2022, Vol. 62
表1(Table 1)
利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210664
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 孙伟, 罗倩, 张薇, 吕霁烊, 祝新德, 许杰, 张风丽. 2022
- SUN Wei, LUO Qian, ZHANG Wei, LV Jiyang, ZHU Xinde, XU Jie, ZHANG Fengli.
- 利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物
- Characterization of the ribosomal protein biomarkers of Actinobacteria via genomics and MALDI-TOF MS techniques
- 微生物学报, 62(7): 2671-2685
- Acta Microbiologica Sinica, 62(7): 2671-2685
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文章历史
- 收稿日期：2021-11-02
- 修回日期：2022-01-15
- 网络出版日期：2022-02-16
引用本文 |
孙伟, 罗倩, 张薇, 吕霁烊, 祝新德, 许杰, 张风丽. 利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物[J]. 微生物学报, 2022, 62(7): 2671-2685.
Sun Wei, Luo Qian, Zhang Wei, Lv Jiyang, Zhu Xinde, Xu Jie, Zhang Fengli. Characterization of the ribosomal protein biomarkers of Actinobacteria via genomics and MALDI-TOF MS techniques[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(7): 2671-2685.
利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物
上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240
摘要：[目的] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法基于微生物的特征蛋白指纹图谱鉴定菌种，本研究利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物。[方法] 从MALDI-TOF MS图谱数据库选取放线菌纲代表菌种，在基因组数据库检索目标菌种，获取目标菌株或其参比菌株的核糖体蛋白质序列，计算获得分子质量理论值，用于注释目标菌株MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号。[结果] 从8目，24科，53属，114种，142株放线菌的MALDI-TOF MS图谱中总共注释出31种核糖体蛋白质。各菌株的指纹图谱中核糖体蛋白质信号数量差异显著。各种核糖体蛋白质信号的注释次数差异显著。总共15种核糖体蛋白质在超过半数图谱中得到注释，注释次数最高的是核糖体大亚基蛋白质L36。[结论] 本研究找到了放线菌纲细菌MALDI-TOF MS图谱中常见的15种核糖体蛋白质信号，可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 放线菌纲 核糖体蛋白质 标志物 质谱注释
Characterization of the ribosomal protein biomarkers of Actinobacteria via genomics and MALDI-TOF MS techniques
School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: [Objective] Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technique provides mass spectral fingerprints of characteristic proteins for microbial identification. This study aims to characterize the ribosomal protein biomarkers from Actinobacteria via genomics and MALDI-TOF MS techniques. [Methods] Actinobacteria representatives were chosen from MALDI-TOF MS spectral library. By searching against genome database, we acquired the ribosomal protein sequences from the target or reference strains of target species and calculated the theoretical molecular masses. The mass peaks in the MALDI-TOF mass spectra of target strains were annotated with the calculated molecular masses of ribosomal proteins. [Results] Mass peaks annotated in the spectra of 142 strains of 114 species, 53 genera, 24 families from 8 orders were assigned to 31 ribosomal proteins. The number of annotated ribosomal proteins varied significantly among strains. The number of mass peak annotations also varied considerably among different subunit proteins. A total of 15 ribosomal proteins were annotated in over half of the spectra, and the ribosomal protein with the most mass peak annotations was L36. [Conclusion] This study identified 15 common ribosomal protein mass peaks in MALDI-TOF mass spectra of Actinobacteria. The results can support the establishment of a method for the identification of Actinobacteria by matching characteristic mass peaks of ribosomal protein biomarkers in MALDI-TOF mass spectra.
Keywords:
MALDI-TOF MS Actinobacteria ribosomal protein biomarker annotation of mass peaks
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)指纹图谱法是一种新兴的微生物鉴定方法，具有简单、快速、高通量等优势，已应用于临床诊断、环境监测和食品安全等领域[1–6]。这一方法建立在MALDI-TOF MS法测量微生物稳定表达的高丰度蛋白质(如核糖体蛋白质)的基础上[7–8]。采集样品的MALDI-TOF MS图谱，通过比对数据库中已知菌种的指纹图谱获得鉴定结果，鉴定准确性依赖于图谱数据库的完善性与可靠性。目前，商业数据库(如德国布鲁克的MALDI Biotyper数据库、法国梅里埃的VITEK MS数据库)收录环境微生物的指纹图谱较少，限制了其在环境微生物鉴定中的应用[9]。为了解决这一问题，厂商提供了一套标准化自建库方法，其流程包括菌株收集、培养、前处理、图谱采集、质量控制和方法验证，但标准化建库方法对技术要求严格，而且操作繁琐，费用高昂，限制了其进一步推广[10]。因此，需要开发更高效、经济的微生物质谱鉴定方法，以扩展其应用范围。
近年来不依赖图谱数据库的MALDI-TOF MS法鉴定微生物引起人们关注。这一方法建立在从目标菌种的基因组/蛋白质组序列中获取生物标志物的序列并预测分子质量基础上[11]。采集样品的MALDI-TOF MS图谱，通过识别生物标志物的质谱特征峰鉴定菌种。细菌全基因组测序技术的普及为细菌基因组数据挖掘及重要基因的功能分析构建了全面的研究平台，也为这一方法的探索创造了有利条件。核糖体蛋白质是参与构成核糖体的所有蛋白质的统称，包括小亚基和大亚基核糖体蛋白质，分别以SX和LX (X为数字)命名[12]。核糖体蛋白质呈现高度的保守性，是一类重要的生物标志物。江文静等以13种核糖体蛋白质作为生物标志物，以MALDI-TOF MS为测试手段鉴定了蓝藻样品中的模式藻株铜绿微囊藻[13]。Cheng等使用10种蛋白质(包括8种核糖体蛋白质)作为生物标志物，通过MALDI-TOF MS分析实现了8个常见细菌属菌种的鉴定[14]。Kostas和Parker选择65种蛋白质(包括52种核糖体蛋白质)作为生物标志物，通过MALDI-TOF MS分析实现了弧菌目和环境样品中一些菌种的鉴定[15]。这些研究表明选择合适的生物标志物，可以对环境中特定类群的微生物实现快速、准确鉴定，显示出这一方法广阔的应用前景。
放线菌纲是一个常见的细菌类群，种类多样，分布广泛，在自然界物质循环中发挥重要作用，还是产生抗生素类药物及其他活性物质的重要资源[16]。目前应用MALDI-TOF MS方法鉴定环境放线菌的研究很少。我们应用MALDI-TOF MS图谱比对法对土壤、淤泥、海洋沉积物等环境来源的放线菌进行鉴定时发现得到可信鉴定结果的菌株比例低，一般占测试菌株总数的10%–30%。MALDI Biotyper数据库收录的放线菌纲细菌达457种，但种类以致病菌为主，是环境放线菌鉴定成功率低的主要原因。目前，基因组数据库收录的放线菌纲细菌达2 700余种并且来源广泛，并不限于致病菌，可获得从菌株基因组注释出的核糖体蛋白质序列。因此，本研究基于全基因组测序和核糖体蛋白质基因注释，对MALDI Biotyper数据库中114种放线菌纲细菌MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号进行注释，寻找可用于放线菌鉴定的核糖体蛋白质标志物，以期为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。
1 材料与方法 1.1 MALDI-TOF MS图谱数据库及菌种选取MALDI Biotyper数据库(Bruker MBT DB7854)购自德国布鲁克公司，涵盖放线菌纲8目，27科，60属，457种。从数据库选取8目，24科，53属，114种，142株放线菌(表 1)注释其指纹图谱中的核糖体蛋白质信号。
表 1. 从MALDI Biotyper数据库选取的放线菌及其质谱的核糖体蛋白质信号注释数
Table 1. The number of ribosomal protein (RP) mass peaks annotated in the MALDI-TOF mass spectra of various Actinobacteria chosen from MALDI Biotyper Database
| Order | Family | Genus | Number of species | Number of strains | Number of annotated RPs | Average number of annotated RPs |
| Actinomycetales | Actinomycetaceae | Actinobaculum | 2 | 2 | 38 | 19 |
| Actinomyces | 3 | 8 | 96 | 12 | ||
| Arcanobacterium | 2 | 2 | 27 | 14 | ||
| Varibaculum | 1 | 1 | 3 | 3 | ||
| Mobiluncus | 1 | 1 | 16 | 16 | ||
| Streptomycetales | Streptomycetaceae | Streptomyces | 7 | 7 | 92 | 13 |
| Kitasatospora | 1 | 1 | 19 | 19 | ||
| Streptosporangiales | Nocardiopsaceae | Nocardiopsis | 1 | 1 | 8 | 8 |
| Micromonosporales | Micromonosporaceae | Micromonospora | 5 | 7 | 95 | 14 |
| Pseudonocardiales | Pseudonocardiaceae | Pseudonocardia | 1 | 1 | 15 | 15 |
| Amycolatopsis | 5 | 5 | 75 | 15 | ||
| Saccharopolyspora | 2 | 2 | 31 | 16 | ||
| Lentzea | 1 | 1 | 13 | 13 | ||
| Mycobacteriales | Corynebacteriaceae | Corynebacterium | 5 | 5 | 74 | 15 |
| Dietziaceae | Dietzia | 3 | 3 | 15 | 5 | |
| Mycobacteriaceae | Mycobacterium | 4 | 4 | 36 | 9 | |
| Nocardiaceae | Nocardia | 3 | 4 | 61 | 15 | |
| Rhodococcus | 3 | 4 | 54 | 14 | ||
| Gordoniaceae | Gordonia | 3 | 6 | 70 | 12 | |
| Tsukamurellaceae | Tsukamurella | 1 | 5 | 35 | 7 | |
| Micrococcales | Micrococcaceae | Micrococcus | 3 | 7 | 93 | 13 |
| Arthrobacter | 3 | 3 | 47 | 16 | ||
| Kocuria | 3 | 5 | 74 | 15 | ||
| Rothia | 3 | 3 | 50 | 17 | ||
| Microbacteriaceae | Microbacterium | 3 | 4 | 54 | 14 | |
| Agrococcus | 3 | 3 | 48 | 16 | ||
| Agromyces | 3 | 3 | 36 | 12 | ||
| Curtobacterium | 2 | 2 | 24 | 12 | ||
| Leifsonia | 1 | 1 | 17 | 17 | ||
| Clavibacter | 1 | 1 | 14 | 14 | ||
| Pseudoclavibacter | 1 | 1 | 11 | 11 | ||
| Leucobacter | 2 | 2 | 31 | 16 | ||
| Rathayibacter | 1 | 1 | 13 | 13 | ||
| Brevibacteriaceae | Brevibacterium | 3 | 4 | 53 | 13 | |
| Cellulomonadaceae | Cellulomonas | 3 | 3 | 44 | 15 | |
| Dermabacteraceae | Brachybacterium | 3 | 4 | 36 | 9 | |
| Dermabacter | 1 | 2 | 27 | 14 | ||
| Dermacoccaceae | Dermacoccus | 1 | 1 | 12 | 12 | |
| Kytococcaceae | Kytococcus | 2 | 2 | 24 | 12 | |
| Dermatophilaceae | Dermatophilus | 1 | 1 | 9 | 9 | |
| Arsenicicoccus | 1 | 1 | 18 | 18 | ||
| Intrasporangiaceae | Janibacter | 1 | 1 | 12 | 12 | |
| Terrabacter | 1 | 1 | 10 | 10 | ||
| Jonesiaceae | Jonesia | 1 | 2 | 14 | 7 | |
| Promicromonosporaceae | Cellulosimicrobium | 1 | 1 | 14 | 14 | |
| Oerskovia | 1 | 1 | 14 | 14 | ||
| Propionibacteriales | Propionibacteriaceae | Luteococcus | 1 | 1 | 17 | 17 |
| Propionibacterium | 3 | 3 | 31 | 10 | ||
| Propioniferax | 1 | 2 | 17 | 9 | ||
| Propionimicrobium | 1 | 1 | 12 | 12 | ||
| Tessaracoccus | 1 | 1 | 16 | 16 | ||
| Nocardioidaceae | Aeromicrobium | 2 | 2 | 13 | 7 | |
| Nocardioides | 2 | 2 | 12 | 6 |
1.2 基因组数据库及核糖体蛋白质序列提取
美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)收录了2 700余种放线菌纲细菌的参考基因组信息，涵盖大多数已知菌种，从中检索114个目标菌种，挑选目标菌株或其参比菌株(与目标菌株同种的其他菌株)。在菌株基因组组装与注释报告的蛋白质编码基因(protein coding genes，CDS)栏汇总了NCBI原核基因组注释系统(Prokaryotic Genome Annotation Pipeline，PGAP)注释出的蛋白质信息[17]，从中检索核糖体蛋白质并提取序列。
1.3 核糖体蛋白质序列分析在生物体内核糖体合成的前体蛋白需进行一系列翻译后加工、修饰才能成为具有功能的成熟蛋白。为了准确预测核糖体蛋白质分子质量，必须考虑可能的翻译后加工、修饰等因素。原核生物普遍存在的一种翻译后加工是N-端起始甲硫氨酸的切除[18–19]，当N-端的第二个氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸时，起始甲硫氨酸被切除，当N-端的第二个氨基酸是其他氨基酸时，起始甲硫氨酸不被切除。分析核糖体蛋白质序列，如符合切除规则，用去除起始甲硫氨酸的序列计算分子量，否则用初始序列计算分子量。
1.4 核糖体蛋白质理论分子量计算应用蛋白质基本性质分析工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)[20]计算核糖体蛋白质平均分子量作为分子量理论值。
1.5 MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号注释基于目标菌株或其参比菌株各种核糖体蛋白质的分子质量理论值进行目标菌株的质谱注释。蛋白质通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)产生带一个电荷的阳离子[M+H]+，有时产生带两个电荷的阳离子[M+2H]2+[7–8]，质谱注释时需考虑蛋白质电离后带一个和两个电荷的情况。此外，一些原核生物的个别核糖体蛋白质会发生甲基化(如L33、S11)或乙酰化(如S18)修饰[7, 15]，导致理论分子量增加14或42 Da，质谱注释时需注意这些修饰造成的分子量变化。
考虑到MALDI-TOF MS质谱仪线性模式下的测量精度，将蛋白质分子离子m/z的最大质量误差设为±500 ppm[15]。若质量轴偏移，适当提高最大质量误差，但不超过±800 ppm。若质谱中有m/z处在某种核糖体蛋白质分子量理论值M+1或(M+2)/2的误差范围内，则将该数值注释为对应的核糖体蛋白质信号，并记录m/z丰度(相对百分比)及其在峰列表中的排序。依次进行目标菌株的质谱注释并统计各菌株图谱中注释的核糖体蛋白质信号数量以及各种核糖体蛋白质信号在分析菌株中的出现次数。
1.6 测试菌株为测试前文分析未涉及的放线菌纲菌种MALDI-TOF MS图谱中目标核糖体蛋白质信号的出现情况，选取从土壤样本中分离的3个菌株进行MALDI-TOF MS测试和分析，包括根际动球菌(Kineococcus rhizosphaerae) D24 (16S rRNA基因序列GenBank注册号：OL519199，与模式菌株K. rhizosphaerae DSM 19711T的序列相似度为99.28%)、江西伦茨菌(Lentzea jiangxiensis) 3-5 (OL519200，与模式菌株L. jiangxiensis CGMCC 4.6609T的序列相似度为99.63%)和食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans) 4-12 (OL519201，与模式菌株R. aetherivorans DSM 44752T的序列相似度为99.93%)。
1.7 菌株蛋白提取取待测微生物样本(来自单个菌落，取一个接种环的量)转移到盛有20 µL 70%甲酸水溶液的1.5 mL Eppendorf管中，用移液枪反复吹打，涡旋充分混匀。加入20 µL乙腈，用移液枪反复吹打。13 000 r/min离心2 min。将1 µL微生物提取物上清液移取到靶板上，室温晾干。将1 µL α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质溶液滴加覆盖样本，室温晾干。
1.8 MALDI-TOF MS测试基质辅助激光解析高分辨飞行时间质谱成像系统(MALDI TOF，ultraflextreme)购自德国布鲁克公司。使用控制软件flexControl 3.4采集质谱图，仪器测定参数：采集质荷比(m/z)为4 000–12 000；激光点击数1 000；测定模式为阳离子线性模式。使用分析软件flexAnalysis 3.4处理质谱图并标峰。
1.9 测试菌株的核糖体蛋白质鉴定按前文所述方法从NCBI基因组数据库提取3个参比菌株(K. rhizosphaerae DSM 19711T、L. jiangxiensis CGMCC 4.6609T和R. aetherivorans PSBB011)的15种目标核糖体蛋白质(L36、L35、L34、L33、L32、L31、L30、L29、L28、L27、S20、S19、S18、S15和S14)序列并计算其分子质量理论值，注释3个测试菌株MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号并统计注释出的信号数量。
2 结果与分析 2.1 MALDI-TOF MS指纹图谱数据分析MALDI Biotyper数据库中菌株的MALDI-TOF MS指纹图谱数据以峰列表形式呈现，一般包含70或80个峰的信息，包括质荷比m/z、丰度、权重、出现频率等(表 2)。对142个菌株的质谱峰列表分析发现m/z范围在3 000–14 000，以10 000以下的峰居多，10 000以上的峰数目较少，可能与样品制备时使用的基质为HCCA有关[8]。质谱峰以单电荷峰为主，但不乏一些双电荷峰存在，尤其是高丰度蛋白质，可同时产生单电荷和双电荷峰。
表 2. MALDI Biotyper数据库中菌株质谱峰列表(以藤黄微球菌M. luteus DSM 1790为例)
Table 2. The peak lists obtained from the mass spectra of the strains in the MALDI Biotyper Database (using M. luteus DSM 1790 as an example)
| m/z | Intensity/% | Weight/% | Frequency/% | In peak lists |
| 5 923.33 | 61.41 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 5 964.91 | 6.67 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 061.45 | 27.05 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 114.05 | 18.33 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 193.93 | 10.22 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 246.00 | 75.08 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 385.35 | 6.62 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 429.87 | 93.14 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 538.60 | 7.63 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 778.08 | 13.55 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 6 884.48 | 16.32 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 233.45 | 50.26 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 316.53 | 6.52 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 386.13 | 67.86 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 577.98 | 8.55 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 624.90 | 11.17 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 7 932.02 | 8.38 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 8 107.38 | 48.69 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 8 354.55 | 24.36 | 100.00 | 100.0 | 24 |
| 8 418.95 | 29.10 | 100.00 | 100.0 | 24 |
2.2 核糖体蛋白质检索及序列分析
从NCBI基因组数据库放线菌纲菌种的注释蛋白质列表中可检索到54种核糖体蛋白质[21]，包括50S核糖体大亚基蛋白质34种(L1–L7、L9–L25和L27–L36)以及30S核糖体小亚基蛋白质20种(S1–S20)，其中一些核糖体蛋白质有多种类型，如L31和S14，前者有L31和L31-B两种类型，后者有S14-Z和S14两种类型。大多数菌株可从其基因组注释出L31、L31-B、S14-Z和S14，而5个科(棒杆菌科、迪茨氏菌科、微球菌科、微杆菌科和短杆菌科)的菌株注释出L31-B和S14。此外，注释出的部分核糖体蛋白质有2个甚至多个序列，如L36、L33、L32、L31、L28和S18等，这种情况下将这些序列全部提取计算分子量。序列分析发现大多数核糖体蛋白质符合N-端起始甲硫氨酸切除规则，只有少数例外，如L36的N-端第二个氨基酸通常是赖氨酸，N-端起始甲硫氨酸不切除。
2.3 MALDI-TOF MS指纹图谱核糖体蛋白质信号注释142个放线菌纲菌株MALDI-TOF MS指纹图谱的核糖体蛋白质信号注释结果见附表1，信号数量统计结果见附表2。
结果表明97个菌株的质谱中核糖体蛋白质峰的质量误差范围为−500–+500 ppm。另外45个菌株的质谱因质量轴偏移导致误差范围改变，如048混浊红球菌(Rhodococcus opacus) DSM 43251质谱中各个核糖体蛋白质峰的实测值均比理论值低，误差范围为−700–−100 ppm，075苏别蒂山农霉菌(Agromyces subbeticus) HKI 340_DSM 16689T质谱中各个核糖体蛋白质峰的实测值均比理论值高，误差范围为0–+700 ppm。为了不遗漏核糖体蛋白质信号，对这类质谱调整误差范围后进行注释。
质谱注释发现29个菌株的质谱中出现不同核糖体蛋白质m/z接近的情况，包括两种核糖体蛋白质的单电荷峰m/z接近以及一种核糖体蛋白质的单电荷峰和另一种核糖体蛋白质的双电荷峰m/z接近(表 3)。以001马赛放杆菌(Actinobaculum massiliense) FC3为例，L33和L30的理论分子量分别为6 436.37 Da和6 435.44 Da，对于质谱中m/z 6 436.23的峰，无法判断其匹配两种(L33和L30)还是一种蛋白质(L33或L30)。以010栗褐链霉菌(Streptomyces badius) B192 UFL为例，S14-Z和S12的理论分子量分别为6 818.14 Da和13 639.83 Da，对于质谱中m/z 6 821.29的峰，无法判断其匹配两种(S14-Z的单电荷峰和S12的双电荷峰)还是一种蛋白质(S14-Z的单电荷峰或S12的双电荷峰)。为了不遗漏核糖体蛋白质信号，将这类m/z注释为两种核糖体蛋白质。
表 3. 质谱中一个m/z匹配两种核糖体蛋白质分子离子的菌株
Table 3. The list of the strains in the mass spectra of which one m/z matched two ribosomal protein ions
| Strain | Ribosomal protein ion | Theoretical mass (m/z) | Experimental mass (m/z) | Error | |
| Da | ppm | ||||
| Actinobaculum massiliense ME0003421_c LDW | L30+ | 6 436.44 | 6 436.23 | –0.21 | –33 |
| L33+ | 6 437.37 | –1.14 | –177 | ||
| Kitasatospora phosalacinea HKI 222 HKJ | L27+ | 8 810.89 | 8 812.34 | 1.45 | 165 |
| S18+ | 8 813.30 | –0.96 | –109 | ||
| L30+ | 6 825.83 | 6 826.90 | 1.07 | 157 | |
| S122+ | 6 828.45 | –1.55 | –226 | ||
| Mycobacterium gordonae 0714 BSI | L32+ | 6 350.47 | 6 349.73 | –0.74 | –117 |
| L33+ | 6 351.29 | –1.56 | –246 | ||
| Nocardia araoensis DSM 44729T | L33+ | 6 493.45 | 6 493.29 | –0.16 | –25 |
| L30+ | 6 495.51 | –2.22 | –342 | ||
| Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117T | L28+ | 8 583.98 | 8 585.21 | 1.23 | 143 |
| S18+ | 8 584.13 | 1.08 | 126 | ||
| Arthrobacter stackebrandtii DSM 16005T | L27+ | 8 844.00 | 8 847.32 | 3.32 | 375 |
| S20+ | 8 845.28 | 2.04 | 231 | ||
| Kocuria marina CICC 23948 | L19+ | 13 531.47 | 13 532.33 | 0.86 | 64 |
| S12+ | 13 531.94 | 0.39 | 29 | ||
| Kocuria marina CICC 24030 | L19+ | 13 531.47 | 13 529.70 | –1.77 | –131 |
| S12+ | 13 531.94 | –2.24 | –166 | ||
| Agromyces hippuratus HKI 11533_DSM 8598T | S18+ | 9 222.75 | 9 225.89 | 3.14 | 340 |
| S20+ | 9 224.69 | 1.2 | 130 | ||
| Brevibacterium marinum DSM 18964T | L31-B+ | 9 546.75 | 9 548.13 | 1.38 | 144 |
| S20+ | 9 548.93 | –0.8 | –84 | ||
| Oerskovia turbata B258 UFL | L27+ | 8 814.83 | 8 816.09 | 1.26 | 143 |
| L29+ | 8 818.02 | –1.93 | –219 | ||
| Arsenicicoccus bolidensisDSM 15745T | L28+ | 6 801.91 | 6 803.96 | 2.05 | 301 |
| S14-Z+ | 6 807.08 | –3.12 | –459 | ||
| Aeromicrobium massiliense DSM 25782T | L33+ | 6 661.64 | 6 661.32 | –0.32 | –48 |
| L30+ | 6 661.66 | –0.34 | –51 | ||
| Streptomyces badius B192 UFL | S14-Z+ | 6 819.14 | 6 821.29 | 2.15 | 315 |
| S122+ | 6 820.92 | 0.37 | 55 | ||
| Streptomyces chartreusis HKI 249 HKJ | S14-Z+ | 6 819.14 | 6 818.05 | –1.09 | –160 |
| S122+ | 6 820.92 | –2.87 | –420 | ||
| Streptomyces galilaeus HKI 22 HKJ | S14-Z+ | 6 819.14 | 6 819.58 | 0.44 | 65 |
| S122+ | 6 820.92 | –1.34 | –196 | ||
| Streptomyces phaeochromogenes B265 UFL | S14-Z+ | 6 819.14 | 6 821.71 | 2.57 | 377 |
| S122+ | 6 820.92 | 0.79 | 117 | ||
| Streptomyces violaceoruber B263 UFL | S14-Z+ | 6 819.14 | 6 820.14 | 1.00 | 147 |
| S122+ | 6 820.92 | –0.78 | –114 | ||
| Micromonospora viridifaciens DSM 43909T | L34+ | 5 198.04 | 5 197.81 | –0.23 | –44 |
| S172+ | 5 199.54 | –1.73 | –332 | ||
| L30+ | 6 829.94 | 6 830.62 | 0.68 | 100 | |
| S122+ | 6 829.97 | 0.65 | 95 | ||
| Saccharopolyspora erythraea HKI 184 HKJ | L28+ | 6 790.91 | 6 789.25 | –1.66 | –244 |
| S122+ | 6 788.40 | 0.85 | 125 | ||
| Rhodococcus yunnanensis DSM 44837T | L28+ | 6 645.66 | 6 642.18 | –3.48 | –524 |
| L7/L122+ | 6 641.59 | 0.59 | 89 | ||
| Gordonia rubripertincta DSM 43197T | S14-Z+ | 6 775.08 | 6 771.93 | –3.15 | –465 |
| S132+ | 6 772.35 | –0.42 | –62 | ||
| Gordonia rubripertincta DSM 46066 | S14-Z+ | 6 775.08 | 6 774.13 | –0.95 | –140 |
| S132+ | 6 772.35 | 1.78 | 263 | ||
| Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius DSM 20741T | L33+ | 6 484.45 | 6 484.92 | 0.47 | 72 |
| L192+ | 6 485.52 | –0.6 | –92 | ||
| Pseudoclavibacter helvolus DSM 20419T | L33+ | 6 558.62 | 6 560.70 | 2.08 | 317 |
| S62+ | 6 558.91 | 1.79 | 273 | ||
| Dermacoccus nishinomiyaensis DSM 20448T | L34+ | 5 192.08 | 5 192.77 | 0.69 | 133 |
| S192+ | 5 194.46 | –1.69 | –325 | ||
| Janibacter limosus DSM 11140T | L33+ | 6 486.45 | 6 483.43 | –3.02 | –466 |
| L182+ | 6 482.46 | 0.97 | 150 | ||
| Terrabacter tumescens DSM 20308T | L30+ | 6 643.64 | 6 643.81 | 0.17 | 26 |
| L222+ | 6 644.64 | –0.83 | –125 | ||
| Nocardioides simplex DSM 20130T | L32+ | 6 627.69 | 6 626.42 | –1.27 | –192 |
| L7/L122+ | 6 628.56 | –2.14 | –323 | ||
质谱注释核糖体蛋白质L33时发现链霉菌科菌株(6株链霉菌和1株北里孢菌)和皮杆菌科菌株(2株短状杆菌和2株皮杆菌)出现与其他菌株不同的情况，其质谱中均缺少与L33理论分子量相匹配的m/z，但出现比理论值增加了14±2的m/z (表 4)。鉴于有研究发现了一些原核生物中核糖体蛋白质L33的甲基化修饰现象[7–8]，推测这些菌株的L33发生甲基化修饰并将这些m/z注释为L33。
表 4. 核糖体蛋白质L33可能发生甲基化修饰的菌株
Table 4. The list of the strains whose subunit L33 was likely methylated
| Family | Strain | L33 [M+H]+ | ||
| Theoretical mass (m/z) | Experimental mass (m/z) | Error/Da | ||
| Streptomycetaceae | Streptomyces badius B192 UFL | 6 292.24 | 6 307.07 | 14.83 |
| Streptomyces chartreusis HKI 249 HKJ | 6 276.24 | 6 288.49 | 12.25 | |
| Streptomyces galilaeus HKI 22 HKJ | 6 294.27 | 6 307.36 | 13.09 | |
| Streptomyces lavendulae B264 UFL | 6 310.27 | 6 325.01 | 14.74 | |
| Streptomyces phaeochromogenes B265 UFL | 6 276.24 | 6 292.15 | 15.91 | |
| Streptomyces violaceoruber B263 UFL | 6 276.24 | 6 289.77 | 13.53 | |
| Kitasatospora phosalacinea HKI 222 HKJ | 6 293.22 | 6 305.18 | 11.96 | |
| Dermabacteraceae | Brachybacterium faecium DSM 4810T | 6 295.26 | 6 307.24 | 11.98 |
| Brachybacterium muris 7 RLT | 6 329.29 | 6 341.98 | 12.69 | |
| Dermabacter hominis DSM 7083T | 6 329.27 | 6 341.89 | 12.62 | |
| Dermabacter hominis 13099930_2_g MVD | 6 329.27 | 6 343.19 | 13.92 | |
对于存在2种类型的核糖体蛋白质L31和S14，大多数菌株的质谱中注释出L31和S14-Z，极少注释出L31-B和S14，而L31和S14-Z缺失的微球菌科和微杆菌科菌株的质谱中普遍注释出L31-B和S14。这一结果表明放线菌纲细菌基因组中一些核糖体蛋白质存在2套基因，当其中1套缺失时，另一套会表达合成核糖体蛋白质。
质谱注释显示各类群放线菌的MALDI-TOF MS指纹图谱中核糖体蛋白质信号数量差异显著。从属水平分析，各属菌株的质谱中注释出的核糖体蛋白质平均数量差异显著(表 1)，最多高达19种(放杆菌和北里孢菌)，最少仅3种(弯曲短杆菌)。53个分析属中51个属注释出的核糖体蛋白质平均数量不少于6种，另外2个(迪茨氏菌和弯曲短杆菌)注释出的平均数量少于6种。从菌株水平分析，不同菌株的质谱中注释出的核糖体蛋白质数量差异显著，最多高达20种[001马赛放杆菌(Actinobaculum massiliense) FC3和064空气罗氏菌(Rothia aeria) CCUG 25688]，最少仅2种[038肉桂色迪茨氏菌(Dietzia cinnamea) 117 RLT]。同一菌种不同菌株间注释出的核糖体蛋白质数量显示出一定程度的波动。以003口腔放线菌(Actinomyces oris)为例，4个分析菌株(CCUG 54866、Cory_54 IBS、BK495_10 ERL和BK03176_10 ERL)注释出的核糖体蛋白质数量分别为14、16、11和14。类似情况也在其他菌种中出现，一方面体现出菌株样本间核糖体蛋白质提取效率的差异，另一方面，同一菌种不同菌株的某(几)种核糖体蛋白质可能因个别氨基酸突变导致分子量变化而未成功注释。142个菌株中注释出至少10种核糖体蛋白质的菌株共计111个，占菌株总数的78.2%，注释出至少6种核糖体蛋白质的菌株共计134个，占菌株总数的94.4%，注释出少于6种核糖体蛋白质的菌株合计8个，占菌株总数的5.6%。
从142个菌株的MALDI-TOF MS图谱中总共注释出31种核糖体蛋白质，包括19种大亚基蛋白质和12种小亚基蛋白质，其信号在分析菌株中的出现次数差异显著(表 5)。低分子量(< 10 000 Da)核糖体蛋白质(L36、L35、L34、L33、L32、L31、L30、L29、L28、L27、L31-B、S20、S18和S14-Z)信号的出现次数高于高分子量(> 10 000 Da)核糖体蛋白质信号。L36是分子量最低的核糖体蛋白质，由37–40个氨基酸构成，分子量范围在4 280–4 710 Da。L36的信号在分析菌株中出现次数最高，为127次，且普遍呈现高丰度，其丰度在44个菌株的质谱峰中排第一，在85个菌株的质谱峰中排前三。总共15种核糖体蛋白质(L36、L29、L28、L32、L27、L30、L33、L34、S18、S14、S20、L35、L31、S15和S19)信号在超过半数菌株的图谱中出现，可通过这些质谱特征峰的组合表征各菌种。
表 5. 注释出的各种核糖体蛋白质信号的出现次数
Table 5. The number of mass peak annotations among different ribosomal proteins
| Ribosomal protein | Number of mass peak annotations | Ribosomal protein | Number of mass peak annotations | Ribosomal protein | Number of mass peak annotations |
| L36 | 127 | L35 | 90 | S13 | 13 |
| L29 | 118 | L31and L31-B | 83 | L19 | 8 |
| L28 | 115 | S15 | 81 | S6 | 6 |
| L32 | 112 | S19 | 80 | L22 | 4 |
| L27 | 111 | S17 | 50 | L18 | 4 |
| L30 | 109 | S12 | 47 | L25 | 1 |
| L33 | 108 | L24 | 45 | L14 | 1 |
| L34 | 106 | L21 | 25 | S11 | 1 |
| S18 | 106 | L7/L12 | 18 | S16 | 1 |
| S14 and S14-Z | 100 | L23 | 14 | ||
| S20 | 94 | S10 | 13 | ||
2.4 核糖体蛋白质在菌株水平的鉴别能力分析
为评估核糖体蛋白质在菌株水平的鉴别能力，本研究分析了部分菌种的多个菌株，发现大多数情况下核糖体蛋白质的质谱特征峰组合可以表征菌种甚至区分菌株。以057藤黄微球菌(Micrococcus luteus)为例(表 6)，8个分析菌株中序列完全一致的核糖体蛋白质有5种(L36、S18、L27、L23和S14)，它们可作为菌种鉴定的依据。其他核糖体蛋白质显示出不同程度的序列差异，其中分子量接近的核糖体蛋白质无法用于区分菌株，如L35无法区分AS2与其他菌株。分子量表现出一定差异的核糖体蛋白质可用于区分菌株，如L32、L31-B、L29和L24等。质谱注释同样支持这一观点，测试菌株M. luteus DSM 1790和同种8个参比菌株的核糖体蛋白质匹配度呈现显著差异，与FDAARGOS_677的匹配度最高，为18种核糖体蛋白质，和其他菌株的匹配度在7-14种核糖体蛋白质之间。此外，一些亲缘关系很近的菌株，各种核糖体蛋白质均呈现出序列一致性，无法基于核糖体蛋白质进行区分，如018白色拟诺卡菌(Nocardiopsis alba)、020黄铜色小单孢菌(Micromonospora chalcea)等，需要通过其他指标进行区分。
表 6. M.luteus核糖体蛋白质分子量标注及菌株DSM1790质谱的核糖体蛋白质信号注释
Table 6. The list of the masses predicted for 1 8 ribosomal proteins of 8 M. luteus strains and the annotation of ribosomal protein mass peaks in the mass spectrum of M. luteus DSM 1790
| M. luteus strain | L36 | L34 | L33 | L35 | L32 | L30 | L28 | S18 | L27 | S20 | L31-B | L29 | S15 | S19 | L23 | S14 | L24 | S12 |
| AS2(7) | 4 332.24 | 5 104.94 | 6 444.41 | 7 315.74 | 7 414.53 | 7 943.00 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 142.67 | 9 591.71 | 9 717.89 | 10 316.99 | 10 544.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 235.97 | 13 590.91 |
| SA211(11) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 384.50 | 8 106.23 | 8 447.87 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 142.67 | 9 618.78 | 9 729.99 | 10 316.99 | 10 544.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 192.00 | 13 548.83 |
| R17(12) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 384.50 | 8 106.23 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 142.67 | 9 618.78 | 9 729.99 | 10 316.99 | 10 544.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 192.00 | 13 548.83 |
| SB1254(13) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 414.53 | 8 096.20 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 170.68 | 9 599.74 | 9 776.02 | 10 288.89 | 10 528.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 192.00 | 13 548.83 |
| NCTC 2665(13) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 380.51 | 8 096.20 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 142.67 | 9 599.74 | 9 776.02 | 10 288.89 | 10 528.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 222.03 | 13 548.83 |
| NCTC 7563(14) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 414.53 | 8 106.23 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 140.65 | 9 599.74 | 9 745.99 | 10 288.89 | 10 528.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 192.00 | 13 548.83 |
| NCCP 16831 (14) | 4 332.24 | 5 177.99 | 6 428.41 | 7 315.70 | 7 384.50 | 8 106.23 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 168.70 | 9 618.78 | 9 729.99 | 10 302.96 | 10 544.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 22.03 | 13 548.83 |
| FDAARGOS_677(18) | 4 332.24 | 5 179.99 | 6 429.41 | 7 315.70 | 7 384.50 | 8 106.23 | 8 417.78 | 8 625.17 | 8 965.03 | 9 170.68 | 9 604.76 | 9 745.99 | 10 288.89 | 10 528.31 | 11 107.68 | 11 424.12 | 12 222.03 | 13 548.83 |
| DSM 1790 | 4 332.71 | 5 179.55 | 6 429.87 | 7 316.53 | 7 386.13 | 8 107.38 | 8 418.95 | 8 626.48 | 8 965.98 | 9 172.73 | 9 605.73 | 9 747.25 | 10 291.96 | 5 264.86 | 5 556.67 | 5 713.46 | 12 222.18 | 6 778.08 |
2.5 测试菌株的核糖体蛋白质鉴定
三个测试菌株MALDI-TOF MS指纹图谱的核糖体蛋白质信号注释结果见附表3。菌株D24的质谱中出现匹配参比菌株K. rhizosphaerae DSM 19711T全部15种目标核糖体蛋白质的15个特征峰(图 1A)，可据此鉴定菌株为K. rhizosphaerae，质谱法与16S rRNA基因序列比对法的结果一致。菌株3-5的质谱中出现匹配参比菌株L. jiangxiensis CGMCC 4.6609T核糖体蛋白质的7个特征峰(图 1B)，菌株4-12的质谱中出现匹配参比菌株R. aetherivorans PSBB011核糖体蛋白质的10个特征峰(图 1C)。参照对藤黄微球菌的分析，同一菌种不同菌株间至少应匹配7个核糖体蛋白质，因此这两个测试菌株均可能与参比菌株同种，但由于缺失了部分特征峰的信息，基于部分特征峰的匹配能否准确鉴定到种，需要将质谱图与同属更多参比菌种的核糖体蛋白质进行匹配和分析得出结论。
|
| 图 1 测试菌株根际动球菌K. rhizosphaerae D24 (A)、江西伦茨菌L. jiangxiensis 3-5 (B)和食醚红球菌R. aetherivorans 4-12 (C)的MALDI-TOF MS图谱 Figure 1 MALDI-TOF mass spectra of K. rhizosphaerae D24 (A), L. jiangxiensis 3-5 (B) and R. aetherivorans 4-12 (C). The annotated ribosomal protein mass peaks annotated are labeled in red. |
3 讨论
本研究所用的质谱注释方法依赖于MALDI-TOF MS图谱数据库以及基因组数据库的信息，菌种名称以及从基因组提取的核糖体蛋白质序列准确度都影响注释结果。本研究中2个菌株[008 Varibaculum cambriense 110324_100 PNU和015疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) DSM 40611] 均注释出3种核糖体蛋白质信号，与同科或同属其他分析菌株差异显著，注释结果可信度低，不排除菌种名称错误的可能。此外，质谱仪分辨率的局限性也影响注释结果。菌株蛋白质组中蛋白数量繁多，难免出现m/z接近的分子离子，以MALDI-TOF MS线性模式下的分辨率无法做到基线分离，因此，质谱中的一个m/z可能匹配不止一种蛋白质。一种情况是两种核糖体蛋白质m/z接近，若同时存在两种蛋白质信号，注释准确；若只存在一种蛋白质信号，会造成过多注释。另一种情况是一种核糖体蛋白质和一种非核糖体蛋白质m/z接近，若两种蛋白质信号同时存在，不影响注释结果；若只有非核糖体蛋白质存在，会导致错误注释。因此，对于出现次数低的核糖体蛋白质信号，如L22、L18、S16、S11、L25和L14，存在错误注释的可能。对于出现次数高的或者多个类群中都注释出的核糖体蛋白质信号，注释结果可信度高。
质谱注释表明放线菌纲细菌MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号一般不超过质谱峰的半数。除了核糖体蛋白质的单电荷和双电荷峰，还有一些质谱峰未注释。推测原因如下，第一，基因注释的精确度有限，一些开放读码框架(ORF)无法确定功能，第二，一些蛋白质的翻译后修饰未知，无法准确预测分子量，第三，蛋白质在提取过程中发生降解，蛋白质降解产物的m/z无法确知。核糖体蛋白质的翻译后加工、修饰相对简单，掌握其规律可以基于序列准确预测分子质量，而测试菌株D24的质谱注释结果也验证了本研究所用分子量计算方法的准确性。
本研究中3个测试菌株与其参比菌株的核糖体蛋白质匹配数量呈现出一定差异，主要是测试菌株与其参比菌株的亲缘关系远近差异所致。以前文中分析的藤黄微球菌为例，参比菌株为FDAARGOS_677时，测试菌株DSM 1790可匹配18种核糖体蛋白质，参比菌株为AS2时，测试菌株可匹配7种核糖体蛋白质，参比菌株为其他菌株时，匹配数为7–18。由于NCBI基因组数据库中很多菌种只有一个菌株的全基因组测序信息，无法获取更多参比菌株，因而测试菌株匹配参比菌株的核糖体蛋白质少于15种的情况将很常见。这种情况下测试样本的质谱中是否产生足够数量种水平的核糖体蛋白质特征峰将至关重要，这就需要对目标属的更多菌种进行比较和分析找出种水平的核糖体蛋白质特征峰，结合核糖体蛋白质的匹配数和种水平的特征峰得出鉴定结果。
MALDI Biotyper数据库收录的放线菌纲菌种以致病菌为主，对一些环境中常见的类群，尤其是具有抗生素等活性物质合成能力的链霉菌目、小单孢菌目、假诺卡氏菌目、链孢囊菌目等的属、种收集的指纹图谱较少，限制了MALDI-TOF MS方法在环境放线菌鉴定中的应用。迄今已提交全基因组序列的放线菌纲菌种多样、来源广泛，开发不依赖图谱数据库的、识别核糖体蛋白质质谱特征峰的鉴定方法可扩展MALDI-TOF MS鉴定方法的应用范围。相比自建库标准方法，该方法构建数据库只要获得参比菌株的基因组信息即可，无需收集大量菌株和采集质谱图，具有简单快速、成本低廉、可公开等优势，易于推广普及，因而具有广阔的应用前景。本研究找到15种核糖体蛋白质标志物并对3个菌株进行了初步测试分析，可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。
4 结论本研究利用基因组学技术注释放线菌纲细菌MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号，找到15种核糖体蛋白质标志物，可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。
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