2022, Vol. 62
表1(Table 1)
生物竞争排斥对油藏微生物群落结构变化影响
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220181
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 王大威, 张世仑, 靖波, 张健, 杜君. 2022
- WANG Dawei, ZHANG Shilun, JING Bo, ZHANG Jian, DU Jun.
- 生物竞争排斥对油藏微生物群落结构变化影响
- Influence of competitive exclusion on the change of reservoir microbial community structure
- 微生物学报, 62(6): 2299-2310
- Acta Microbiologica Sinica, 62(6): 2299-2310
-
文章历史
- 收稿日期：2022-03-21
- 修回日期：2022-05-17
- 网络出版日期：2022-06-06
引用本文 |
王大威, 张世仑, 靖波, 张健, 杜君. 生物竞争排斥对油藏微生物群落结构变化影响[J]. 微生物学报, 2022, 62(6): 2299-2310.
Wang Dawei, Zhang Shilun, Jing Bo, Zhang Jian, Du Jun. Influence of competitive exclusion on the change of reservoir microbial community structure[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(6): 2299-2310.
生物竞争排斥对油藏微生物群落结构变化影响
1. 海洋石油高效开发国家重点实验室, 北京 100028;
2. 中海油研究总院有限责任公司, 北京 100028;
3. 中海石油(中国)有限公司天津分公司, 天津 300452
2. 中海油研究总院有限责任公司, 北京 100028;
3. 中海石油(中国)有限公司天津分公司, 天津 300452
摘要：[目的] 海上S油田采用生物竞争排斥技术治理油藏硫化氢产出取得一定成效，本研究通过揭示该技术对油藏环境中微生物群落结构的影响，尝试研究硫化氢治理过程中产生效果差异的因素。[方法] 采用高通量测序分析等方法对加入硝酸盐、亚硝酸盐等药剂后，治理效果低效井、高效井及未治理井中不同微生物群落结构变化进行分析。[结果] 与低效井和未治理井相比，高效井中的反硝化菌和石油降解菌种类和丰度明显增加，其中石油降解菌增加24.14%，反硝化细菌增加5.23%；Fe2+、Zn2+等离子的存在对不同井间治理效果差异和微生物群落变化具有一定影响。[结论] 海上油田硫化氢治理中，生物竞争排斥技术不仅可以明显降低硫化氢产出，同时对油藏微生物群落环境也影响显著，微生物群落结构分析可作为硫化氢治理效果评价的重要指标，为海上油田硫化氢治理工作提供技术支持。
关键词：生物竞争排斥技术 微生物群落结构 硫化氢治理 高通量测序
Influence of competitive exclusion on the change of reservoir microbial community structure
1. State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation, Beijing 100028, China;
2. China National Offshore Oil Corporation (CNOOC) Research Institute, Beijing 100028, China;
3. Tianjin Branch of China National Offshore Oil Corporation (CNOOC), Tianjin 300452, China
2. China National Offshore Oil Corporation (CNOOC) Research Institute, Beijing 100028, China;
3. Tianjin Branch of China National Offshore Oil Corporation (CNOOC), Tianjin 300452, China
Abstract: [Objective] The competitive exclusion principle has been adopted to treat the production of hydrogen sulfide in offshore S oilfield, and some achievements have been made. The study aimed to reveal the influence of competitive exclusion on reservoir microbial community structure and to investigate the factors producing differences in hydrogen sulfide treatment. [Methods] High-throughput sequencing was used to analyze the changes of different microbial community structures in low-effective wells, high-effective wells and untreated wells after the addition of nitrate and nitrite. [Results] Compared with the conditions in low-effective wells and untreated wells, the species and abundance of denitrifying bacteria and oil-degrading bacteria in high-effective wells increased by 5.23% and 24.14%, respectively. Moreover, metal ions such as Fe2+ and Zn2+ were found to influence the treatment effects among different wells and the changes of microbial communities. [Conclusion] In offshore oilfields, competitive exclusion could significantly reduce the production of hydrogen sulfide, and impact the microbial community environment of the reservoir. Analysis of the microbial community structure could be used as an important indicator for evaluating the effect of hydrogen sulfide treatment, which provided technical support for treating hydrogen sulfide in offshore oilfields.
Keywords:
competitive exclusion principle microbial community structure hydrogen sulfide treatment high-throughput sequencing
因水资源有限，部分海上油田采用回注污水和掺注海水方式进行注水开发，海上S油田A平台投产时间长，注水作业时间长，注水方式复杂，注水来源有水源井水、中心处理平台(central equipment platform，CEP)处理污水、海水等，造成硫化氢浓度采出浓度高、管柱腐蚀、硫化亚铁垢沉积等问题，严重影响现场生产。一般认为油气藏中的H2S主要来源为：硫化物的细菌还原(bacterial sulfate reduction，BSR)、有机硫化物的热裂解(thermal decomposition of sulfate，TDS) 和硫酸盐热化学还原(thermochemical sulfate reduction，TSR)[1]。据研究发现，中低温(45-80 ℃)注水油田硫化氢主要来自于硫化物的细菌还原，其油藏内一般都含有大量的硫化氢产生菌(hydrogen sulfide production microbe，SPM)，SPM的存在不仅会对系统造成污染，也会随注水一起进入到地层，引起SPM在地层的滋生繁殖，生成硫化氢。汪卫东对胜利油田油藏微生物群落进行分子生物学分析，在3个油藏检测到3个属的常温硫酸盐还原菌(Desulfitobacterium、Desulfosporosinus和Desulfotomaculum)及2个属的高温硫酸盐还原菌(Thermodesulfobacterium和Thermodesulfovibrio)[2]。杨帆等对江苏油田陈2区块硫酸盐还原菌多样性分析发现，油藏内存在Desulfitobacterium、Desulfovibrio vulgaris、Archaeoglobus fulgidus等多种与硫化氢产生相关的微生物[3]。
A平台作为中低温油藏(65 ℃)，对水源井水、CEP来水多次检测后，发现其中均含有一定量的硫酸盐还原菌(105-106个/mL)。对平台单井及生产流程中硫化氢含量的检测得出，47口生产井中，硫化氢含量超过20 g/m3的有30口，受污染的比例约为64%。针对这一问题，平台采用生物竞争排斥技术(biocompetitive exclusion，BCX)进行硫化氢产出治理，该技术原理是向油藏内注入硝酸盐/亚硝酸盐等成分，取代硫酸盐成为电子受体，促使油藏中的硝酸盐还原菌迅速生长扩散，并与硫酸盐还原菌竞争生存空间和基质，因此可阻止硫酸盐还原菌获得所需要的营养物，从而控制硫酸盐还原菌的代谢活性，降低硫化氢的产生[4]。
经生物竞争排斥技术治理后，A平台各采出井硫化氢浓度明显下降，从治理前最高1 000 g/m3降低到大部分单井低于20 g/m3，同时硫酸盐还原菌浓度降至102个/mL，硝酸盐还原菌浓度超过106个/mL，说明生物竞争抑制取得明显效果。但治理效果也存在差异，个别井硫化氢含量高于20 g/m3，目前尚不能确定造成不同井间硫化氢治理效果差异的原因，从而影响注入药剂体系及工艺的调整，阻碍该技术效果提升和推广应用。本研究采用分子生物学技术，针对治理中出现的低效治理井(硫化氢产出浓度 > 20 g/m3)、高效治理井(硫化氢产出浓度 < 20 g/m3)及未治理井(未加药井)中不同细菌群落分布变化进行分析，尝试研究治理过程中因微生物原因造成的产生效果差异，将微生物群落结构变化作为一种评价手段，为今后现场药剂效果评价及注入工艺调整提供必要的技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 水样未治理井组(K01)、低效治理井组(A03/A20)、高效治理井组(A25/A26)地层水取自海上S油田A平台，水质见表 1。
表 1. 采出液离子色谱分析结果
Table 1. Ion chromatographic analysis results of produced liquid
| Ion | K01/(μg/mL) | A03/A20/(μg/mL) | A25/A26/(μg/mL) | Ion | K01/(μg/mL) | A03/A20/(μg/mL) | A25/A26/(μg/mL) | |
| As3+ | 0.077 | 0.072 | 0.053 | Ni2+ | 0.009 | 0.010 | 0.006 | |
| Li+ | 1.55 | 1.43 | 1.70 | V3+ | 0.015 | 0.018 | 0.016 | |
| Fe2+ | 0.027 | 0.025 | 0.041 | K+ | 55.5 | 74.4 | 49.2 | |
| B3+ | 6.47 | 5.57 | 6.10 | Na+ | 2 320 | 2 390 | 2 380 | |
| Mn2+ | 0.004 | 0.020 | 0.012 | Ca2+ | 52.4 | 87.2 | 98.0 | |
| Al3+ | 0.009 | 0.012 | 0.009 | Mg2+ | 28.3 | 40.0 | 39.2 | |
| Sn2+ | 0.076 | 0.069 | 0.048 | Cl− | 3 560 | 3 720 | 3 970 | |
| Zn2+ | 0.005 | 0.017 | 0.005 | SO42− | 70.14 | 96.6 | 101.6 | |
| NO32− | 0.33 | 0.54 | 0.48 | NO2− | 0.05 | 0.12 | 0.08 |
1.1.2 试剂和设备
Axygen细菌基因组小提试剂盒(Axygen公司)，Postgate培养基(华威锐科)，酵母提取物(天津利发隆化工技术公司)，亚硝酸钠、巯基乙酸钠、六水氯化镁、硫酸钠、氯化钙(天津市江天化工技术股份有限公司)，氯化铵(天津市河东区广达服务部)，正己烷、角鲨烷(天津市康科德科技有限公司)，硫化钠(天津市杰尔正化工贸易有限公司)，硝酸纳(天津市化学试剂供销公司)。
台式离心机(Eppendorf公司)，荧光定量PCR仪(iQTM5，Bio-Rad公司)，台式高速冷冻离心机(SIGMA公司)，Agilent 8860气相色谱仪(安捷伦科技(中国)有限公司)、电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统公司)，SpectroDirect分光光度计(罗威邦公司)，生物样品均质仪Bioprep-24 (杭州奥盛仪器有限公司)。
1.2 现场采样取25 L干净塑料桶用医用酒精洗2-3遍，备用；根据井口压力选择性接上高(低)压取样器，打开取样阀，让采出液流出5-10 min并冲洗塑料桶2-3遍；将采出液灌满塑料桶，拧紧盖子密闭常温保存；样品采集后尽快运送至实验室进行样品预处理。
1.3 基因组DNA提取将离心后得到的沉淀进行DNA提取，提取方法参见Axygen细菌基因组小提试剂盒说明书；提取后得到的洗脱液使用Biodrop超微量蛋白核酸分析仪进行DNA浓度检测，对质检合格的DNA样品进行高通量测序。
1.4 高通量测序分析使用通用引物515F (5ʹ-GTGYCAGCMGC CGCGGTAA-3ʹ)和926R (5ʹ-CCGYCAATTYMT TTRAGTTT-3ʹ)对3组(未治理井、低效治理井、高效治理井)样品DNA进行细菌16S rRNA基因PCR扩增[5]，PCR反应体系(2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 12 μL，正、反向引物各1 μL，DNA 1 μL)，PCR反应程序(94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min)。使用Illumina HiSeq测序平台进行测序。
测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接。通过Quantitative Insights Into Microbial Ecology (http://qiime.org/1.4.0/index. html)软件对低质量的数据进行过滤。根据barcode序列将序列按照样品来源进行分拣，对每个样品的序列数目进行统计。对序列进行归类操作(cluster)，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，1个小组即1个OTU。根据指定的相似度(97%)，对所有序列进行OTU划分并进行生物信息统计分析。将每一条优质序列都与SILVA数据库(https://arb-silva.de/)进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息。之后，将每一个OTU中的所有序列进行类比，找出同一OTU中的不同序列的最近祖先的种属信息。
2 结果与分析 2.1 细菌的物种组成分析实验测序结果比对到属，可看出假单胞菌属(Pseudomonas)在3个样本中均占比靠前，在低效治理井(Low)与未治理井(Non)样本中占绝大部分(图 1)。高效治理井(High)样本物种丰富度更高，Pseudomonas占比仅为23.74%，其次为Marinobacter (17.41%)与Halomonas (6.73%)；低效治理井(Low)样本中Pseudomonas占比达80.86%，其次为Thauera (11.24%)和Halomonas (3.71%)；未治理井(Non)样本中Pseudomonas占比达67.92%，其次为Delftia (24.62%)和Thauera (2.99%)。
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| 图 1 采出液细菌物种组成柱状图 Figure 1 Bar graph of bacterial species composition in produced fluid. |
具体表现在门的水平上，变形菌门在3个油藏样品中均占绝对优势，在属水平上，油藏样本中均含假单胞菌属(Pseudomonas)、陶厄氏菌属(Thauera)和不动杆菌属(Acinetobacter)。在高效治理井(High)中，由于硝酸盐的加入，有效的激活了油藏中的多种微生物类群，增加了油藏中微生物细菌群落的多样性。其中海杆菌属(Marinobacter)属于专性解烃菌(obligate hydrocarbonoclastic bacteria，OHCB)，这种菌本身在海洋环境中丰度很低或者很难检测到，但在海上溢油发生后其可迅速增长，并以石油组分为唯一碳源和能源生长[6-7]，具有较强的石油烃降解能力[8]；嗜盐菌属(Halomonas)是一种极端环境微生物，特别在盐度较高的油藏中，可取代耐盐性较差的细菌来发挥原油降解作用，同时也可处理废水中的氨氮[9-11]；陶厄氏菌(Thauera)是一种常见的反硝化细菌，可利用硝酸盐作为电子受体，以乙酸盐和硫化物作为电子供体进行生长代谢，已有的研究显示Thauera属的物种是污水处理系统中最活跃的一类反硝化细菌，并能够降解酚类化合物[12-14]；肠杆菌属(Enterobacter)可以产生生物表面活性剂并对石油烃产生乳化作用，从而提高石油烃的生物降解性，同时有报道称Enterobacter菌株可使聚合物表面结构发生变化，降解侧链，使聚丙烯酰胺溶液黏度下降[15-16]；短波单胞菌属(Brevundimonas)具有降解有毒有害污染物的作用，如Brevundimonas diminuta MG可产生对硫磷水解酶，也是对硫磷降解菌中研究最多的菌株[17]。
对比3个样本(图 2)，可看出高效治理井(High)样本相较于其他2个样本具有一些独特物种，如热单胞菌属(Thermomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonadaceae)、玫瑰变色菌属(Roseovarius)等，这些细菌的存在也说明抑制剂的加入有效地激活了某些有助于抑制硫酸盐还原菌及H2S产生的菌属。Mergaert等在厌氧反硝化反应器内分离出热单胞杆菌(Thermomonas)，发现其在50 ℃下都有较好的反硝化特性[18]；Cho等发现黄单胞菌属(Xanthomonadaceae)在好氧的条件下可将H2S氧化为硫酸，降低环境中H2S浓度[19]；卜魁勇等在废水处理站中发现Roseovarius，推测其与多环芳烃降解有关且属于反硝化细菌，可能参与生物氧化池的除油以及反硝化过程[20]。未治理井(Non)样本中，Delftia和Chryseobacterium丰度较高，unclassified_f_Burkholderiaceae丰度较低；低效治理井(Low)样本中，Thermodesulforhabdus和Thauera丰度较高，代尔夫特菌属(Delftia)、Pannonibacter和Chryseobacterium丰度较低。
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| 图 2 采出液物种群落热图 Figure 2 The heat drop diagram of the extracted fluid population. Heatmap is a color gradient to represent the data size in a two-dimensional matrix or table, and presents the species composition and abundance information of the community. Usually, the species or samples are clustered according to the similarity of abundance, and the results are presented on the community heatmap, so that the species with high abundance and low abundance can be clustered in blocks, and the similarity and difference of community composition of different samples at various taxonomic levels can be reflected by color change. |
2.2 未治理井与高效治理井的物种差异检验
采用费舍尔精确检验(Fisher exact test)，对高效治理井(High)和未治理井(Non) 2个样本间的物种的丰度差异进行比较，获得物种在2个对比样本中的差异显著性(图 3)。
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| 图 3 未治理井与治理高效井物种差异分析 Figure 3 Species difference analysis between untreated wells and high-efficiency wells. The Y-axis indicates the species name at a certain classification level, and each column corresponding to a species indicates the relative abundance of the species in each sample, and different colors indicate different samples; The middle area is within the set confidence interval, the numerical value corresponding to the dot indicates the difference of relative abundance of species in two samples, the dot color shows the sample color with larger species abundance, and the I-shaped interval on the dot is the upper and lower limits of the difference; The value on the right is P, *: 0.01 < P≤0.05, **: 0.001 < P≤0.01, ***: P≤0.001. |
在高效治理井(High)和未治理井(Non)这2个样本中丰度较高且具有统计学意义上的差异物种中，Pseudomonas、Delftia和Marinobacter差异明显。说明在未加入抑制剂的情况下，环境中细菌的种类和丰度都比较单一，Pseudomonas、Delftia在其中占统治地位，占细菌总量的92.5%，其它细菌的种类和丰度都比较低，而在高效治理的情况下，Pseudomonas依旧是优势菌群，但占比仅为23.7%，Delftia下降为2.4%，与石油烃降解相关的Marinobacter (17.41%)、Halomonas (6.73%)和与反硝化作用相关的Thauera丰度提升明显，说明抑制剂的加入补充了Marinobacter、Halomonas、Thauera等细菌所需的营养成分，提高这些细菌在油藏内分布水平。
2.3 典型关联分析(canonical correlation analysis，CCA)从图 4可以看出，Fe3+与高效治理井相关性高，Zn2+与低效治理井相关性高。微生物体内约25%的蛋白质为金属蛋白，在微生物生命周期中发挥重要作用[21]。金属蛋白通常利用过渡金属离子Fe3+、Mn2+、Zn2+和Ni2+等作为辅助因子，这些金属离子调节蛋白质的功能以及维持蛋白质的特定结构和稳定性[22]，金属离子的缺乏会抑制细菌生长，但过量也会抑制细菌生长。细菌自身具有严格的调控机制以保证其体内金属离子处于稳态[23]。铁是绝大多数细菌生长所必需的微量元素，因为它是一些重要蛋白的辅因子，这些蛋白从呼吸作用到核酸的复制都有着广泛的功能[24]。吴春晗等报道不同浓度的锌离子会对好氧反硝化细菌的硝酸盐氮去除效率有不同程度的抑制作用，这种抑制作用有多强尚待研究，但这种作用可能与低效治理井中反硝化效果较差有关[25]。丰度前10的物种中，Delftia与未治理井相关性高，Thauera与低效治理井相关性高，Pseudomonas位于未治理井和低效治理井之间，其余物种均与高效治理井相关性高。
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| 图 4 采出液CCA分析 Figure 4 CCA analysis of produced fluid. CCA can reflect samples and environmental factors on the same two-dimensional ranking chart, and the relationship between sample distribution and environmental factors can be seen intuitively from the chart, including the relationship among environmental factors, samples and flora or the relationship between any two. Points of different colors or shapes in the diagram represent sample groups in different environments or conditions. The red arrow represents quantitative environmental factors, and the length of the arrow of environmental factors can represent the degree of influence (interpretation) of environmental factors on species data. The angle between arrows of environmental factors represents positive and negative correlation (acute angle: positive correlation; obtuse angle: negative correlation; right angle: no correlation). From the sample point to the arrow of quantitative environmental factors, the distance between the projection point and the origin represents the relative influence of environmental factors on the distribution of sample communities. |
3 讨论
油藏是较为复杂的地下环境，其内部因氧气和营养物质的不足，微生物群落无论种类和丰度都相对较低，而且不同区块油藏的本源微生物群落组成也不尽相同，即使是同一油藏不同区块地层的微生物组成也可能是不同的[26]。一般情况下，由于未开发的油藏具有低的氧化还原电势并处于缺氧状态，因此只有严格厌氧微生物才可能成为真正的油藏本源微生物[27]。
我国绝大部分油田目前都经过多年的水驱开发，因注水会携带氧气及营养物质进入油藏地层，从而改变油藏环境，并且随着注入水的注入，外源微生物被带入地层，某些外源微生物有着很强的生存能力逐渐在地层环境中栖息下来，注入水导致栖居在原油储层中的微生物群落也发生改变，但研究也发现同一区块的注水井和油井微生物构成间也存在着较大差异，Zhang等通过总结国内4个不同温度地层的注水井微生物菌群与油井微生物菌群的差异来揭示注入水对地层微生物的影响，结论表明注入水对地层微生物菌群有一定影响，但该影响随着地层温度的增加而减少，注水井中微生物对油藏中微生物菌群的影响除了和该地层温度相关外，还应考虑地层结构与油层层位等地质因素[28]。
本研究中，目标区块实施硫化氢治理措施，即加入硫酸盐还原菌抑制药剂后，药剂对硝酸盐还原菌的激活及对硫酸盐还原菌的抑制，打破了油藏原有的微生物生态平衡。油藏中的微生物种群为了适应新的营养环境，通过竞争、抑制或共生等方式进行微生物群落结构再调整，逐渐确立新的生态体系，保证整个生态系统的动稳态平衡。
可以看到在3个样本中，假单胞菌(Pseudomonas)和肠杆菌(Enterobacter)都是大量存在的，在以往的报道中，这2类菌也是在开发注水油田中主要被检测到的细菌类型，但在未开发油藏中，假单胞菌(Pseudomonas)和肠杆菌(Enterobacter)是较少被发现或者含量很低，说明这2类菌是因注水等开发方式被引入地层后适应油藏环境而生存下来，属于外源性菌属[29]。假单胞菌(Pseudomonas)是一种报道较多的可用作微生物采油的功能菌，其主要采油功能是降解原油和产生生物表面活性剂[30]，通常细菌降解原油，首先要将原油乳化为小液滴后通过胞内胞外酶将其降解，所以原油降解和生物表面活性剂的产生是紧密相关的，一般石油降解菌都能代谢生物表面活性剂。
同时可以看到高效治理井与低效治理井及未治理井相比呈现2个较为明显的区别，首先石油烃降解菌的种类和含量明显增加，Marinobacter (海杆菌属)、Halomonas (嗜盐菌属)、Enterobacter (肠杆菌属)等都是能以石油烃作为碳源和能源生长的微生物[31-32]，它们的增加说明硝酸盐的加入定向激活了具有此类功能的微生物种群；其次由于硝酸盐的加入，反硝化细菌的含量明显增加，如Thauera (陶厄氏菌)、Thermomonas (热单胞菌属)、Roseovarius (玫瑰变色菌属)等，这一类的反硝化细菌，均可以利用硝酸盐作为电子受体，乙酸盐和硫化物作为电子供体进行生长代谢，说明硝酸盐有效激活了油藏内的硝酸盐还原菌，起到了抑制硫酸还原菌，降低硫化氢产生的作用。这种因人为调控而引起微生物群落结构的变化，可作为油田硫化氢治理效果的评价依据。
4 结论本研究针对海上S油田硫化氢治理中出现的低效井、高效井及未治理井间的效果差异，采用分子生态学方法对井间细菌群落分布变化进行分析。结果显示，相比于低效井和未治理井，高效井中的反硝化菌和石油降解菌种类和丰度增加，分别增加了5.23%和24.14%；Fe2+和Zn2+等离子的存在对治理效果和微生物群落变化具有一定影响。这说明，首先生物竞争排斥技术对抑制硫酸盐还原菌，降低油藏腐蚀危害具有显著效果；其次人工调控手段与油藏微生物群落能够互相作用，从而对治理效果产生影响；同时，分子生态学技术作为一种油藏微生物检测手段对油田硫化氢生物治理效果评价、治理药剂及工艺方案调整具有指导意义。
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