到并超过细菌数目，并且在冷泉内尤其是甲烷浓度较高的菌席区，ANME类群是绝对的优势类群，与之前对该冷泉微生物多样性研究的结论存在差异^[18]，结合产甲烷过程和甲烷厌氧氧化过程关键基因mcrA的定量分析结果，mcrA基因拷贝数在冷泉区样本的丰度明显高于外部对照区，整体趋势随深度增加丰度增加，且ANME类群整体相对丰度同样随深度增加而逐渐增加。

SRB类群在冷泉环境中常与ANME类群共生进行AOM作用^[51–52]。对地中海冷泉位点的研究发现SRB类群是细菌的主要类群之一，相对丰度的变化与原位硫酸根的含量显著相关^[16]。SRB类群在对照区占细菌类群的相对丰度 < 5%，并不是主要细菌类群。而对于本研究中冷泉区的生境位点，SRB类群中的Desulfobacterota是细菌的主要类群，且和Campilobacterota中的硫氧化菌类群在绝大部分沉积物样本中相对丰度均在20%以上(图 4)，说明硫循环是冷泉中活跃且重要的元素循环过程，参与硫循环的微生物类群通过直接或间接参与其他微生物过程联系了其他代谢^[53]。同时硫酸盐还原过程关键基因dsrA基因的定量结果显示(图 2)，除了在浅层沉积物中丰度较高外，在深层沉积物中仍能检测到相对高丰度的dsrA基因，但在深层往往难以检测到硫酸盐浓度，对该现象的解释之一是沉积物底层存在铁锰参与的硫氧化过程，但产生的硫酸盐不断被消耗，因此难以被检测到^[54]。近年来对SRB和SOB类群的功能研究不断深入，发现一些SRB类群有固碳、固氮和反硝化的潜能，一些SOB类群能同化乙酸盐和反硝化^{[53, 55]}。本研究中SRB和SOB类群在绝大部分沉积物中是细菌主要类群，且部分环境中硫酸盐被消耗殆尽，推测硫代谢细菌直接或间接参与了其他微生物过程，推测不同生境的环境因子差异可能是激发其不同代谢潜能的关键条件，也说明上述类群的分布并非单一受硫酸盐和硫化氢的影响。

之前研究发现Gammaproteobacteria中有部分甲烷好氧氧化类群^[56–58]，而根据微生物多样性结果，在沉积物浅层样本均可发现较高丰度的上述类群(图 4)，我们同时对甲烷好氧氧化过程的关键基因pmoA进行了定量(图 2)，发现pmoA基因的拷贝数也是表层最高，并随着深度增加递减，且拷贝数显著低于mcrA基因拷贝数，说明浅层沉积物中存在一定浓度的氧气，甲烷好氧氧化细菌可以进行好氧甲烷氧化过程。

3.2 冷泉不同生境间影响微生物分布的环境因子

结合组间检验的结果，冷泉区内菌席区和碳酸盐岩区样本均相对于对照区样本具有更高的丰富度(图 3)，说明微生物种类更多，符合冷泉是“生命绿洲”的认识；结合Shannon和Simpson指数的结果，对照区沉积物多样化程度较高，冷泉区尤其是碳酸盐岩区的多样化程度低，说明在冷泉不同生境内微生物类群由少数几个微生物类群占主导，其中覆盖了大量碳酸盐岩的生境微生物多样化程度最低。

在之前分析影响全球冷泉微生物分布的研究中，发现影响冷泉内微生物分布的环境因子包括：原位温度、甲烷浓度、硫酸盐浓度、沉积物深度和氧化还原电势等因素^{[8, 11, 59]}。对南海另一活跃冷泉海马冷泉的研究结果表明，ANME-1b亚群和DIC呈正相关，与硫酸盐呈负相关；而ANME-2a/b则与硫酸盐呈显著正相关，与DIC呈负相关，得出的结论是ANME-1主要分布于底层，硫化氢浓度较高的环境，而ANME-2a/b倾向分布于硫酸盐浓度较高的沉积物表层^[44]。本研究的RDA多因素分析结果显示，不同生境间的甲烷、DIC、硫化氢、硫酸根和铵根离子与微生物类群的分布显著相关(图 6)，ANOVA检验(表 3)表明甲烷(P < 0.05)、硫酸根离子(P < 0.01)、铵根离子(P < 0.05)、DIC (P < 0.05)和硫化氢(P < 0.01)是与微生物群落显著相关的环境因子。与已有的结论进行对比发现，在冷泉不同生境间，冷泉内富含烷烃和硫化氢的流体对微生物群落的构建具有显著影响，造成了微生物丰富度和多样性上的差异^[9]；但同时不同生境间其中，存在差异的环境因子众多，本研究得出的结论认为不同生境间的微生物群落结构差异与甲烷、硫化氢、硫酸盐以及DIC等众多环境因子显著相关。此外通过对相关环境因子的测定结果，甲烷的有无和变化趋势在不同生境间明显不同(图 1)，其中碳酸盐岩区未检测到甲烷，而在检测到明显甲烷浓度的菌席区，黑色菌席区和白色菌席区的甲烷浓度变化范围也存在高低之分，因此推测在Formosa冷泉不同生境间与微生物分布最显著相关的环境因子是甲烷。

3.3 本研究结果总结

冷泉内具有独特的微生物类群结构，以ANME、SRB和SOB等类群为主要微生物类群^[8]。本研究则发现Formosa冷泉内3种主要生境(黑色菌席区、白色菌席区、碳酸盐岩区)中主要古菌类群为ANME，主要细菌类群为SRB和SOB。

冷泉环境中微生物丰富度较高，但群落结构多样性的Shannon指数较低^[7]。Formosa冷泉内3种主要生境的生物丰富度高于对照区，计算Shannon和Simpson指数发现多样性呈现对照区 > 白色菌席区 > 黑色菌席区 > 碳酸盐岩区的趋势。

在全球水合物区和菌席区等冷泉环境的研究发现，冷泉代表性微生物类群之一的ANME类群的丰度和主要亚群存在差异^[8–10]；之前的研究得出的结论普遍认为ANME-1主要分布于硫化氢浓度较高的环境，而ANME-2a/b倾向分布于硫酸盐浓度较高的沉积物，ANME-2c常在富含水合物的高甲烷环境富集^{[8, 44]}。Formosa冷泉内黑色菌席区主要的ANME类群是ANME-1b、ANME-2a/b和ANME-2c，白色菌席区主要ANME类群是ANME-2a/b和ANME-2c，碳酸盐岩区的主要ANME类群是ANME-1b和ANME-2a/b；且上述生境中mcrA基因的丰度也远高于对照区。

SRB类群在冷泉环境通常与ANME类群形成共生体完成甲烷厌氧氧化-硫酸盐还原过程^[6]，且相对丰度与硫酸盐浓度显著相关^[16]；SOB类群在Formosa冷泉沉积物表层发现具有高丰度^[60]。SRB和SOB类群是Formosa冷泉生境内细菌的主要类群，其中Desulfosarcinaceae占SRB的50%以上，Sulfurovaceae和Sulfurimonadaceae共占SOB的90%以上。dsrA基因在上述生境内的丰度远高于对照区，且SRB和SOB类群在低硫酸盐环境中同样具有较高丰度。

冷泉是强异质性的环境，造成全球不同冷泉位点间微生物群落结构差异的主要影响因子包括沉积物深度^[8]、可利用电子受体(如氧气^{[8, 14]})、甲烷和硫酸盐浓度^[15]等环境条件。Formosa冷泉内3种主要生境间环境条件同样存在异质性，微生物群落结构具有明显差异，且微生物群落结构差异与甲烷、硫化氢、硫酸盐以及DIC等众多环境因子显著相关。

4 结论

本研究通过高通量测序的方法，对台西南冷泉内主要3种生境和外部对照区沉积物中微生物群落组成和结构进行分析，结合对古菌、细菌类群和主要功能基因(mcrA、dsrA)的定量结果，发现Formosa冷泉不同生境中的微生物分布具有显著差异，冷泉内部菌席区主要古菌类是ANME的ANME-2a/b亚群和ANME-1b亚群，细菌类群则以SRB和SOB类群为主；碳酸盐岩区与虽然未检测到甲烷，但与菌席区的主要微生物类群类似，甲烷代谢相关类群具有较高丰度，说明冷泉内部还是以甲烷和硫代谢过程为主。通过多因素分析，确定造成微生物分布差异的是甲烷、硫酸盐和硫化氢等环境因子的联合作用。本研究通过对Formosa冷泉内小尺度上不同生境微生物多样性进行研究，进一步完善和拓展了对冷泉区微生物分布特点和规律的认识。冷泉内不同生境微生物分布的显著性差异也指示在未来的冷泉生态系统研究中，需要更细致关注小尺度生境内主要微生物类群的生态位和功能差异，并综合评估其在冷泉生态系统及地球元素循环中的功能和效应。

致谢

感谢“科学号”科考船相关人员协助采集样品；感谢上海交通大学章陶亮博士、王景博士和梁乐文同学在本文修改过程中提出的宝贵建议。