2022, Vol. 62
表1(Table 1)
山西阳泉老窑水硫酸盐还原菌的分离鉴定及其还原功能驯化
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220281
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 陈秀云, 冯杰, 王红梅, 刘邓, 窦艳芳, 张江华, 马丽媛. 2022
- CHEN Xiuyun, FENG Jie, WANG Hongmei, LIU Deng, DOU Yanfang, ZHANG Jianghua, MA Liyuan.
- 山西阳泉老窑水硫酸盐还原菌的分离鉴定及其还原功能驯化
- Isolation and identification of sulfate-reducing bacteria in goaf water in Yangquan of Shanxi Province and domestication for the reduction
- 微生物学报, 62(6): 2104-2118
- Acta Microbiologica Sinica, 62(6): 2104-2118
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-16
- 修回日期：2022-05-21
- 网络出版日期：2022-05-30
引用本文 |
陈秀云, 冯杰, 王红梅, 刘邓, 窦艳芳, 张江华, 马丽媛. 山西阳泉老窑水硫酸盐还原菌的分离鉴定及其还原功能驯化[J]. 微生物学报, 2022, 62(6): 2104-2118.
Chen Xiuyun, Feng Jie, Wang Hongmei, Liu Deng, Dou Yanfang, Zhang Jianghua, Ma Liyuan. Isolation and identification of sulfate-reducing bacteria in goaf water in Yangquan of Shanxi Province and domestication for the reduction[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(6): 2104-2118.
山西阳泉老窑水硫酸盐还原菌的分离鉴定及其还原功能驯化
1. 中国地质大学(武汉), 环境学院, 湖北 武汉 430074;
2. 阳泉市水利局, 山西 阳泉 045000;
3. 湿地演化与生态恢复湖北省重点实验室, 湖北 武汉 430074
2. 阳泉市水利局, 山西 阳泉 045000;
3. 湿地演化与生态恢复湖北省重点实验室, 湖北 武汉 430074
摘要：[背景] 含硫煤矿开采后，地表水/地下水回流至采空区形成酸性老窑水，含有高浓度重金属离子和硫酸盐，严重危害生态系统健康。利用微生物自身生长处理老窑水具有成本低、环境友好等特点，具有良好的应用前景。目前利用的硫酸盐还原菌大多只在适宜温度和中性pH条件下具有较高活性，在北方低温和酸性条件下难以发挥作用。[目的] 本研究旨在从山西阳泉山底河流域的老窑水环境中分离硫酸盐还原菌，并调节温度和pH进行驯化，从而得到高效耐低温耐酸菌株，为北方老窑水微生物治理提供可用菌种资源。[方法] 对山底河流域典型老窑水样品中的微生物进行富集培养，并筛选硫酸盐还原菌。通过革兰氏染色、扫描电镜对菌株形貌特性进行表征，利用16S rRNA基因序列比对进行菌种鉴定，探究其生长特性和硫酸盐还原性能。在此基础上降低温度和pH，对高效还原硫酸盐菌株进行驯化，探讨其在北方老窑水污染治理中的应用潜力。[结果] 本研究筛选得到2株硫酸盐还原菌，命名为YQ-1和YQ-2，分别属于革兰氏阴性瘤胃解蛋白质菌属(Proteiniclasticum)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)。在30 ℃、pH 7.5条件下，YQ-1和YQ-2对1 100 mg/L硫酸根的还原效率分别为96.75%和75.48%。选取高效菌株YQ-1进行定向驯化，该菌株经低温驯化后，在15 ℃、pH 7.5条件下对硫酸根的去除率为91.49%，比驯化前提高了85.69%；进一步进行低pH驯化后，在15 ℃、pH 4.5条件下对硫酸根的去除率为37.21%，比驯化前提高了34.30%。[结论] 通过驯化培养提高了硫酸盐还原菌YQ-1对低温和低pH环境的耐受性，同时也提高了其在低温和低pH条件下对硫酸根的还原效率，为北方老窑水治理提供了菌种资源和理论依据。
关键词：老窑水 硫酸盐还原菌 单菌株筛选 细菌驯化
Isolation and identification of sulfate-reducing bacteria in goaf water in Yangquan of Shanxi Province and domestication for the reduction
1. School of Environmental Studies, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei, China;
2. Yangquan Water Resources Bureau, Yangquan 045000, Shanxi, China;
3. Hubei Key Laboratory of Wetland Evolution & Ecological Restoration, Wuhan 430074, Hubei, China
2. Yangquan Water Resources Bureau, Yangquan 045000, Shanxi, China;
3. Hubei Key Laboratory of Wetland Evolution & Ecological Restoration, Wuhan 430074, Hubei, China
Abstract: [Background] Surface water/ground water flows back to the goaf of sulfur-containing coal mine, forming the acidic goaf water. The water, with high salinity and sulfate content, threatens ecosystem health. Microorganisms, which feature low cost and environmental protection, has promising prospect of application in the treatment of goaf water. However, the currently available sulfate-reducing bacteria (SRB) are only highly active under suitable temperature and neutral pH, and are intolerant to low temperature and acidic conditions in northern China. [Objective] To isolate SRB from goaf water in Shandi River Basin of Yangquan, Shanxi, and to domesticate them so that they can tolerate the low temperature and acidic condition and be used for the treatment of goaf water in northern China. [Methods] Microorganisms in goaf water sample from Shandi River Basin were enriched and SRB were isolated. Then the SRB were characterized by Gram staining and scanning electron microscopy and identified based on 16S rRNA sequence alignment. Their growth characteristics and sulfate-reducing capacity were also investigated. On this basis, temperature and pH were lowered to domesticate the efficient SRB, thereby exploring their potential in the treatment of goaf water. [Results] Two strains of SRB, YQ-1 and YQ-2, were isolated, belonging to the Gram-negative Proteiniclasticum and Desulfovibrio, respectively. At 30 ℃ and pH 7.5, YQ-1 and YQ-2 reduced 96.75% and 75.48% of the 1 100 mg/L sulfate, respectively. The highly efficient strain YQ-1 was selected for domestication at low temperature and pH. The sulfate removal rate of the strain was 91.49% at 15 ℃ and pH 7.5 after low-temperature domestication, 85.69% higher than that before domestication. The removal rate was up to 37.21% at 15 ℃ and pH 4.5 after low-pH domestication, which was 34.30% higher than that before domestication. [Conclusion] The tolerance of YQ-1 to low temperature and low pH was improved, and the efficiency of sulfate reduction was also enhanced after domestication. This work provided strain resources and theoretical basis for the treatment of goaf water in northern China.
Keywords:
goaf water sulfate-reducing bacteria single-strain screening bacterial domestication
我国煤矿资源丰富，在促进社会及经济进步的同时，多年开采及煤矿的关停整合，形成大量采空区，采煤活动残留的污染物和采场中的有害物质进入地下水，从而发展成老窑水[1]。北方老窑水酸性高，常年处于低温状态且含有大量的硫酸根和重金属离子，溢出后严重影响地下水和地表水的水体质量[2]。在排放过程中，强酸性老窑水会腐蚀金属管道和井下混凝土设备，造成透水事故[3]。据统计，我国山西省煤矿废水的排水量达到每年2×108 m3[4]，对生态环境及人类健康的影响不容小觑。因此，老窑水污染的防控和治理工作迫在眉睫。近年来，利用微生物作用的生化法处理效率高、二次污染少，得到了越来越广泛的应用，其中如何提高硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)对硫酸盐的还原效率是该领域的卡脖子难题。
SRB是一类单细胞原核生物，无色，单级鞭毛运动，通过异化作用将硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等含硫氧化物作为有机物的电子受体还原为硫化氢[5]，在硫元素的地球化学元素循环中扮演重要角色。SRB地理分布广泛，在海洋沉积物[6]、火山口[7]、矿山废水排水口[8]、盐碱地[9]、淡水沉积物[10]、植物根际[11]和污水处理厂[12]等均得到了检测与分离，存在于温度−13−85 ℃范围内[13−14]。SRB通过调节代谢进行自我保护[15]，氧化有机物作为营养源，产生的硫化氢能够与水中溶解态的金属离子反应生成硫化物沉淀，并通过释放电子来产生碱度，从而提高pH值[16]。目前，利用SRB治理老窑水在理论和实验室阶段取得一定进展，利用污水净化厂中的SRB对老窑水进行治理，体系中2 000 mg/L硫酸盐的最大去除率达到64.75%。但是在自然修复中由于生长条件的限制，SRB对老窑水的治理效果并不显著[17]，尤其是在低温低pH环境下，SRB还原能力减弱，甚至不发生还原反应[18]。因此，提高SRB在低温低pH条件下的还原效率是目前亟待解决的问题。
本研究从山西阳泉山底河流域的典型老窑水环境中分离出2株SRB，结合扫描电镜及测序手段鉴定其形态特征、分类地位及生长特性。设定温度和pH梯度逐步驯化培养，旨在获得耐低温和耐酸性的菌株，为老窑水处理工艺研究提供原位修复的菌种资源。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂本研究围绕山底河流域水系及附近支系展开，于2019年11月在老窑水出水点附近进行布点取样，分别采集山底河河水(S)及对应底泥样品(D)各4份。水体样品的采集深度为5–15 cm，采集量为5 L，利用HQ40D便携式多参数仪(Hach Company)对水样pH进行原位值测量，底泥样品用无菌离心管采集，样品量约为50 g。样品采集完成低温运回实验室，保存于4 ℃。一部分样品用于SRB的富集培养，另一部分用于理化因子的测定。水体样品经0.22 μm滤膜过滤，利用离子色谱(ICS-600，Thermo)和ICP-OES (iCAP 7600+，Thermo)测定阴离子和阳离子含量。其中，各阳离子含量为该金属多种价态含量之和。底泥样品经冷冻干燥机(ALPHA 1-2ld)冷冻干燥，去除水分后进行研磨。研磨后的样品与超纯水以1:5的比例混合，使用振荡器(Vortex-Genie®2，QIAGEN)连续振荡5 min，以8 500 r/min离心10 min获得上清液。上清液经过0.22 µm滤膜过滤，利用HQ40D便携式多参数仪测定pH，利用离子色谱(ICS-600，Thermo)和ICP-OES (iCAP 7600+，Thermo)测定样品阴离子和阳离子的含量。
采用Postgate’s培养基为生长和富集培养基(g/L)：NaCl 2.0，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.5，NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 2.0，Na2SO4 0.5，K2HPO4 0.5，yeast extract 1.0，20% NaOH溶液调节pH值至7.5。通高纯氮气进行除氧，用高压蒸汽灭菌锅于121 ℃灭菌20 min，待培养基温度降至60 ℃以下，在厌氧手套箱中加入用0.22 μm滤膜过滤除菌的乳酸钠溶液(70%，5 mL/L)。不额外添加硫酸根。
筛选培养基：向液体培养基中加入2% (w)的琼脂，用高纯氮气除氧，于121 ℃灭菌20 min，加入用0.22 μm滤膜过滤除菌的乳酸钠溶液，每支厌氧试管分装4.5 mL培养基制成滚管。
1.2 SRB的分离纯化选取硫酸根含量最高的水体和底泥样品各一份进行SRB单菌株的分离纯化。取5 g底泥样品，加入45 mL无菌水进行稀释使总质量为50 g，混合均匀制成悬液，再以1:10的体积比分别将悬液和采集的水体样品接入含有40 mL的富集培养基的血清瓶中。接种完成于30 ℃的生化培养箱中静置培养，当培养基完全变黑，表面产生气泡，同时瓶口散发臭鸡蛋气味时，说明SRB已大量繁殖，采用Hungate’s滚管法筛选SRB单菌落[19]。利用血细胞计数法检测富集菌液的细胞浓度，以无氧生理盐水进行梯度稀释，取0.1 mL细菌浓度为10−2、10−1、100的菌液分别接种至厌氧管中，于30 ℃恒温培养箱倒置培养。观察到单菌落形成后，挑选沿试管管壁分布稀疏且靠近管口的菌落接种。在厌氧手套箱中缓慢打开厌氧管的管帽和橡胶塞，同时向试管内通入高纯氮气，用无菌毛细管将挑到的菌落快速接入液体培养基中，于30 ℃恒温培养箱培养。重复上述接种和培养步骤，直至获得SRB纯菌株。
1.3 SRB的鉴定 1.3.1 形态学观察菌株在厌氧固体培养基中生长后，观察并记录菌落的形状、边缘、透明度和颜色等特征。在培养中和培养结束时分别取样涂片，进行革兰氏染色，判断菌株性质。取生长稳定期的菌液，用浓度为2.5%的戊二醇固定60 min，利用扫描电子显微镜(日本日立公司，SU8010)观察菌株形貌特征。
1.3.2 分子生物学鉴定采用裂解法提取菌株DNA，取1 mL菌液12 000 r/min离心3 min取其沉淀，加入50 μL lysis buffer，在72 ℃条件下水浴10 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液进行16S rRNA基因的扩增，引物为27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3′)。PCR反应体系为Ex Taq缓冲液25 μL，27F正向引物1.0 μL，1492R反向引物1.0 μL，ddH2O 18 μL，DNA 5 μL。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。
将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，基于序列比对结果选取相近菌株16S rRNA基因序列，使用最大似然法在MEGA 11软件上构建系统发育树，自展重复值设为1 000。测序数据已上传至NCBI，登录号为：SUB11308026。菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，YQ-1和YQ-2的保藏编号分别为：CCTCC AB 2022130和CCTCC AB 2022129。
1.4 SRB的生长特性及不同温度和pH条件下的还原性能测定 1.4.1 菌株生长特性实验组：在250 mL血清瓶中，加入200 mL硫酸根浓度为1 100 mg/L的Postgate’s培养基，接入2 mL筛选得到的纯菌株菌液。
对照组：用等量的Postgate’s液体培养基替代，不接种菌液。
实验组和对照组各设置3个重复，封口后放入30 ℃的生化培养箱中静置培养，定期取样测定细胞数量、pH、ORP (oxidation-reduction potential)和硫酸根含量。利用血细胞计数板在显微镜下测定细胞数量。取洁净的血球计数板一块，用移液器吸取6.8 μL摇匀的菌液滴入计数区中央，倾斜盖上盖玻片避免气泡产生，静置片刻进行计数。使用HQ40D便携式多参数仪测量pH和ORP值。采用硫酸钡浊度比色法测定样品中的硫酸根含量。酸性条件下，硫酸根与钡离子反应形成硫酸钡沉淀，在420 nm波长下有最大吸收峰，使用酶标仪(Epoch，BioTek)测定其吸光度，根据标准曲线计算硫酸根含量。
1.4.2 不同温度和pH条件下菌株的还原性能采用Postgate’s培养基在不同温度和不同pH条件下对SRB单菌株进行培养，探究菌株还原性能。根据山底河流域全年的平均温度(10.1 ℃)[20]，设置培养温度为30 ℃、25 ℃和15 ℃。培养基初始pH调至7.5接入纯菌株菌液，于不同温度培养箱中静置培养。根据样品的平均pH值(4.77)，设置初始pH为7.5、6.5、5.5和4.5。培养基初始pH调节至不同的梯度，于30 ℃培养箱中恒温培养。上述培养过程各设置3个重复，定期取样测定硫酸根含量。
1.5 SRB的驯化 1.5.1 不同温度下对SRB的驯化采用梯度降温的方法对菌株进行低温驯化。将纯菌株接入生长培养基，设置培养温度为30 ℃，当培养基颜色变黑，且醋酸铅试纸条置于瓶口变黑时，以10%的接种比例接种至新的生长培养基中，降低培养温度至25 ℃继续培养。待菌株生长再次接种至新的生长培养基，下调温度至15 ℃继续培养，若菌株活性较低则进行多次接种，直至培养基中出现大量黑色沉淀。低温驯化过程中保持培养基初始pH为7.5。
1.5.2 不同pH下对SRB的驯化当菌株在15 ℃的条件下生长并进行硫酸盐还原时进行pH驯化。保持培养温度为15 ℃，将低温驯化得到的菌株接入初始pH为7.5的生长培养基中，作为菌株pH驯化的第一代。按照7.5、6.5、5.5和4.5的pH梯度，菌株生长后立刻接种至初始pH更低的培养基中。当菌株接种至初始pH为4.5的培养基并大量生长时，得到第四代菌株，即耐低温和耐低pH的SRB。
配制初始pH为4.5的生长培养基，以10%比例接入生长到对数期的第四代菌株，于15 ℃生化培养箱中静置培养，生长后得到第五代菌株。驯化过程中定期用注射器于厌氧瓶中取2 mL菌液测定硫酸根含量。
2 结果与讨论 2.1 样品理化性质分析在山底河流域收集的水体和底泥样品大部分呈酸性，pH值范围为2.33–7.64 (表 1)。SO42–含量较高，在水体中浓度值为930–12 939 mg/L含量远超正常的地表水标准(250 mg/L)[21]，在底泥中浓度值为1 710–12 590 mg/kg。取样点1处重金属含量最高，尤其是水体样本S1中Al和Fe的含量均超出了1 400 mg/L。本研究选取硫酸根浓度最高的S1和D1样品，开展SRB的筛选工作。
表 1. 山底河河水(S)及底泥(D)样品的基本理化性质
Table 1. Physicochemical properties of Shandi River water (S) and sediment (D) samples
| Sample | S1 | S2 | S3 | S4 | D1 | D2 | D3 | D4 |
| pH | 2.33 | 6.91 | 3.61 | 6.23 | 3.18 | 7.57 | 5.68 | 7.64 |
| SO42– | 12 939.00 | 930.00 | 1 842.00 | 967.00 | 12 590.00 | 1 725.00 | 8 360.00 | 1 710.00 |
| Mn | 41.50 | 2.63 | 5.83 | 2.46 | 37.65 | 3.30 | 6.20 | 2.25 |
| Na | 31.90 | 120.00 | 172.00 | 102.00 | 21.15 | 209.50 | 127.50 | 72.00 |
| Mg | 1 027.00 | 66.00 | 120.00 | 56.30 | 570.00 | 188.50 | 337.00 | 68.50 |
| Ca | 422.00 | 209.00 | 241.00 | 169.00 | 2 435.00 | 461.50 | 2 665.00 | 715.00 |
| Al | 1 400.00 | 0.01 | 22.00 | 0.05 | 530.00 | 0.10 | 0.00 | 0.15 |
| Fe | 1 438.00 | 0.04 | 3.85 | 0.07 | 111.00 | 0.00 | 0.00 | 0.05 |
| Cl– | 2.23 | 32.00 | 40.60 | 32.20 | 1.50 | 29.15 | 20.05 | 13.60 |
| NO3– | 0.00 | 16.70 | 11.10 | 16.10 | 2.30 | 1.95 | 3.25 | 2.35 |
| The unit of measurement content were S: mg/L; D: mg/kg. | ||||||||
2.2 SRB的鉴定
经过筛选，得到2株具有硫酸盐还原功能的革兰氏阴性纯菌株，分别命名为YQ-1和YQ-2。如图 1所示，菌株YQ-1呈两端钝圆椭球状，无鞭毛，长约1.2–1.8 μm，直径约0.6–0.8 μm，菌落形态为白色，凸状隆起，边缘整齐。菌株YQ-2呈两端锐圆椭球状，向上拱起呈微弧状，无鞭毛，长约0.8–1.2 μm，直径约0.2–0.3 μm，菌落形态为米黄色，凸状隆起。
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| 图 1 硫酸盐还原菌YQ-1和YQ-2菌株形态图 Figure 1 Strain morphology diagram of the sulfate-reducing bacteria YQ-1 and YQ-2. |
将菌株YQ-1和YQ-2的测序序列提交到NCBI进行BLAST比对，基于比对结果，选取17株单菌16S rRNA基因序列在MEGA 11中使用最大似然法构建系统发育树(图 2)。比对结果表明YQ-1与瘤胃解蛋白质菌属(Proteiniclasticum)的序列相似性较高，YQ-2与脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的序列相似性较高。菌株的系统发育树构建结果表明，YQ-1与Proteiniclasticum ruminis DSM 24773 strain D3RC-2亲缘关系最近，相似度达到了100%。YQ-2与Desulfovibrio vulgaris DSM 644亲缘关系最近，相似度同样达到100%。
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| 图 2 菌株YQ-1、YQ-2和相关菌株的16S rRNA基因系统进化发育树 Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of YQ-1, YQ-2 and other related strains. Numbers in parentheses represent the NCBI reference sequence; numbers at the nodes indicate the bootstrap values on N-J analysis of 1 000 resampled data sets. The 0.02 scale bar represents 2% change of amino acid residues. |
Proteiniclasticum属的菌株多从牦牛瘤胃中分离出来，以蛋白质和纤维素为底物进行产酸反应，具备污泥减量化的作用[22]。近些年在酸性矿山废水污泥[23]和厌氧反应器中都分离出Proteiniclasticum属的菌株，并发现该属菌株参与了体系内的硫代谢过程[24]。Desulfovibrio是比较典型的硫酸盐还原菌，前人采用Desulfovibrio medium DSMZ 63对酸性矿山废水进行处理，发现该菌株能高效还原体系中的硫酸盐，并去除重金属离子[25]。
2.3 SRB的生长特性在30 ℃、pH 7.5条件下培养YQ-1菌株。生长曲线表明，YQ-1在第1天处于生长延滞期，第2天开始大量繁殖，进入生长对数期。第5–6天，细胞浓度达到最大值，菌株处于稳定生长期。第7天细胞数量开始减少，菌株进入衰亡期(图 3A)。对照组中，ORP呈缓慢下降趋势，下降幅度小，降至–104.3 mV后变得平缓，硫酸根的初始浓度与终浓度无明显差别。实验组中，初始pH值为6.84，前3 d，pH呈现先上升后下降的趋势，在第3天到达最低点。第4天，pH上升，在第8天达到峰值7.67，再次下降至7.4左右逐步稳定(图 3B)。氧化还原电位呈下降趋势，下降幅度显著，从36.86 mV降至–428.21 mV，第5天到达最低点后趋于平缓(图 3C)。硫酸根初始浓度为1 137.5 mg/L，第5天降至48.75 mg/L，最终硫酸根的去除率达到96.25% (图 3D)。
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| 图 3 YQ-1在30 ℃、pH 7.5条件下的生长特性。YQ-1培养过程中细菌密度(A)、pH(B)、氧化还原电位(C)和硫酸根含量(D)的变化 Figure 3 Growth characteristics of YQ-1 at 30 ℃ and pH 7.5. Changes of bacterial density (A), pH (B), ORP (C) and sulfate content (D) during YQ-1 culture. Error bars in figure representing standard deviation, reflecting the degree of dispersion of data between three samples.× |
在30 ℃、pH 7.5条件下培养YQ-2菌株。生长曲线表明，0–1 d，YQ-2处于生长延滞期，第1–5天为其对数生长期，第9天进入衰亡期(图 4A)。在对照组中，氧化还原电位缓慢下降，第8天降至–104.3 mV后无明显变化。硫酸根的初始浓度与终浓度无明显差别。实验组pH波动较大，第1天上升后立即下降，第2天到达pH最低点，之后波动变化，总体呈上升趋势(图 4B)。培养过程中pH值呈现先升高后降低再逐渐升高的趋势，可能与菌株的生长特性有关。生长初期，SRB与体系内的硫酸根反应，生成大量的H2S，体系中H+减少，pH升高。生长旺盛期，细胞代谢不断积累有机酸等产物，pH降低[26]。氧化还原电位呈下降趋势，下降幅度大，16 d后逐渐稳定在–420 mV左右(图 4C)。硫酸根浓度在0–10 d呈缓慢下降趋势，第10–12天下降速度加快。第16天时，硫酸根浓度降至318.75 mg/L，最终硫酸根去除率达到75.48% (图 4D)。
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| 图 4 YQ-2在30 ℃、pH 7.5条件下的生长特性。YQ-2培养过程中细菌密度(A)、pH(B)、氧化还原电位(C)和硫酸根含量(D)的变化 Figure 4 Growth characteristics of YQ-2 at 30 ℃ and pH 7.5. Changes of bacterial density (A), pH (B), ORP (C) and sulfate content (D) during YQ-2 culture. Error bars in figure represent standard deviation, reflect the degree of dispersion of data between three samples. |
2.4 温度和pH对SRB还原硫酸根的影响
调节培养基的培养温度和初始pH，探究不同培养条件对菌株还原硫酸根的影响。结果表明，在YQ-1培养过程中，当保持初始pH 7.5，温度降到25 ℃或15 ℃时，均未出现明显黑色沉淀，体系内硫酸根的含量仍高于1 000 mg/L (图 5A)；当保持培养温度为30 ℃，pH 6.5或低于6.5时，同样未出现明显黑色沉淀，还原反应作用较弱。培养到第10天时，体系内硫酸根含量仍高于1 100 mg/L (图 5B)。YQ-1在30 ℃、pH 7.5的条件下还原效率较高，pH和温度降低，还原能力减弱。低pH条件下，SRB代谢能力下降，硫化物的化学平衡发生改变[27]。前人在探究pH和温度对混合SRB还原能力的影响时发现，当pH低于6.5、温度低于25 ℃时，混合菌群的还原能力较弱[28]，与本研究规律相似。温度低于16 ℃或高于47 ℃时，与YQ-1亲缘关系较近的Proteiniclasticum BAD-10T降解能力明显减弱[29]，表明温度影响菌株性能。
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| 图 5 温度(A)和pH (B)对YQ-1硫酸盐还原效率的影响 Figure 5 The effect of temperature (A) and pH (B) on the sulfate reduction efficiency of YQ-1. Error bars in figure represent standard deviation, reflecting the degree of dispersion of data between three samples. |
YQ-2在不同条件下的还原效果与YQ-1类似，效率受温度和pH的影响较大。YQ-2的生长速度较慢，在30 ℃、pH 7.5条件下，需要16 d将体系中的硫酸盐还原到400 mg/L左右(图 6)。YQ-2在30 ℃、pH 7.5条件下还原效率较高，与其亲缘关系较近的Desulfovibrio vulgaris DSM 644T菌株有相同的生长特性[30]。低温和酸性条件会抑制微生物的生长繁殖，导致代谢活动减弱[31]，进而降低菌株的还原效率。前人对从处理硫酸盐废水的厌氧反应器中分离得到的脱硫菌属进行功能研究，发现当温度低于25 ℃或pH小于5时该菌株无明显生长现象[32]，这与本研究中菌株的生长特性相似。
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| 图 6 温度(A)和pH (B)对YQ-2硫酸盐还原效率的影响 Figure 6 The effect of temperature (A) and pH (B) on the sulfate reduction efficiency of YQ-2. Error bars in figure represent standard deviation, reflecting the degree of dispersion of data between three samples. |
2.5 SRB的驯化培养
山底河流域属于温带大陆性气候，年平均温度为10.1 ℃，流域中被污染水体呈酸性[19]。为了提高SRB在低温和低pH条件下的还原效率，本研究选取生长速度快且还原效率高的YQ-1进行驯化。采用梯度降温的方法使YQ-1逐渐适应低温环境。结果表明，在温度15 ℃、pH 7.5的相同体系内，YQ-1驯化前的还原效率为5.80%，经过低温驯化后还原效率提高至91.49%，略低于30 ℃、pH 7.5条件下的硫酸盐去除率。驯化前SRB由于温度大幅降低，酶的活性受到影响，繁殖速度减慢，新陈代谢减弱[33]。而经过驯化的SRB则在逐步降低温度的过程中适应了低温环境。有研究对矿区富集的SRB菌群进行低温驯化，得到在14 ℃培养条件下，硫酸根去除率达到70%的SRB菌群[34]。
保持培养温度为15 ℃，梯度降低体系的初始pH值，对菌株进一步驯化。结果表明，初始pH为7.5的一代菌株还原效率为91.60%，初始pH为6.5、5.5的二、三代菌株还原效率分别为76.04%和53.65%，初始pH为4.5的四代菌株还原效率为34.12%。随着初始pH逐步降低，YQ-1的还原效率逐渐降低(图 7)。在驯化过程中，对体系内的菌体生物量进行监测。结果表明，当体系内发生大量还原反应时，初始pH为7.5的体系中菌体生物量为6.32×107 cells/mL，初始pH为6.5、5.5和4.5的体系中菌体生物量分别为5.44×107、1.36×107和6.01×106 cells/mL。在初始pH 7.5和6.5的条件下，硫酸盐还原菌菌体数量差异不大，但其还原效率仍为下降趋势，可能是pH对菌体酶活性的抑制及代谢过程造成影响所导致。随着初始pH的逐步下调，菌体生物量降低，生长受到抑制。这说明在驯化过程中硫酸盐还原菌的自身还原能力和生长都受到抑制，从而造成硫酸根还原能力降低。相较培养温度，pH对YQ-1的影响更大。在一些对SRB生长条件的研究中发现存在类似现象[9, 35]，这可能与菌株的分离环境有关。当pH逐步降低，细胞膜是微生物在低pH环境中生理胁迫的首要侵袭目标，细胞膜中脂肪酸的组成和比例的变化是其对外部环境胁迫的一般性应答。经过梯度耐酸驯化，微生物细胞膜中单不饱和脂肪酸的含量和碳链长度比例增加，降低了细胞膜对H+的透过性，防止细胞膜内的pH迅速下降，以维持细胞正常的生理功能，从而能在低pH的环境生存[36]。
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| 图 7 培养温度为15 ℃，YQ-1在不同起始pH条件下SO42–的变化及去除率 Figure 7 Variation of SO42– and removal rate of YQ-1 under different starting pH conditions at 15 ℃. Error bars in figure represent standard deviation, reflecting the degree of dispersion of data between three samples. |
对四代SRB菌株进行传代培养，得到第五代耐性菌株。将生长培养基的初始pH调至4.5，以10%的比例加入生长到对数期的四代菌株，于15 ℃生化培养箱中静置培养，定期测定pH值和SO42-浓度。结果表明，五代菌株的硫酸盐去除率为37.21%，比四代菌株的还原效率提高了3.09% (图 8)。
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| 图 8 YQ-1驯化后进行传代的SO42–变化及去除率 Figure 8 Changes in SO42– and removal rate of domesticated YQ-1 after passaging. Error bars in figure represent standard deviation, reflecting the degree of dispersion of data between three samples. |
比较YQ-1驯化前后的硫酸根去除率，结果表明，在相同的培养条件(15 ℃、pH 4.5)下，YQ-1未驯化时还原效率仅有2.91%，经过驯化和传代，还原效率提高到了37.21%，驯化效果显著(图 9)。细菌通过广泛的适应性反应和抗性机制来应对自然界的挑战[37]，驯化过程即为逐步改变外界条件提高细菌对外界条件的适应性，在这个过程中活力较强的菌株发生变异，演变为耐性菌株[38]。细菌驯化后的广泛多样性和适应度数据表明，不同的菌株具有不同的选择目标，即使在单一物种内，基因型与环境的相互作用也是极其复杂的，其驯化结果随培养条件改变而发生变化[39]。有研究在温度为35 ℃条件下对SRB进行pH梯度驯化，驯化后SRB能在pH为4的条件下生长并去除体系内15%的硫酸根，传代后还原效率提高，硫酸根去除率达到38%[40]，与本研究得到的驯化规律相似。微生物能否长期连续传代，是衡量微生物是否稳定的经典方法之一[41]。YQ-1经过驯化和传代仍能稳定生存，说明菌株已经适应新环境，菌株具有稳定性。
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| 图 9 YQ-1驯化前后SO42–去除率的比较 Figure 9 Comparison of SO42– removal rate before and after domestication of YQ-1. Error bars in figure represent standard deviation, and different letters indicate significant difference (P < 0.05). |
3 结论与展望
本研究通过对来自山底河流域的样品进行微生物富集、筛选、分离与鉴定，获得2株具有高效还原能力的硫酸盐还原菌，分别隶属于瘤胃解蛋白质菌属(Proteiniclasticum)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，将其命名为YQ-1和YQ-2。2株菌均能在30 ℃、pH 7.5的培养条件下还原硫酸盐，其中YQ-1还原效率为96.25%，YQ-2还原效率为75.48%。当温度和pH降低时，YQ-1和YQ-2还原能力减弱。选取还原效率较高的YQ-1进行梯度驯化实验，驯化培养和传代后，最终得到在15 ℃、pH 4.5条件下，硫酸盐还原效率为37.21%的耐性菌株。驯化前，YQ-1在相同条件下还原效率只有2.70%，驯化后还原效率得到显著提高。驯化实验表明，SRB具有适应低温和低pH环境的能力，继续进行驯化工作可使其具有更高的还原能力。本研究证实了微生物驯化对北方老窑水的高效治理具有可行性，同时适应低温和低pH条件的硫酸盐还原菌也为北方老窑水的治理提供了可利用菌种资源。
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