微生物学报  2022, Vol. 62 Issue (6): 2372-2388   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220216.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220216
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会

文章信息

成语, 宋腾龙, 田雪歌, 王艳红. 2022
CHENG Yu, SONG Tenglong, TIAN Xuege, WANG Yanhong.
河套平原不同深度高砷地下水硫酸盐还原菌群落分布特征及环境意义
Distribution characteristics and environmental significance of sulfate-reducing bacterial community in high arsenic groundwater from different depth of Hetao Plain, China
微生物学报, 62(6): 2372-2388
Acta Microbiologica Sinica, 62(6): 2372-2388

文章历史

收稿日期：2022-03-30
修回日期：2022-05-09
网络出版日期：2022-05-18
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引用本文
成语, 宋腾龙, 田雪歌, 王艳红. 河套平原不同深度高砷地下水硫酸盐还原菌群落分布特征及环境意义[J]. 微生物学报, 2022, 62(6): 2372-2388.
Cheng Yu, Song Tenglong, Tian Xuege, Wang Yanhong. Distribution characteristics and environmental significance of sulfate-reducing bacterial community in high arsenic groundwater from different depth of Hetao Plain, China[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(6): 2372-2388.
河套平原不同深度高砷地下水硫酸盐还原菌群落分布特征及环境意义
成语1 , 宋腾龙2 , 田雪歌1 , 王艳红1,3     
1. 中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室, 湖北 武汉 430074;
2. 中国地质大学(武汉)环境学院, 湖北 武汉 430074;
3. 中国地质大学(武汉)长江流域环境水科学湖北省重点实验室, 湖北 武汉 430074
收稿日期：2022-03-30；修回日期：2022-05-09；网络出版日期：2022-05-18
基金项目：国家自然科学基金(42177066，41702365)
作者简介：王艳红，中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室副研究员。从事微生物介导的元素地球化学循环研究，尤其关注地下水系统中与砷、碳、铁、硫等循环相关的微生物地球化学过程和机理研究。先后主持国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年基金项目，并参与多项国家自然科学基金项目。已在Journal of Hazardous Materials、Science of the Total Environment、Frontiers in Microbiology、Journal of Environmental Sciences、Geomicrobiology Journal等专业刊物上发表学术论文20余篇.
摘要：[目的] 探究不同深度的高砷含水层中硫酸盐还原菌的丰度、群落组成和多样性的差异，并结合硫酸盐硫同位素等多种水化参数，揭示不同深度高砷地下水中硫酸盐还原菌群落分布特征及其环境意义。[方法] 以我国典型高砷地下水分布区河套平原为研究区，采集不同深度含水层中的高砷地下水样品，测定水化参数，采用qPCR对样品16S rRNA基因和dsrB基因进行定量；通过dsrB基因高通量测序对硫酸盐还原菌群落进行分析，并将dsrB基因相对丰度、群落组成及多样性与水化因子结合，进行统计学分析。[结果] 基于dsrB基因的定量结果表明，浅层地下水中dsrB基因相对丰度高于深层地下水。浅层地下水中，dsrB基因相对丰度与CH4浓度呈显著正相关，且δ34S-SO42–与CH4浓度显著正相关。而深层高砷地下水中，dsrB基因相对丰度与SO42–浓度、DOC浓度存在显著正相关性。高通量测序结果表明，深层地下水中硫酸盐还原菌的α多样性显著高于浅层地下水。研究区内硫酸盐还原菌可分为264个OTUs，以Desulfobacterales、Nitrospirales、Rhodospirillales、Syntrophobacterales等10个目为主。不同种属硫酸盐还原菌在深、浅层地下水的丰度及影响丰度的环境因子存在一定差异，其中浅层地下水中Nitrospirales的相对丰度与AsT浓度和δ34S-SO42–呈正相关，指示出硫酸盐还原菌中Nitrospirales类群在浅层地下水砷的迁移转化中的重要作用。RDA结果表明，AsT浓度、CH4浓度和Fe2+浓度是控制研究区地下水中硫酸盐还原菌群落分布的关键环境因子。[结论] 深、浅层高砷地下水中，硫酸盐还原菌多样性、种属构成与多样性存在显著差异，且受到了不同水化参数影响。
关键词：高砷地下水    硫酸盐还原菌    dsrB基因    高通量测序    qPCR    
Distribution characteristics and environmental significance of sulfate-reducing bacterial community in high arsenic groundwater from different depth of Hetao Plain, China
CHENG Yu1 , SONG Tenglong2 , TIAN Xuege1 , WANG Yanhong1,3     
1. State Key Laboratory of Biogeology and Environmental Geology, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei, China;
2. School of Environmental Studies, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei, China;
3. Hubei Key Laboratory of Yangtze Catchment Environmental Aquatic Science, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei, China
Received: 30 March 2022; Revised: 9 May 2022; Published online: 18 May 2022
*Corresponding author: Yanhong, E-mail: wangyh@cug.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (42177066, 41702365)
Abstract: [Objective] To investigate the relative abundance, community composition and diversity of sulfate-reducing bacteria in high arsenic groundwater of different depths, and to reveal the main geochemical factors (e.g., δ34S-SO42–) affecting the distribution characteristics of sulfate-reducing bacterial community in high arsenic groundwater and the environmental significance. [Methods] High arsenic groundwater samples from both shallow and deep aquifers were collected from Hetao Plain, a typical high arsenic groundwater-distributed area in China. Various geochemical parameters were measured and the relative abundance of 16S rRNA gene and dsrB gene of the samples was quantified by qPCR. High-throughput sequencing of dsrB gene was conducted to reveal the community composition of sulfate-reducing bacteria. Statistical analysis was further performed to analyze the correlations between geochemical variables and sulfate-reducing bacterial community characteristics. [Results] The relative abundance of dsrB gene in shallow samples was higher than that in deep samples. In shallow high arsenic groundwater, the relative abundance of dsrB gene and the δ34S-SO42– were both significantly positively correlated with the concentration of CH4. In contrast, the relative abundance of dsrB gene showed positive correlations with the concentrations of SO42– and DOC in deep high arsenic groundwater. The high-throughput sequencing of dsrB gene displayed that the α-diversity of sulfate-reducing bacteria in deep groundwater was remarkably higher than that in shallow groundwater. Sulfate-reducing bacteria in the study area were divided into 264 operational taxonomic units (OTUs), including ten predominant orders such as Desulfobacterales, Nitrospirales, Rhodospirillales and Syntrophobacterales. The relative abundance of each order and the environmental factors affecting their abundance were different in shallow or deep groundwater. Specifically, the relative abundance of Nitrospirales in shallow groundwater was positively correlated with the concentrations of AsT and δ34S-SO42–, indicating the key role of Nitrospirales in arsenic migration and transformation in shallow groundwater. The redundancy analysis (RDA) found that AsT, CH4 and Fe2+ were the key environmental factors controlling the distribution of sulfate-reducing bacterial community in groundwater of the study area. [Conclusion] The relative abundance, community composition and diversity of sulfate-reducing bacteria in deep and shallow high arsenic groundwater varied, and were affected by geochemical parameters.
Keywords: high arsenic groundwater    sulfate-reducing bacteria    dsrB gene    high-throughput sequencing    qPCR    

砷(arsenic，As)是一种有毒的类金属元素，在水岩相互作用下，含水层中的砷会溶解进入地下水系统中，造成地下水砷污染[1]。目前国际上将砷含量≥10 μg/L的地下水定义为高砷地下水[2]，在我国，高砷地下水主要分布在内蒙古河套平原、山西大同盆地、湖北江汉平原、台湾等地，受影响人数将近2 000万[3]。近年来，随着对高砷地下水砷形成与转化机制的持续探索，越来越多的研究发现，微生物参与的生物地球化学过程对砷在地下水中的迁移转化起着重要作用。其中，硫酸盐还原菌是参与含水层中砷迁移转化的关键微生物类群之一[4–6]。

硫酸盐还原菌在自然界分布广泛。它是一类能通过异化作用，以有机物作为电子供体，以硫酸盐作为电子受体进行硫酸盐还原的厌氧菌。其还原硫酸盐产生的S2–，能还原Fe(Ⅲ)，导致吸附在铁氧化矿物上的砷释放到地下水中；S2–也能与砷结合生成硫砷矿物，固定地下水中的砷，或与Fe(Ⅱ)结合产生硫化亚铁(FeSx)等能再次吸附砷的次生矿物，从而影响砷在地下水中的迁移[7]。近年来，有学者基于硫酸盐还原菌所共有的dsrB基因(编码异化型亚硫酸盐还原酶亚基)，对高砷环境中的硫酸盐还原菌群落特征开展了研究。前人对高砷酸性矿山废水中硫酸盐还原菌群落特征进行了探究，结果表明硫酸盐还原菌群落的动态变化受pH、铁和砷形态的季节性波动影响较小，以厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势群落[8]；对高砷酸性矿井排水中的微生物多样性的分析结果表明，变形菌门与兼性厚壁菌门是该环境中硫酸盐还原菌主要的类群[9]。前人对地热源高砷水体中微生物群落的组成和功能进行了探究，表明硫酸盐还原是该环境下可培养部分微生物的主要代谢特征之一，其中硫酸盐还原菌主要种属为脱硫杆菌(Desulfobacterales)和脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)，且这2个种属均表现出高度耐砷性[10]。对河套平原高砷地下水的研究表明，活性微生物中包括硫酸盐还原菌，以脱硫球菌科(Desulfobulbaceae)和脱硫孢子菌(Desulfosporosinus)等为主，且硫酸盐还原菌的丰度在山前区较高，而在平原区较低[11]。有学者对河套平原浅层高砷地下水中硫酸盐还原菌的主要种类和丰度进行了初步探究，发现硫酸盐还原菌属于梭菌纲和变形菌纲，且dsrB基因相对丰度与总砷浓度呈正相关，暗示细菌硫酸盐过程可能导致砷释放到地下水中[12]。

目前已有的研究中，对高砷地下水硫酸盐还原菌的分子生态学研究较少，且多是基于16S rRNA基因，并集中在砷浓度较高的浅层地下水，缺乏对同样存在砷污染且水化性质存在差异的深层地下水的认识。因此，本研究拟在前人研究工作的基础上，以我国典型原生高砷地下水分布区—内蒙古河套平原的杭锦后旗作为研究区，选择取自不同深度、具有不同水化特征的地下水样品，通过基于硫酸盐还原功能基因——dsrB基因的高通量测序与定量，分析不同深度地下水中硫酸盐还原菌的群落组成、丰度和多样性。结合水化因子，探究影响硫酸盐还原菌在原位高砷地下水中分布特征的关键环境控制因子。本研究成果揭示了不同深度与水化性质的高砷地下水中硫酸盐还原菌分布特征与差异，为进一步研究微生物对砷迁移转化的作用提供依据。

1 材料与方法 1.1 研究区概况与样品采集

内蒙古自治区是我国地下水砷污染范围最大、暴露人口最多的地区之一[13]。其中，位于内蒙古西部的河套平原就是一个典型的高砷地下水分布区，属于典型的干旱半干旱地区，含水层以承压水和半承压水为主，地下水流向为自西向东[14]，受地质条件影响，用泵抽水和垂向蒸发是地下水排泄的主要方式，地下水中砷最大浓度高达1 000 μg/L以上[15–16]。河套盆地砷中毒区域涉及巴彦淖尔市临河区、杭锦后旗、五原县等11个旗县，影响约30万居民[17]。本文研究区位于地下水砷污染最严重的杭锦后旗。

基于前期研究结果[4, 18–19]，本研究沿地下水流向，采集了杭锦后旗及其周边地区的23个水化性质不同的地下水样品，包括13个浅层地下水和10个深层地下水。具体采样点如图 1所示。浅层样点为压把井，深度介于15–30 m；深层样点为机井，深度介于80–150 m。采用过滤法收集新鲜地下水微生物样品，使用过滤器抽滤约10 L地下水，将微生物收集到醋酸纤维滤膜(0.22 μm×142 mm)上，置于50 mL的无菌离心管后放入低温干冰箱保存，用于后续的基因组提取。过滤后的水样分装于聚乙烯瓶或玻璃瓶中，用于阴阳离子、形态砷、Fe(Ⅱ)、FeT、DOC、CH4、硫酸盐的硫氧同位素等水化参数的测定。采集的地下水水化样品与微生物膜样品迅速运回实验室–20 ℃低温保存，并尽快完成水化参数的测试及相关分子生物学实验。

图 1 采样点图 Figure 1 Sampling sites of groundwater samples.
图选项

1.2 地下水样品地球化学参数测试

水样地球化学参数指标如温度、pH、ORP、DO等用Horiba水质分析仪原位测定。Fe(Ⅱ)、FeT、NO3–、NH4+等氧化还原敏感离子采用便携式Hach DR850分光光度计现场测定。SO42–、NO3–、Cl–、PO43–等阴离子用离子色谱(DIX-120，Dionex)进行测定。硫酸盐的硫、氧同位素在生物地质与环境地质国家重点实验室采用稳定同位素质谱仪(Thermo DELTA V plus，Thermo)完成。CH4测试样品于国家海洋局第三海洋研究所使用气相色谱(Thermo Trace Ultra，Thermo)进行测定。DOC浓度采用TOC分析仪(Vario MICRO cube，Elementar)进行测定。形态砷采用液相色谱-原子荧光联用仪(LC-AFS)测定。

1.3 细菌16S rRNA基因与硫酸盐还原dsrB基因qPCR

将1.1中采集的微生物样品解冻，使用FastDNA®SPIN Kit for Soil (MP BIO Company)试剂盒提取总DNA，其提取过程参照试剂盒提供的操作步骤。

使用引物对515F (5'-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3')扩增细菌16S rRNA基因V4区[20]；使用引物对DSR-p2060F (5'-CAACATCGTYCA YACCCAGGG-3')和DSR-4R (5'-GTGTAGCAG TTACCGCA-3')扩增硫酸盐还原菌功能基因dsrB基因[12]。细菌16S rRNA基因的PCR条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。dsrB基因的PCR条件为94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。分别回收PCR产物后，通过连接转化，构建标准质粒，作为细菌16S rRNA基因与dsrB基因的定量标准。构建的含细菌16S rRNA基因片段与dsrB基因片段的质粒，将其进行等梯度稀释，用于绘制环境样品qPCR使用的标准曲线。

16S rRNA基因与硫酸盐还原dsrB基因的qPCR在ABI 7500 PCR仪中进行。每个样点qPCR体系设置3个平行，每个qPCR反应设置一组3个空白对照。利用ABI PRISM 7500 SDS软件进行数据结果分析。

1.4 dsrB基因高通量测序

使用1.3中提取的环境样品DNA，对dsrB基因进行扩增，以dsrB基因引物DSR-p2060F与DSR-4R为基础，合成正向引物带有不同barcode序列，反向引物与正常PCR引物相同的专用于高通量测序的引物对，用于区分不同样点dsrB基因PCR扩增产物。PCR扩增体系及程序与1.3中相同。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段完整性，检测条带无拖尾、弥散现象，未见杂带。采用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定PCR产物质量浓度，按比例稀释后混合均匀，送往公司进行高通量测序。本研究中高通量测序使用Illumina HiSeq 2500平台(Illumina)进行建库测序，得到长度为380 bp的双端序列。测序工作由艾康健基因技术有限公司(武汉)完成。

1.5 高通量测序数据处理

原始测序数据采用中国科学院生态环境科学研究中心邓晔实验室开发的Galaxy平台进行处理(http://mem.rcees.ac.cn:8080)。使用该平台，根据dsrB基因的barcode序列将测序所得原始数据拆分，将与barcode序列完全匹配的测序序列分配到各个样品。去除引物及barcode序列后，对dsrB基因的双端序列进行拼接，并优化、过滤低质量序列。使用Dotur软件，在97%相似度下对dsrB基因序列进行OTU聚类，并选取每个OTU的代表序列，在NCBI数据库上进行比对，确定各个OTU所属种属。高通量测序所得原始dsrB基因序列已上传至NCBI Sequnece Read Archive (SRA)数据库，登录号为PRJNA781428。

1.6 统计与分析方法

使用OmicStudio云平台(https://www.omicstudio.cn/tool)对研究区内深、浅层硫酸盐还原功能微生物群落组成进行α多样性分析，包括Shannon、Chao1、ACE和Richness指数等。通过冗余分析(RDA)，即约束化的主成分分析，探究研究区深、浅层地下水地球化学参数和目水平硫酸盐还原功能微生物群落之间的相关性。使用IBM SPSS Statistics软件(Ver. 28.0.0.0)进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 高砷地下水水化特征

将现场测试指标与实验室测试指标整合后，研究区主要水化参数测定汇总结果见表 1。浅层地下水样品共13个，除一个样品形态砷浓度低于检出限外，其余样品中AsT浓度在0.76–703.75 μg/L，平均值为278.42 μg/L。As(Ⅲ)浓度在0–589.89 μg/L，平均浓度为215.17 μg/L，占AsT浓度的65%–92%，说明研究区浅层样点地下水中，砷主要以亚砷酸盐的形式存在。深层地下水样品共10个，AsT浓度在23.01–483.18 μg/L，平均值为156.45 μg/L，低于浅层地下水中总砷浓度。研究区深层样点地下水中砷同样以亚砷酸盐为主，As(Ⅲ)浓度在7.79–434.22 μg/L，平均浓度为135.67 μg/L。

表 1. 蒙古河套平原深、浅层地下水主要水化参数 Table 1. Main geochemical parameters of deep and shallow groundwater in Hetao Plain, Inner Mongoli
Sample DO DOC ORP SO42- δ34S-SO42- CH4 SO42-/Cl- AsT As(Ⅲ) As(Ⅴ) AsⅢr NH4+ NO3– d18O/16O Fe2+ FeT
S01 1.0 8.04 -210 369.64 23.2 0.80 0.15 124.78 109.14 15.65 0.87 5.8 1.84 11.91 2.86 3.60
S02 1.1 3.40 -182 589.92 8.54 0.34 0.37 383.63 349.89 33.74 0.91 0.4 12.50 6.94 0.49 1.86
S03 0.6 1.15 -220 153.59 9.76 1.66 0.52 243.83 225.12 18.71 0.92 1.4 5.14 8.61 0.54 0.65
S04 0.8 1.97 26 331.85 10.69 2.64 0.46 3.48 2.63 0.86 0.75 0.4 1.05 10.29 0.23 0.24
S05 0.0 4.10 5 222.59 20.50 4.75 0.14 626.74 419.18 207.56 0.67 5.7 0.20 11.84 0.10 0.20
S06 0.9 23.76 -217 53.00 13.18 4.75 0.12 703.75 589.86 113.89 0.84 9.0 1.73 11.61 1.42 2.67
S07 1.0 1.81 24 375.89 18.49 10.57 0.50 0.76 0.00 0.76 0.00 1.8 1.21 12.82 0.08 0.18
S08 0.9 7.18 -204 130.31 24.42 35.52 0.05 96.11 84.87 11.25 0.88 5.8 1.12 11.82 0.89 1.20
S09 0.9 2.24 -26 374.59 12.30 1.18 0.41 9.18 7.51 1.67 0.82 2.4 1.13 12.18 0.44 0.64
S10 0.8 28.82 -190 82.22 28.36 3.46 0.07 310.23 230.79 79.44 0.74 3.7 1.07 12.85 0.05 1.17
S11 0.5 7.78 -68 13.13 55.82 58.46 0.01 573.56 426.69 146.87 0.74 3.6 1.08 12.19 0.09 1.15
S12 1.0 6.10 -38 527.78 10.76 24.8 0.49 543.43 351.56 191.87 0.65 1.8 11.00 12.03 0.08 0.18
S13 0.4 4.13 118 1 573.02 8.12 0.99 0.33 BD BD BD - 1.6 3.72 10.01 0.02 0.14
D01 0.7 7.32 -163 728.81 16.29 1.97 0.29 220.81 206.50 14.31 0.94 3.3 1.84 12.32 0.89 2.50
D02 0.8 0.37 -214 492.93 6.08 2.36 1.11 32.92 7.79 25.13 0.24 0.7 2.03 9.17 0.04 0.08
D03 0.9 1.13 -194 120.78 23.35 3.05 0.39 216.20 178.72 37.48 0.83 1.7 0.36 13.05 0.94 1.07
D04 0.8 1.53 -160 8.86 31.32 25.09 0.02 483.18 434.22 48.96 0.90 2.2 0.36 9.28 0.08 0.88
D05 0.4 18.07 -180 1 303.37 14.28 0.62 0.36 85.32 60.41 24.91 0.71 4.6 1.95 11.13 0.29 1.48
D06 0.5 5.71 -190 726.16 9.80 2.45 0.29 95.00 86.41 8.59 0.91 4.9 2.16 8.14 1.10 1.87
D07 0.5 1.46 -227 327.32 8.74 1.87 0.75 115.58 105.94 9.64 0.92 1.0 0.76 10.65 1.12 1.63
D08 0.5 1.45 -17 40.66 31.28 0.09 0.06 23.01 11.68 11.33 0.51 1.2 0.45 12.27 0.05 0.15
D09 0.6 1.76 -220 262.35 6.74 4.45 1.57 173.00 162.00 10.00 0.94 0.6 0.77 11.07 0.67 1.23
D10 0.8 1.84 -170 92.63 15.51 3.63 0.32 119.45 103.29 16.16 0.86 0.1 0.39 12.79 1.03 2.82
BD: not detected. Units for CH4, AsT, As(Ⅲ) and As(Ⅴ) are μg/L, while units for SO42–, FeT, Fe2+, DOC, NH4+, NO3– and DO are mg/L.
表选项

前人研究中发现，由于细菌优先使用32S-SO42–，随着硫酸盐的消耗，剩余的硫酸盐富集在34S中，稳定同位素比值的变化幅度一般在千分之几到百分之几的范围内，这种变化通常以相对于标准物质的千分偏差(δ)，表示其相对变化，因此，δ34S-SO42–可作为衡量地下水中微生物硫酸盐还原作用强弱的指标，该参数越大，生物硫酸盐还原作用越强烈[21]。本研究中，对硫同位素与其他水化参数结合进行相关性分析，以探究生物硫酸盐还原强度与水化参数之间的关系。结果如图 2所示，深层高砷地下水中，δ34S-SO42–与AsT浓度呈显著正相关(R=0.857，P≤0.01)，图 2B中展示了浅层地下水中砷浓度与δ34S-SO42–的相关性，可以看出，在浅层δ34S-SO42–与AsT浓度同样具有一定相关性，但趋势较为离散，相关性不如深层显著。如图 2C所示，在浅层样点，δ34S-SO42–与CH4浓度呈显著正相关(R=0.773，P≤0.01)。同时，由图 2D可以看出，在深、浅层地下水中，δ34S-SO42–均与SO42–/Cl–呈显著负相关(深层R=0.750，P≤0.05；浅层R=0.701，P≤0.01)。

图 2 地下水硫酸盐硫同位素与水化参数关系 Figure 2 Correlations between δ34S-SO42– and AsT in deep groundwater (A), AsT in shallow groundwater (B), CH4 in shallow groundwater (C), and SO42–/Cl– in all groundwater samples (D).
图选项

2.2 16S rRNA基因与dsrB基因qPCR结果

选取全部23个地下水样品进行qPCR，其中23个地下水样品成功扩增出了16S rRNA基因，22个地下水样品成功扩增出了dsrB基因。16S rRNA、dsrB基因拷贝数及dsrB基因相对丰度如表 2所示。

表 2. 不同深度地下水中dsrB基因相对丰度 Table 2. Relative abundances of dsrB gene in groundwater with different depth
Sample 16S rRNA gene/(copies/L) dsrB gene/(copies/L) Relative abundance of dsrB gene/%
S01 2.15E+09 3.20E+06 0.15
S02 2.92E+07 7.04E+04 0.24
S03 1.24E+06 4.17E+04 3.37
S04 2.14E+06 3.22E+04 1.50
S05 3.70E+08 7.00E+04 0.02
S06 1.20E+07 4.54E+04 0.38
S07 6.90E+06 1.67E+05 2.42
S08 5.23E+06 4.56E+05 8.72
S09 9.00E+07 8.91E+04 0.10
S10 6.12E+07 1.51E+05 0.25
S11 3.48E+07 2.67E+06 7.68
S12 6.84E+05 3.75E+04 5.48
S13 2.26E+08 4.28E+05 0.19
D01 2.15E+08 2.14E+06 0.99
D02 5.27E+09 BD BD
D03 3.52E+08 2.69E+06 0.76
D04 3.40E+08 2.89E+05 0.08
D05 1.77E+08 3.40E+06 1.92
D06 6.72E+08 6.28E+06 0.93
D07 4.48E+06 2.80E+04 0.62
D08 6.36E+08 2.03E+06 0.32
D09 6.96E+07 9.96E+05 1.43
D10 4.19E+08 4.44E+06 1.06
BD: not detected.
表选项

在河套平原浅层高砷地下水中，16S rRNA基因拷贝数范围为6.84×105–2.15×109 copies/L，dsrB基因拷贝数范围为3.22×104–3.20×106 copies/L，dsrB基因相对丰度范围在0.02%–8.72%之间，与此前针对河套平原浅层高砷地下水的研究[12]相比，16S rRNA基因拷贝数持平，而dsrB基因拷贝数和相对丰度稍高。在深层高砷地下水中，16S rRNA基因拷贝数范围为4.48×105–2.15×108 copies/L，dsrB基因拷贝数范围为2.80×104–6.28×106 copies/L，dsrB基因相对丰度范围为0.08%–1.92%。

深层地下水中的16S rRNA和dsrB基因拷贝数均高于浅层地下水。深层样点16S rRNA基因平均拷贝数为8.16×108 copies/L，浅层地下水中平均拷贝数为2.30×108 copies/L；深层样点dsrB基因平均拷贝数为2.47×106 copies/L，浅层地下水中平均拷贝数为5.74×105 copies/L。

2.3 dsrB基因相对丰度与水化参数相关性

对dsrB基因相对丰度与水化参数结合进行相关性分析。如图 3所示，深层地下水中，dsrB基因相对丰度差别较小(0–1.92%)，平均相对丰度0.90%；而在浅层地下水中，dsrB基因相对丰度较为离散(0.02%–8.72%)，平均相对丰度高于深层样点，为2.34%。浅层样点中dsrB基因相对丰度最高可达8.72%，深层样点dsrB基因最大相对丰度为1.92%，这2个样点的砷浓度都相对较低(AsT≤100 μg/L)，同时ORP较低，均≤–180 mV，为强还原环境。

图 3 高砷地下水中dsrB基因丰度及与水化相关性 Figure 3 The relative abundance of dsrB gene (A) in deep and shallow groundwater, respectively, and its correlations with (B) SO42– concentrations in deep groundwater, (C) DOC concentrations in deep groundwater and (D) CH4 concentrations in shallow groundwater.
图选项

深层高砷地下水中，dsrB基因相对丰度与SO42–、DOC浓度存在显著正相关性(R=0.742，P≤0.05；R=0.722，P≤0.05)。在浅层高砷地下水中，dsrB基因相对丰度与CH4浓度呈显著正相关(R=0.892，P≤0.01)。

2.4 硫酸盐还原菌群落多样性

使用硫酸盐还原功能基因引物DSR-4R/ DSR-p2060F，扩增23个样点DNA的dsrB基因，并将产物送公司进行高通量测序，分析其硫酸盐还原功能群落组成。本次测序共获得15.2万条序列，所有环境样品中，具有硫酸盐还原基因dsrB的微生物共划分为264个可操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，大多数样点覆盖率高于95%，结果较可靠。

对深、浅层样点硫酸盐还原菌群落组成α多样性进行了分析，包括Richness指数、Chao1指数、Ace指数和Shannon指数。深层样点Richness指数范围在36.0–135.0，平均值为93.3；Chao1指数范围在45.0–141.2，平均值为104.8；Ace指数范围在43.5–144.7，平均值为106.0；Shannon指数范围在1.6–3.7，平均值为3.0。浅层样点Richness指数范围在10.0–95.0，平均值为38.9；Chao1指数范围在11.2–111.2，平均值为50.4；Ace指数范围在11.9–118.4，平均值为52.1；Shannon指数范围在2.0–3.6，平均值为2.5。深、浅层样点α多样性的差异性分析中P值均≤0.05，说明深、浅层地下水中的α多样性存在显著差异，深层地下水硫酸盐还原菌的α多样性显著高于浅层地下水。

对深、浅层高砷地下水中，影响硫酸盐还原菌群落组成α多样性的水化参数进行了探究。结果如图 4所示，在深、浅层样点中，影响硫酸盐还原菌α多样性的环境因子存在差异。在深层高砷地下水中，硫酸盐还原菌的α多样性指数与硫酸盐的S、O同位素呈显著正相关。在浅层高砷地下水中，硫酸盐还原菌α多样性与SO42–浓度、ORP、SO42–/Cl–等参数呈显著负相关，与DOC浓度、FeT浓度、NH4+浓度等参数呈显著正相关。

图 4 深层(A)、浅层(B)地下水中硫酸盐还原菌群落组成多样性与水化参数相关性 Figure 4 Correlation between α-diversity of sulfate-reducing bacterial community and geochemical parameters. A: deep groundwater; B: shallow groundwater. *: P≤0.05, **: P≤0.01.
图选项

2.5 硫酸盐还原菌群落组成

对高通量测序获得的序列进行注释，按目(order)划分能注释81.1%的OTUs，如图 5A所示，包括厌氧绳菌目(Anaerolineales)、苔藓菌目(Bryobacterales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、真细菌目(Eubacteriales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、热脱硫菌目(Thermodesulfovibrionales)等10个目。

图 5 河套平原高砷地下水中硫酸盐还原菌群落组成 Figure 5 Community composition of sulfate-reducing bacteria in high As groundwater of Hetao Plain. A: UPGMA cluster tree and microbial composition at the order level; B, C: the average abundances of each order in deep and shallow groundwater samples.
图选项

对深、浅层样点不同种属的平均丰度差异进行对比。如图 5B、C所示，发现深、浅层地下水中，硫酸盐还原菌不同种属的丰度存在一定差异。浅层地下水中Anaerolineales、Bryobacterales、Desulfobacterales、Eubacteriales、Methanosarcinales、Thermodesulfovibrionales的平均丰度高于深层地下水，而Rhodospirillales在深层地下水中平均丰度较高。Nitrospirales、Desulfovibrionales、Syntrophobacterales这3个目在深、浅层平均丰度类似。此外，深层种属划分为unclassified的硫酸盐还原菌比例较高，说明深层地下水中可能存在较多尚未被培养或分类的硫酸盐还原菌。

2.6 深、浅层硫酸盐还原菌群落结构与水化参数相关性

将硫酸盐还原菌各种属相对丰度与研究区水化参数结合进行相关性分析，结果如图 6所示。硫酸盐还原功能种属分布与特定水化因子具有相关性，且在深、浅层具有不同特征。深层样点中，Desulfobacterales的相对丰度与FeT、Fe(Ⅱ)浓度呈显著正相关性，Nitrospirales相对丰度与CH4浓度呈显著正相关。Anaerolineales的相对丰度与NH4+呈显著正相关性。Desulfovibrionales的相对丰度与DOC、SO42–呈显著正相关性。在浅层样点，Nitrospirales的相对丰度与CH4、AsT、As(Ⅴ)、δ34S-SO42–呈正相关，Syntrophobacterales相对丰度与DO呈显著负相关，Desulfovibrionales、Eubacteriales的相对丰度均与FeT、Fe(Ⅱ)呈显著正相关。

图 6 深层(A)、浅层(B)地下水中硫酸盐还原菌组成丰度与水化参数相关性 Figure 6 Correlation between the relative abundances of sulfate-reducing bacterial community and geochemical parameters. A: deep groundwater; B: shallow groundwater. *: P≤0.05, **: P≤0.01.
图选项

RDA分析可以显示不同水化因子与硫酸盐还原菌群落组成之间的关系。经筛选后，如图 7所示，环境因子箭头长短表示其对于微生物群落的影响程度，环境因子箭头间的夹角代表正、负相关性，夹角呈锐角，为正相关，呈钝角，为负相关。物种到环境因子的垂直距离越小，影响越大。第1排序轴与第2排序轴解释度分别为74.62%和14.95%。可见AsT浓度、CH4浓度和Fe2+浓度是控制研究区地下水中硫酸盐还原菌群落分布的关键环境因子，同时AsT浓度与CH4浓度呈现正相关。AsT浓度与CH4浓度对Nitrospirales的分布具有重要影响，而Fe2+浓度对Desulfobacterales的分布具有重要影响。

图 7 目水平硫酸盐还原菌的RDA分析(平均丰度≥2%的目在图中显示) Figure 7 RDA of sulfate-reducing bacteria at order level. Orders with an average abundance ≥2% are shown in the figure.
图选项

3 讨论 3.1 研究区不同深度高砷地下水水化特征

由于研究区高砷地下水ORP较低，为还原型地下水，砷主要以亚砷酸盐的形式存在。深层地下水AsT浓度低于浅层地下水中AsT浓度，这可能是由于浅层地下水受水岩相互作用和人为影响更为强烈，产生的砷污染更为严重[3]。前人对于大同盆地高砷地下水的研究表明，该地区地下水中较高的δ34S-SO42–值是由广泛的生物硫酸盐还原导致的，地下水中δ34S-SO42–随砷浓度上升而升高[21–22]。对于河套高砷地下水的也研究指出，沿地下水流动路径，地下水中δ34S-SO42–上升，平原区地下水中砷浓度与δ34S-SO42–呈正相关，细菌硫酸盐还原是导致这种趋势的主要原因[23]。本研究中，深层高砷地下水中δ34S-SO42–与AsT浓度呈显著正相关，说明在深层样点中，微生物硫酸盐还原过程可能伴随着砷的释放。在浅层δ34S-SO42–与AsT浓度同样具有一定相关性，但趋势较为离散，表明本研究区浅层高砷地下水中砷的释放与生物硫酸盐过程相关，但同时受到多种生物地球化学作用的共同影响。浅层样点，δ34S-SO42–与CH4浓度呈显著正相关，暗示在浅层高砷地下水中，生物硫酸盐还原过程可能与产甲烷过程同时发生，这可能是导致浅层CH4浓度较高的原因。同时，在深、浅层地下水中，δ34S-SO42–均与SO42–/Cl–呈显著负相关，与前人研究结果相似[23]，说明生物硫酸盐还原作用较强的地下水中，硫酸盐浓度较低。

3.2 硫酸盐还原菌相对丰度及其指示意义

深层高砷地下水中，dsrB基因相对丰度与SO42–、DOC浓度存在显著正相关性，说明在深层高砷含水层中，硫酸盐还原菌可能主要以DOC作为碳源和电子供体还原SO42–。以往的研究中，水体SO42–浓度并不一定是影响硫酸盐还原菌相对丰度的关键因子[12, 24–25]，但本研究区深层高砷地下水中，硫酸盐浓度高的样点硫酸盐还原菌相对丰度更高，说明较高浓度的硫酸盐可能有利于硫酸盐还原菌的生长繁殖[26]。

在浅层高砷地下水中，dsrB基因相对丰度与CH4浓度呈显著正相关，结合本研究水化分析部分，浅层样点的δ34S-SO42–与CH4浓度呈显著正相关，暗示浅层高砷地下水中生物硫酸盐还原过程可能与产甲烷过程同时发生。硫酸盐还原菌和产甲烷菌均可以利用乙酸和H2作为基质，所以以往的研究认为它们在一定程度上存在竞争关系。但近年来有研究指出，在氧化还原过渡带水环境中，一些硫酸盐还原菌可以改变代谢途径产生H2并与产甲烷菌扮演互营菌的角色[27–28]，地下水环境中硫酸盐还原菌与产甲烷菌的共生现象也曾被报道过[29]。前人对厌氧发酵影响的研究结果表明，硫酸盐的添加促进了反应器中硫酸盐还原菌降解丙酸的速率，进而减少了丙酸对产甲烷菌的抑制作用，从而促进了产甲烷过程[30]。对越南浅层高砷含水层的研究也指出，在浅层氧化还原过渡带地下水中，发酵产甲烷、SO42–还原与硫氧化过程可能同时发生，从而导致浅层高砷地下水中CH4浓度更高而SO42–浓度更低[31–32]。以上结果说明在本研究区的浅层高砷地下水中，硫酸盐还原菌可能与产甲烷菌存在一定的共生关系。CH4浓度影响硫酸盐还原过程的原因与具体机制还有待进一步探究。

3.3 研究区硫酸盐还原菌群落结构分析

影响深、浅层高砷地下水中硫酸盐还原菌群落α多样性的水化参数存在显著差异，且深层样点硫酸盐还原菌的α多样性显著高于浅层样点，说明深层地下水中硫酸盐还原菌的种属构成更丰富。水化分析结果表明，浅层地下水中AsT浓度显著高于深层地下水，与前人研究中砷浓度较低的地下水中，微生物多样性高于高砷地下水的结论相符[19, 33]。在深层高砷地下水中，硫酸盐还原菌的α多样性指数与硫酸盐的S、O同位素呈显著正相关，说明在生物硫酸盐还原过程更强的样点中，硫酸盐还原菌的α多样性更高，种属构成更丰富。在浅层高砷地下水中，硫酸盐还原菌α多样性与SO42–浓度、ORP、SO42–/Cl–呈显著负相关，与DOC浓度、FeT浓度、NH4+浓度等呈显著正相关，表明在高硫酸盐含量的浅层样点中，硫酸盐还原菌种属构成更单一，而有机质含量较高的浅层样点，硫酸盐还原菌种属构成更丰富。

研究区高砷地下水中的硫酸盐还原菌包括Desulfobacterales、Nitrospirales、Rhodospirillales、Syntrophobacterales等9个目，其中Desulfobacterales与Nitrospirales相对占比最高，说明研究区地下水中的硫酸盐还原菌以这2个目为主。Desulfobacterales是典型的脱硫菌属，在海洋、湖泊、地下水等水体中广泛存在，是被用于砷污染生物修复的主要种属之一[7]。Nitrospirales属于硝化细菌，能通过硝化作用将氨转化为亚硝酸盐，再进一步转化为硝酸盐。已有研究表明部分种属的Nitrospirales具有硫酸盐还原功能[34–35]，且具有一定的耐砷功能，是砷污染尾矿废水中的优势种属之一[36]，河套平原高砷地下水中也曾报道过硝化螺旋菌的存在[37–38]。不同目的硫酸盐还原菌在深浅、层的相对丰度存在一定差异。

硫酸盐还原功能种属分布与特定水化因子具有相关性，且在深、浅层具有不同特征。深层样点中，Anaerolineales的相对丰度与NH4+呈显著正相关性，与前人研究结果类似[39–40]，在深层地下水中，Anaerolineales可能在进行硫酸盐还原的同时进行氨氧化。Desulfovibrionales的相对丰度与DOC、SO42–呈显著正相关性。在浅层样点，Nitrospirales的相对丰度与CH4、AsT、As(Ⅴ)、δ34S-SO42–呈正相关，Syntrophobacterales相对丰度与DO呈显著负相关，Desulfovibrionales、Eubacteriales的相对丰度均与FeT、Fe(Ⅱ)呈显著正相关。以上结果说明，在砷浓度更高的浅层地下水中，硫酸盐还原菌中的Nitrospirales类群在砷的迁移转化中可能起到关键作用，并且这种作用可能与甲烷代谢相关。

RDA分析结果显示AsT浓度、CH4浓度和Fe2+浓度是控制研究区硫酸盐还原菌群落分布的关键环境因子，同时AsT浓度与CH4浓度呈现正相关，这与前人的研究中产甲烷作用可能加速河套平原地下水中砷的释放的结论一致[6]。

4 结论

不同含水层高砷地下水中硫酸盐还原菌的丰度、α多样性和群落结构均不同。浅层高砷地下水中dsrB基因相对丰度高于深层地下水，丰度与CH4浓度呈显著正相关；而深层高砷地下水中dsrB基因相对丰度与SO42–、DOC浓度存在显著正相关性。深层地下水中硫酸盐还原菌的α多样性显著高于浅层，多样性与DOC浓度、NH4+浓度、δ34S-SO42–等理化因子呈正相关。研究区中硫酸盐还原菌以Desulfobacterales、Nitrospirales、Rhodospirillales、Syntrophobacterales这4个平均相对丰度≥2%的目为主。其中浅层样点中Nitrospirales的相对丰度与CH4浓度、AsT浓度、As(Ⅴ)浓度、δ34S-SO42–正相关，指示出硫酸盐还原菌中Nitrospirales类群在砷的迁移转化中可能起到关键作用。总体来说，AsT浓度、CH4浓度和Fe2+浓度是控制研究区地下水中硫酸盐还原菌群落分布的关键环境因子。

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河套平原不同深度高砷地下水硫酸盐还原菌群落分布特征及环境意义
成语 , 宋腾龙 , 田雪歌 , 王艳红